CN103710379A - GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用。本发明提供了如下1）-3）中任一种物质在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用：1）蛋白GmBRI1；2）编码蛋白GmBRI1的DNA分子；3）含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株能够从极端矮化的形态回复到野生型拟南芥植株的形态，并出现多种介于极端矮化和正常株高之间的半矮杆形态，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株的株高高于突变体bri1-5。这说明GmBRI1是有功能的油菜素内酯受体蛋白，GmBRI1蛋白及其编码基因可用于调节植物株高。

Description

GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用。

背景技术

随着人口的快速增长，全世界的粮食安全面临严峻挑战。因此，高产一直作为作物育种的首要目标。而高产和倒伏的矛盾制约着作物产量的进一步提高。二十世纪六十年代的“绿色革命”使世界粮食总产在短时间内大幅度提高，这有赖于小麦、水稻半矮秆新品种的推广应用。这种半矮秆品种因植株高度大大降低而表现出抗倒伏能力强、产量潜力大等显著特点，可以进行高密度种植而获得高产。之后的研究发现，这种半矮秆株型是由于植物激素赤霉素的合成或信号途径改变导致的。“绿色革命”的启示是：要使作物产量再次大幅度提高，必须对产量赖以形成的植物总体的生长发育状况进行重大调控。自此，更多研究开始关注这类控制或影响植物生长发育和产量形成的物质——植物激素。在众多激素中，油菜素内酯备受关注，因大量证据表明，对油菜素内酯合成和信号途径成分的调控可以构建半矮秆株型,从而提高植株的抗倒伏性，提高产量。

油菜素内酯（Brassinosteroids,BRs）又称芸苔素内酯或芸苔素，是一种甾体化合物，对植物生长发育有多方面的调节作用，如促进细胞伸长与分裂，暗形态发生，光形态建成，木质部分化，种子萌发和提高抗逆性等。被称为“第六大植物生长激素”。在BR信号转导途径中，油菜素内酯受体蛋白发挥了重大作用，它定位在细胞膜上，一方面感受和结合细胞外的油菜素内酯信号，另一方面在膜内通过一系列的磷酸化和去磷酸化反应激活下游转录因子BZR1/BES1，BZR1/BES1进入细胞核与DNA结合，调控BR响应基因的表达。近年来对油菜素内酯受体蛋白的研究发现，通过分子手段，对油菜素内酯受体蛋白基因brassinosteroid insensitive1(BRI1)进行遗传操作，能够调控植物的形态建成，获得株型适中且产量不受影响的植株，具有巨大的高产潜力。

大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。而倒伏问题一直是困扰大豆高产稳产的主要问题之一。倒伏使大豆平均减产56.1%，当倒伏发生在开花或结荚期时减产率会更高。以往育种者通过常规育种手段改良和调节株型，增强作物的抗倒伏性，挖掘高产潜能。近年来,随着生物技术的发展，可以通过分子手段,调控株型性状相关基因如BRI基因的表达，设计和改造作物株型，为培育高产大豆品种创造条件。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1）-3）中任一种物质的应用。

本发明提供如下1）-3）中任一种物质的在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用：

1）蛋白GmBRI1；

2）编码蛋白GmBRI1的DNA分子；

3）含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。

上述应用中，所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子替换掉表达载体pTF101.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。

在本发明的实施例中，重组载体为将序列表中序列1所示的编码蛋白GmBRI1的DNA分子替取代表达载体pTF101.1-GFP的XbalI和Kpn I酶切位点间的片段（GFP）得到的重组载体。

载体pTF101.1-GFP按照如下方法制备：将GFP表达盒（其核苷酸序列如序列表中序列15所示）插入载体pTF101.1的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的载体。

上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥。

上述应用中，所述调控植物株高为提高植物株高，植物为拟南芥突变体bri1-5。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为将编码蛋白GmBRI1的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述目的植物；

所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。

上述方法中，所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子通过重组载体导入目的植物；

所述重组载体为将所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子替换掉表达载体pTF101.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。

在本发明的实施例中，重组载体为将序列表中序列1所示的编码蛋白GmBRI1的DNA分子替取代表达载体pTF101.1-GFP的Xba lI和Kpn I酶切位点间的片段（GFP）得到的重组载体。

