CN107338255B

CN107338255B - Pinnate pentafoliata2基因在调控豆科植物小叶数量中的应用

Info

Publication number: CN107338255B
Application number: CN201710671887.0A
Authority: CN
Inventors: 周传恩; 卢志超; 韩璐
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2037-08-08
Also published as: CN107338255A

Abstract

本发明公开了PINNATE PENTAFOLIATA2基因(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)在调控豆科植物小叶数量中的应用。本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2基因的敲除突变体株系，发现植株的小叶片数目由三个变为五个，少数为四个。获得的植株中多达97％的叶片的小叶片数量提高，这一数据远高于目前现有的多叶苜蓿品种。这证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶数量，敲除该基因，可以得到小叶数量高于野生型植株的转基因豆科植物，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质，对我国草业生产具有重大意义。

Description

PINNATE PENTAFOLIATA2基因在调控豆科植物小叶数量中的应用

技术领域

本发明涉及PINNATE PENTAFOLIATA2基因在调控豆科植物小叶数量中的应用，尤其涉及敲除PINNATE PENTAFOLIATA2基因在提高豆科植物小叶数量中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

豆科牧草苜蓿是世界上栽培最早，分布最广，也是最为重要的一种多年生优质牧草。但是，国产苜蓿产量少、品质差、货源不稳定，这已成为限制我国草食畜牧业和奶业发展的一个不可忽视的因素。目前我国苜蓿的商业生产正在迅速增长，但由于国内对高质量苜蓿日益增长的巨大需求，国产苜蓿的短缺情况并没有得到缓解。因此苜蓿的产量和品质改良是我国草业、畜牧业和奶业发展的重大迫切需求。

苜蓿是以收获叶、茎为主的牧草，叶对苜蓿产草量的贡献率最多可达60％。叶片不仅是苜蓿生长发育、产量构成和品种特性的重要指标，更是栽培管理及病虫害监测的主要研究对象。在苜蓿品质评价体系中，叶茎比(叶片与茎秆重量的比值)是其中一个重要的指标。苜蓿70％的蛋白质储藏于叶片中，而且叶片纤维含量仅为茎秆的1/3。因此叶茎比值越大，苜蓿的营养价值就越高，适口性就越好，同时利用价值也就相对越高。苜蓿多叶性状目前已被作为一种形态学标记，被认为具有高产和优质的潜力。选育叶量丰富、叶茎比高的苜蓿新品种一直是育种工作者追求的目标。

植物的叶发育模式分为单叶和复叶。单叶结构指得是在一个叶柄上只有一个小叶片，而复叶结构指得是在一个叶柄上有多个小叶片生成。蒺藜苜蓿的叶为复叶结构，包括三个小叶片。苜蓿的多叶性状是由多基因控制的，其产生是一个复杂的过程而且同时受环境和基因两方面的影响。到目前为止，只有少数多叶苜蓿品种被商业化。这些品种中大部分植株具有多叶性状，但植株个体多叶频率高低不均：有的植株仅数个复叶为多叶型，多数复叶仍为三出复叶；也有植株不同枝条上混杂出现多叶型复叶和三出复叶，而多叶频率高的植株则非常少见。这些缺陷导致现有的多叶型苜蓿品种在生产性能方面并未表现出明显优势。

因此，基于以上原因，对苜蓿复叶发育分子机制进行研究，通过基因工程直接提高苜蓿小叶片数量可为苜蓿优质新品系的分子设计改良和育种提供理论基础和技术手段，有助于高效、优质、高产的苜蓿新品种的培育。

BEL1-LIKE基因家族在叶片发育过程中起关键作用。目前尚未见到有关于BEL1-LIKE基因家族在复叶物种中调控小叶片数目的报道。

发明内容

针对上述现有技术，针对现有多叶苜蓿品种多叶频率不高的不足，本发明发现了一种调控豆科植物小叶数量的基因，并提供了一种敲除该基因以获得可提高小叶片数量的转基因豆科植物的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