载体pTF101.1-GFP按照如下方法制备：将GFP表达盒（其核苷酸序列如序列表中序列15所示）插入载体pTF101.1的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的载体。

上述方法中，所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

上述方法中，所述双子叶植物为拟南芥突变体bri1-5。

本发明的实验证明，本发明构建了GmBRI1的过表达载体，并将其转入拟南芥油菜素内酯受体缺失突变体bri1-5植株中，实验证明，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株能够从极端矮化的形态回复到野生型拟南芥植株的形态，并出现多种介于极端矮化和正常株高之间的半矮杆形态，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株的株高高于突变体bri1-5。这说明GmBRI1是有功能的油菜素内酯受体蛋白，GmBRI1蛋白及其编码基因可用于调节植物株高。

附图说明

图1为GmBRI1的cDNA的PCR扩增产物电泳图谱

图2为GmBRI1在大豆不同组织中的表达

图3为重组载体pTF101.1-GmBRI1的质粒图谱

图4为T₃代转基因拟南芥植株中目基因的PCR产物电泳结果

图5为T₃代转基因拟南芥植株的表型鉴定结果

图6为T₃代转基因拟南芥植株的株高分析结果

图7为T₃代转基因拟南芥植株中目的基因半定量RT-PCR产物电泳结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京华大公司完成。

实施例1、蛋白GmBRI1及其编码基因在调节植物株高中的应用

一、蛋白GmBRI1及其编码基因的获得

1、蛋白GmBRI1及其编码基因GmBRI1的获得

用拟南芥油菜素内酯受体蛋白AtBRI1（基因库序列号：AAC49810）的氨基酸序列在大豆序列数据库中比对，找到同源性较高的蛋白质及其对应的核苷酸序列。发现GmBRI1（Glyma06g15270）是AtBRI1的同源基因，且与拟南芥AtBRI1基因一样，没有内含子。

提取大豆Williams82（Haun,W.J.,Hyten,D.L.,Xu,W.W.,Gerhardt,D.J.,Albert,T.J.,Richmond,T.,Jeddeloh,J.A.,Jia,G.F.,Springer,N.M.,Vance,C.P.&Stupar,R.M.(2011).The Composition and Origins ofGenomic Variation among Individuals of the Soybean Reference Cultivar Williams82.Plant Physiology155,645-655.国家种质库编号：I2A12645，统一编号：WDD00587，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。）的基因组DNA，用引物P1（其核苷酸序列为序列表中的序列3）和P2（其核苷酸序列为序列表中的序列4）进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件：先94℃预变性2min；然后94℃30sec，55℃30sec，65℃3min20sec，33个循环；再65℃延伸10min，16℃保存。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中，Marker为Direct-load^TMStar Marker Plus(D2000Plus)(M121)的DNA分子量标准，1、2和3为PCR产物，4为以水为模板的空白对照，可以看到，得到3632bp的目的片段。

切下目的条带，纯化回收后按照Takara公司的pMD18-T载体试剂盒说明书将PCR产物连接到pMD18-T载体上，挑取阳性单克隆提取质粒进行测序。

测序结果表明，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，为GmBRI1，该基因编码的蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。

核苷酸序列比对结果表明，GmBRI1与拟南芥油菜素内酯受体蛋白AtBRI1的同源性为69%。

含有该PCR产物的质粒为pMD18-T-GmBRI1，该质粒为将序列表中序列1所示的DNA分子插入pMD18-T载体中得到的质粒。

2、GmBRI1在大豆不同组织中的表达情况

选择Williams82为实验材料，种植在12h光照和12h黑暗的条件下。当大豆幼苗的真叶展开时（出苗后7天），对大豆幼苗的根，下胚轴和子叶进行取样；当大豆植株有三片复叶完全展开时（出苗后20天），对大豆植株的叶片，幼茎和茎尖进行取样；当大豆进入开花期，对大豆的花朵进行取样；当大豆出现5mm-20mm的荚时，对豆荚进行取样。分别提取上述不同组织中的总RNA，反转录为cDNA，以P15和P16（其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10所示）为引物，进行Real-time RT-PCR，检测GmBRI1在大豆不同组织中的相对表达量（以表达量最低点的表达量的数值为1，其余时间点的表达量均和最低点的表达量相比较，得出不同时间点的相对表达量），以GmELF为内标基因,引物为P3（其核苷酸序列如序列表中序列11所示）和P4（其核苷酸序列如序列表中序列12所示）。

结果如图2所示，在全部的取样组织中，GmBRI1基因的表达量在下胚轴中最高，其次是子叶中；其他组织中GmBRI1也有表达，但表达量很低；豆荚中GmBRI1的表达量最低。研究表明，多数油菜素内酯受体蛋白基因在生长发育旺盛的组织，尤其是进行活跃的细胞伸长和维管束形成的组织中都有很高的表达量。这与油菜素内酯参与调节植物的细胞伸长和木质部形成有关。下胚轴正是此类组织。因此，GmBRI1基因在下胚轴中的高表达符合其油菜素内酯受体蛋白的特性，并预示其在茎杆伸长和维管束发育中的重要作用。

二、转GmBRI1拟南芥的获得

1、构建含有GmBRI1的重组载体

以上述已构建的含有GmBRI1编码基因的载体pMD18-T-GmBRI1为模板，用含有Xbal I和Kpn I酶切位点的引物P11（其核苷酸序列如序列表中序列5）和P12（其核苷酸序列如序列6所示）进行扩增。

得到3649bp的PCR产物。

将3649bp的PCR产物用Xba lI和Kpn I双酶切，回收3642bp的酶切产物，将该酶切产物与经过同样双酶切的pTF101.1-GFP的10271bp的片段连接，将连接产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50mg/L壮观霉素的LB培养基上筛选出阳性克隆。

提取阳性克隆的质粒DNA作为模板，以P11和P12为引物进行PCR鉴定，得到3649bp的PCR产物的为阳性质粒，该阳性质粒为将序列表中序列1所示的DNA分子（GmBRI1基因）取代掉载体pTF101.1-GFP的Xbal I和Kpn I酶切位点间的片段（GFP），得到的重组载体，命名为pTF101.1-GmBRI1，其质粒图谱如图3所示，该重组载体中GmBRI1基因利用35S启动子和NOS终止子进行表达。

载体pTF101.1-GFP按照如下方法制备：将GFP表达盒（其核苷酸序列如序列表中序列15所示）插入载体pTF101.1的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的载体。

序列15所示的GFP表达盒，其中，序列15自5’末端第25-859位核苷酸为35S启动子、第880-1596位核苷酸为GFP基因、第1640-1894位核苷酸为NOS终止子。

2、转GmBRI1拟南芥的培育

取1μg上述步骤1制备的pTF101.1-GmBRI1转化根癌农杆菌Gv3101（购自天根生化科技有限公司）感受态细胞，28℃条件下于LB培养基（含壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L，氯霉素25mg/L，利福平20mg/L）上培养两天。挑选阳性克隆，以P11和P12为引物做菌液PCR鉴定，结果扩增出大小约为3649bp的目标条带的为阳性重组菌，命名为Gv3101/pTF101.1-GmBRI1。

将Gv3101/pTF101.1-GmBRI1接种于LB培养基上（含壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L，氯霉素25mg/L，利福平20mg/L），28℃条件下250rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，收集菌液置于离心管中，5000rpm离心5min并收集菌体，用MS液体培养基悬浮收集的菌体，使悬浮后菌液的OD₆₀₀值约为0.6，最后加入Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸公司，SL77080596）。

采用沾花浸染法转化拟南芥油菜素内酯受体缺失突变体bri1-5（文献出处：Noguchi,T.,Fujioka,S.,Choe,S.,Takatsuto,S.,Yoshida,S.,Yuan,H.,Feldmann,K.A.&Tax,F.E.(1999).Brassinosteroid-insensitive dwarf mutantsof Arabidopsis accumulate brassinosteroids.Plant Physiol121,743-52.公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，突变体bri1-5为仅将野生型拟南芥Ws2的基因AtBRI1（AAC49810）缺失得到，其他基因与野生型拟南芥的一样）收获T₁代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的种子。在含Bastar（购自日本明治公司）的MS培养基筛选上述种子，Bastar在MS培养基中的浓度为10mg/L。将在上述培养基上成活的T₁代幼苗移到培养土中，收获种子（T₂代），然后经相同的筛选过程得到纯合的T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥种子。最后将T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥植株。