PINNATE PENTAFOLIATA2基因在调控豆科植物小叶数量中的应用。

本发明首次分离得到了蒺藜苜蓿BEL1-LIKE基因家族成员PINNATEPENTAFOLIATA2(PPF2)基因的敲除突变体株系，并通过实验证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶数量，并可通过敲除该基因的方式以得到小叶数量高于野生型植株的转基因豆科植物。

所述PINNATE PENTAFOLIATA2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述豆科植物，优选苜蓿、蒺藜苜蓿、三叶草。

本发明利用特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆PINNATEPENTAFOLIATA2基因；利用构建的突变体群体，筛选出PINNATE PENTAFOLIATA2基因的敲除突变体株系，发现植株的小叶片数量由三个变为五个，少数为四个。获得的植株中多达97％的叶片的小叶片数量提高，这一数据远高于目前现有的多叶苜蓿品种(约40％)。这证明，该基因参与了调控豆科植物的小叶数量，敲除该基因，可以得到小叶数量高于野生型植株的转基因豆科植物，可显著提高小叶数量，预示本发明实施后将会创造新型豆科牧草植物，可用于后续的牧草品质，对我国草业生产具有重大意义。

附图说明

图1：蒺藜苜蓿PINNATEPENTAFOLIATA2(PPF2)基因的克隆和突变体的鉴定，其中，A：PINNATE PENTAFOLIATA2的基因结构及突变体中Tnt1转座子的插入位置；B：野生型和突变体的PINNATE PENTAFOLIATA2基因RT-PCR结果。PINNATE PENTAFOLIATA2三个Tnt1插入突变体全部插入在外显子区域。RT-PCR方法鉴定PINNATE PENTAFOLIATA2(PPF2)的三个突变体，表明PINNATE PENTAFOLIATA2基因在突变体中的转录被终止。

图2：蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2基因突变体的表型分析，其中，A：野生型的三个小叶的复叶结构；B：突变体的五个小叶的复叶结构；C：野生型和突变体中小叶数目的比较。蒺藜苜蓿的野生型复叶结构包括三个小叶，PINNATE PENTAFOLIATA2基因突变体植株的小叶数量由三个变为五个，少数为四个。这说明PINNATE PENTAFOLIATA2基因突变体植株的小叶数目明显增多，PINNATE PENTAFOLIATA2基因敲除之后明显提高了小叶数目。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1克隆蒺藜苜蓿基因PINNATE PENTAFOLIATA2

1.蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2基因的克隆

通过生物信息学网站NCBI获得拟南芥PINNATE PENTAFOLIATA2的序列，然后利用BLAST进行序列比对搜索，获得PINNATE PENTAFOLIATA2的基因组序列(如SEQ ID No.1所示)，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。根据序列设计SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示的引物。利用TRIzol试剂盒提取蒺藜苜蓿RNA，RT-PCR方法扩增PINNATEPENTAFOLIATA2基因的全长CDS序列。利用Gateway技术将基因序列连入pEARLEYGATE201载体，然后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。

实施例2蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2突变体的获得和鉴定

利用Thermal asymmetric interlaced-PCR(TAIL-PCR)技术，筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，在22000个突变体株系中筛选出Tnt1插入到PINNATEPENTAFOLIATA2基因中的三个突变体株系(图1A)。分子生物学鉴定结果表明，在三个突变体株系中，Tnt1分别插入到PINNATE PENTAFOLIATA2基因的第一个外显子和第三个外显子，导致该基因表达被终止(图1B)。

实施例3蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2基因突变体植株的表型分析

对蒺藜苜蓿PINNATE PENTAFOLIATA2基因突变体植株的表型进行分析，结果表明，敲除PINNATE PENTAFOLIATA2基因可以显著增加小叶数目。野生型的复叶中包括三个小叶，而突变体植株中约97％的复叶中包含有4个或5个小叶片，其中84％约为5片小叶(图2A-B，2C)。