3、转基因拟南芥的分子检测

（1）PCR检测目的基因

以上述T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥植株的基因组DNA为模板，以P13和P14（其核苷酸序列如序列表中序列7和序列8所示）为引物，进行PCR反应，PCR反应体系如下：

PCR反应条件：先94℃预变性5min；然后94℃30sec，55℃，30sec，72℃50sec，33个循环；再72℃延伸10min，16℃保存。

对上述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。以野生型拟南芥Ws2（TAIR stocknumber：CS28828）和油菜素内酯受体缺失突变体拟南芥bri1-5为对照。

结果如图4所示，其中，M为Direct-load^TMStar Marker Plus(D2000Plus)(M121)的DNA分子量标准，1为野生型拟南芥Ws2，2为油菜素内酯受体缺失突变体拟南芥bri1-5，3-5为T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥植株，6为以水为模板的阴性对照，结果表明在T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥植株中有大小约为500bp的目的基因条带，而野生型Ws2和油菜素内酯受体缺失突变体bri1-5中均未出现条带。

三、转GmBRI1的bri1-5拟南芥的检测

1、表型检测

将T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的三个株系Line1、Line6和Line9、野生型拟南芥Ws2（WT）和突变体bri1-5的种子分别种植在温度为22℃、光周期为16h光照和8h黑暗的长日照人工气候室中，每组20株，分别统计拟南芥的株高，并用半定量RT-PCR方法检测GmBRI1基因的表达。

实验重复三次，结果取平均值。

T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的表型如图5所示，bri1-5形态为极端矮小，叶片小而圆，花序节间缩短，与野生型拟南芥Ws2明显不同。而T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的表型与Ws2野生型拟南芥是一致的。

各组株高统计的结果如图6所示，

野生型拟南芥Ws2的株高为19.6cm±1.84cm（mean±SD）；

突变体bri1-5的株高为3.65cm±0.75cm（mean±SD）；

T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的Line1的株高为18.75cm±1.51cm（mean±SD）；

T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的Line6的株高为17.05cm±1.01cm（mean±SD）；

T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的Line9的株高为15.25cm±1.03cm（mean±SD）。

T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的株高均明显高于油菜素内酯受体缺失突变体bri1-5，且又恢复与野生型拟南芥Ws2的株高基本一致。

这说明GmBRI1基因能恢复拟南芥油菜素内酯受体缺失突变体的表型，证明克隆的GmBRI1是一个有功能的基因，且此基因与植物株型建成有关。

2、GmBRI1的RT-PCR检测

提取T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的三个株系Line1、Line6和Line9，以及野生型拟南芥Ws2和突变体bri1-5的总RNA，经反转录后得到cDNA，以此cDNA为模板，以P15和P16（其核苷酸序列如序列表中序列9和序列10所示）为引物，以拟南芥的ACTIN基因为内标基因，引物为P5（其核苷酸序列如序列表中序列13所示）和P6（其核苷酸序列如序列表中序列14所示），检测GmBRI1在拟南芥中的表达。

检测结果如图7所示。其中，WT为Ws2野生型拟南芥，bri1-5为油菜素内酯受体缺失突变体，Line1、Line6和Line9为T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥的三个株系。RT-PCR的结果显示，GmBRI1在野生型拟南芥和bri1-5中不表达，而在T₃代转GmBRI1的bri1-5拟南芥中强表达。且T₃代转基因拟南芥的三个株系表达量存在差异。

结合三个株系的株高统计结果可以看出，T₃代转基因拟南芥的株高和GmBRI1的表达量呈正相关。这表明，在油菜素内酯受体缺失背景下，可以通过控制GmBRI1基因的表达调控株高，获得株型理想的半矮杆植株。

Claims (9)

1.如下1）-3）中任一种物质在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用：

1）蛋白GmBRI1；

2）编码蛋白GmBRI1的DNA分子；

3）含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1；

所述含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子替换掉表达载体pTF101.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。

5.一种培育转基因植物的方法，为将编码蛋白GmBRI1的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述目的植物；

所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子通过重组载体导入目的植物；

所述重组载体为将所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子替换掉表达载体pTF101.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述编码蛋白GmBRI1的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列1。

8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥突变体bri1-5。

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