序列表

<110> 山东大学

<120> PINNATE PENTAFOLIATA2 基因在调控豆科植物小叶数量中的应用

<141> 2017-08-08

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1957

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 1

atgatgtcaa actccatgac ccatcaaaat caatttgaga accaagaact actaggtggt 60

ggttatgttt catcttcttt gagaaacaac aatgcatatc atgaatcact tggaacattt 120

tctaacaata ttgggctagc acaaggttct gagatgagtc acacaagaca tttgatggat 180

ctacttggtg cagcaaacga gaataatcac cagacacaac aaggcctatc cctttcttta 240

ggctctcaca tgcttgttga tgaatacaga aaccgttcct taaatcaagg tcttatgatc 300

aatccaagtt acttcatgcc tggtcaagat cagacacgtg agccttgtaa tcaacctgtg 360

gtggagaatc taacaagtga ttattttttc agtggtggaa gtggaacttt tgcttcaggt 420

tctaataata ataactcatt attattgaac cgttctactt ctacttctta tggaagtgag 480

agttttggtt ccgttattgg gaactctaga taccttaaac cagtacagtc acttcttgaa 540

gatcttgttg atgttggtgg aaatgtgatt gatagaatga atgaaaaata tgctgagaag 600

ttgtttcatg ggagtagaac aggtgctaga acactctcct ctgagctcaa agcagagttg 660

aggattcatg gacatttatt ggctgacaaa catgaacatc aagtcaaaat tgcaaagctc 720

atttcattgt tggatgaggt tggttggtct tctcttcctg attttatgtt cactagtact 780

aataaagaaa attgcatcat acttgagtag tattcgaatt aagtgctaga gtttatcaaa 840

taagtgttta tgtataaatt atttttaaaa caaaaatcaa attgttttgg tatgaactat 900

ataaatgttt tcataagcta tctttgagaa tttatagaca tggtataagc tatttctatc 960

aaatggttgt gcttaatttt caggttgagg gtagatatga gaagtactac catcaaatgg 1020

aagaagtagt atcatctttt gaaatgatag caggtttggg agctgcaaag tgttacactg 1080

ctctggcact tcaagcaatg tctaggcatt tttgtagctt aagagatgcc ataatgtccc 1140

aaataaatgc tgagaaaaga aaactgtttc aggatgtacc taaaattaat agtggattgt 1200

ctcaactgag cttatttgag agagataata atagacagac tagaatgtct ctccaacaac 1260

ttggagtcat tcaaaaccaa cgacaagttt ggagacctat tagagggtta cctgaaacat 1320

ctgtagcaat tcttcgtgct tggctctttg agcactttct tcatccgtaa gcttatatca 1380

aaattctgtt tttgttttta tgttatgtca ttttcttgtc ttattaatga aatgctaatt 1440

tgatgtctga tttttgcagc tatcctaatg attctgagaa gttaatcctg gcttcccaaa 1500

caggtttaac caaaaaccaa gtaattcctt atccaaaaac tacccctttc ctttttttct 1560

aatgatatgt taatttagcc tcttaagcat ttattatagt agtagagact aaggcgacaa 1620

atttctttca ctttttcttt tatgggtagg aatcgagtta gggtctcaaa tttacaacaa 1680

tcacatatag tgcacgtcga taaattccga caaaataaaa cacttcaaac attaacttga 1740

gtgttttttt tttttttcaa agttatttat gatggtcatg ttgttgatgt atggagtgtt 1800

ggttcaggtg tcaaactggt tcattaatgc aagggtacgg ctatggaaac caatgataga 1860

agaaatgtac aaagaagagt ttggagactc ttcggaagac tccaacccac cagctaacaa 1920

ttttatgtca agggaagatg tcactgtgga ggattag 1957

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 2

Met Met Ser Asn Ser Met Thr His Gln Asn Gln Phe Glu Asn Gln Glu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Gly Gly Tyr Val Ser Ser Ser Leu Arg Asn Asn Asn Ala

20 25 30

Tyr His Glu Ser Leu Gly Thr Phe Ser Asn Asn Ile Gly Leu Ala Gln

35 40 45

Gly Ser Glu Met Ser His Thr Arg His Leu Met Asp Leu Leu Gly Ala

50 55 60

Ala Asn Glu Asn Asn His Gln Thr Gln Gln Gly Leu Ser Leu Ser Leu

65 70 75 80

Gly Ser His Met Leu Val Asp Glu Tyr Arg Asn Arg Ser Leu Asn Gln

85 90 95

Gly Leu Met Ile Asn Pro Ser Tyr Phe Met Pro Gly Gln Asp Gln Thr

100 105 110

Arg Glu Pro Cys Asn Gln Pro Val Val Glu Asn Leu Thr Ser Asp Tyr

115 120 125

Phe Phe Ser Gly Gly Ser Gly Thr Phe Ala Ser Gly Ser Asn Asn Asn

130 135 140

Asn Ser Leu Leu Leu Asn Arg Ser Thr Ser Thr Ser Tyr Gly Ser Glu

145 150 155 160

Ser Phe Gly Ser Val Ile Gly Asn Ser Arg Tyr Leu Lys Pro Val Gln

165 170 175

Ser Leu Leu Glu Asp Leu Val Asp Val Gly Gly Asn Val Ile Asp Arg

180 185 190

Met Asn Glu Lys Tyr Ala Glu Lys Leu Phe His Gly Ser Arg Thr Gly

195 200 205

Ala Arg Thr Leu Ser Ser Glu Leu Lys Ala Glu Leu Arg Ile His Gly

210 215 220

His Leu Leu Ala Asp Lys His Glu His Gln Val Lys Ile Ala Lys Leu

225 230 235 240

Ile Ser Leu Leu Asp Glu Val Glu Gly Arg Tyr Glu Lys Tyr Tyr His

245 250 255

Gln Met Glu Glu Val Val Ser Ser Phe Glu Met Ile Ala Gly Leu Gly

260 265 270

Ala Ala Lys Cys Tyr Thr Ala Leu Ala Leu Gln Ala Met Ser Arg His

275 280 285

Phe Cys Ser Leu Arg Asp Ala Ile Met Ser Gln Ile Asn Ala Glu Lys

290 295 300

Arg Lys Leu Phe Gln Asp Val Pro Lys Ile Asn Ser Gly Leu Ser Gln

305 310 315 320

Leu Ser Leu Phe Glu Arg Asp Asn Asn Arg Gln Thr Arg Met Ser Leu

325 330 335

Gln Gln Leu Gly Val Ile Gln Asn Gln Arg Gln Val Trp Arg Pro Ile

340 345 350

Arg Gly Leu Pro Glu Thr Ser Val Ala Ile Leu Arg Ala Trp Leu Phe

355 360 365

Glu His Phe Leu His Pro Tyr Pro Asn Asp Ser Glu Lys Leu Ile Leu

370 375 380

Ala Ser Gln Thr Gly Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Asn Trp Phe Ile

385 390 395 400

Asn Ala Arg Val Arg Leu Trp Lys Pro Met Ile Glu Glu Met Tyr Lys

405 410 415

Glu Glu Phe Gly Asp Ser Ser Glu Asp Ser Asn Pro Pro Ala Asn Asn

420 425 430

Phe Met Ser Arg Glu Asp Val Thr Val Glu Asp

435 440

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgatgtcaa actccatgac ccat 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctaatcctcc acagtgacat cttc 24

Claims

1.PINNATE PENTAFOLIATA2基因在调控豆科植物小叶数量中的应用，所述PINNATE PENTAFOLIATA2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

所述豆科植物选自苜蓿；

敲除PINNATE PENTAFOLIATA2基因以提高豆科植物小叶数量，使97%的叶片的小叶片数量增加。

2.PINNATE PENTAFOLIATA2基因在制备转基因豆科植物中的应用，所述PINNATE PENTAFOLIATA2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；

所述豆科植物选自苜蓿；

具体应用时，敲除豆科植物种子或植株中的PINNATE PENTAFOLIATA2基因，从而获得转基因豆科植物，其小叶数量高于野生型豆科植物，使97%的叶片的小叶片数量增加。

3.一种通过敲除PINNATE PENTAFOLIATA2基因获得转基因豆科植物的方法，其特征在于：敲除豆科植物种子或植株中的PINNATE PENTAFOLIATA2基因，从而获得转基因豆科植物，其小叶数量高于野生型豆科植物，使97%的叶片的小叶片数量增加；

所述豆科植物选自苜蓿。