CN103266093A - 水稻油菜素内酯受体激酶类似蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个水稻油菜素内酯受体激酶类似蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物抗病相关蛋白是具有下述氨基酸序列残基序列之一的蛋白质：1)序列表中SEQ ID No1的序列；2)将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。本发明的蛋白在携带非寄主抗性基因植物中经病原菌接种后诱导上调表达，提高植物抗病性。

Description

水稻油菜素内酯受体激酶类似蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一个来源于水稻的油菜素内酯(Brassinosteroids，BRs)受体激酶类似蛋白(BRI1-associated kinasc1，Bak1)及其编码基因与其在提高植物抗病性中的应用。

背景技术

病害是农作物高产和稳产的重要限制性因素之一。培育和种植抗病品种是防治植物病害经济有效的措施之一。植物抗病基因包括寄主抗病基因和非寄主抗病基因两大类。目前育种过程中主要利用的是寄主植物由单一抗病基因控制的质量抗性，其原因是这类基因可以对特定的病原菌产生典型的抗病反应，并且单个基因易于利用。但是，对于某些重要的植物病害，如水稻细菌性条斑病，在寄主植物中尚未发现抗病的单基因，抗性由多基因控制，传统育种方法难以转育。

在植物与病原菌协同进化过程中，病原菌为适应不同植物种通常以近缘种或致病型复合体存在，近缘非寄主植物则可能存在一些基因，其产物能够特异性识别该种植物非典型病原菌的激发子而启动与防御反应有关的信号级联反应。非亲和病菌编码激发子的基因被称为异种无毒基因，异钟无毒基因一般是病菌对寄主植物致病的必需因子；非寄主植物识别异种无毒基因、启动防御反应的基因被称为非寄主抗性基因。

随着植物分子生物学技术的迅速发展，目前国内外对非寄主抗性基因在作物育种中的应用前景倍加关注。Rxol基因是从玉米中克隆的一个非寄主抗性基因。Rxol与细菌性条斑病菌的无毒基因互作激活防御反应，导致玉米叶片对水稻细菌性条斑病菌产生典型的过敏性反应。携带该基因的玉米品系抗谱广，对来自不同地区的细菌性条斑病菌株都表现高度抗性。将克隆的Rxol导入水稻，转基因植株接种细菌性条斑病菌菌液后，接种点周围的叶片细胞迅速坏死，反应型和抗谱与玉米叶片相同。Rxol在水稻中启动过敏性坏死反应和细胞程序化死亡途径而对细菌性条斑病病产生抗性，但是该基因启动抗病反应的上游信号识别和传导机制尚不清楚。

植物通过细胞膜上的受体感知环境变化，产生相应的信号调控机体生理变化。植物受体与动物生长因子受体类似，也具有信号识别和转导的功能，故称之为类受体激酶[1]。植物类受体激酶家族成员众多，拟南芥和水稻中类受体激酶家族分别含有600和1000多个成员[2]。BAK1(也叫ELG，RKS10)是其中研究最为深入的类受体激酶之一，它属于富亮氨酸重复(Leucine-rich repeat，LRR)类受体激酶SERK家族。它是一个多功能的蛋白，调控植物生长发育、免疫信号和细胞死亡等过程。

水稻中发现许多SERK家族成员：如OsSERK1-2及OsSERKL1-9。2005年Ito和Hu分别在水稻中发现OsSERK1-2。Hu等对OsSERK1进行RNAi和过表达研究，OsSERK1受稻瘟病菌或外施水杨酸、茉莉酸诱导表达，而且参与植物抗病反应影响愈伤再生能力。2009年Singla等以拟南芥和水稻SERK家族氨基酸序列在数据库KOME、NCBI和TIGR中BALST比对，发现OsSERKL1-9，用油菜素内酯(Brassinosteroids，BRs)和脱落酸(abscisic acid，ABA)处理后，不同OsSERKL基因表达模式不同，推断它们可能具有不同的功能。Li等研究发现OsSERK1与AtBAK1高度同源，因而把它又命名为OsBAK1。RNAi干扰研究发现OsBAK1调控水稻多个重要农艺性状，如：株高、叶夹角、粒形。Park等用OsBAK1激酶域构建干扰载体，转基因植株中OsSERK1-2和ORK1基因表达量均被干扰，表现出矮化、不正常发育并对稻瘟病感病。水稻中OsSERKs家族成员众多，但目前尚未见到从水稻中分离出抗病功能明确的该家族基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个油菜素内酯受体激酶类似蛋白(BRI1-associated kinase1，Bak1)。

本发明所提供的油菜素内酯受体激酶类似蛋白，名称为OsBAK1L，来源于来源于水稻(OryzaSativa L.)，具有下述氨基酸残基序列的蛋白质：

1)序列表中SEQ ID No：1；

2)将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至几个氨基酸残基的取代、缺失或填加且与植物抗病性相关的蛋白质。

序列表中SEQ ID No：l由605个氨基酸残基组成，其中，自氨基端1-22位氨基酸为信号肽、23-67位氨基酸亮氨酸拉链、68-184位氨基酸LRR结构、209-255位氨基酸跨膜域，370-501位氨基酸膜内RD(Arginine Aspartic acid)激酶域。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

编码本发明油菜素内酯受体激酶类似蛋白的基因(OsBAK1L)，其cDNA是下述核酸序列之一：

上述油菜素内酯受体激酶类似蛋白的基因组基因可具有下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：2的cDNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：1的蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述油菜素内酯受体激酶类似蛋白的基因组基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：3的DNA序列；

2)与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列具有90％同源性且提高植物抗病性的核酸序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。序列表中SEQ ID No：3由5448个碱基组成。

自5’端1-319位碱基为该基因组基因的第1个外显子，自5’端340-1091位碱基为该基因组基因的第1个内含子，自5’端1092-1302位碱基为该基因组基因的第2个外显子，自5’端1303-1416位碱基为该基因组基因的第2个内含子，自5’端1417-1549位碱基为该基因组基因的第3个外显子，自5’端1550-1961位碱基为该基因组基因的第3个内含子，自5’端1962-2033位碱基为该基因组基因的第4个外显子，自5’端2034-2261位碱基为该基因组基因的第4个内含子，自5’端2262-2405位碱基为该基因组基因的第5个外显子，自5’端2406-2483位碱基为该基因组基因的第5个内含子，自5’端2484-2555位碱基为该基因组基因的第6个外显子，自5’端2556-2638位碱基为该基因组基因的第6个内含子，自5’端2639-2704位碱基为该基因组基因的第7个外显子，自5’端2705-2789位碱基为该基因组基因的第7个内含，自5’端2790-2860位碱基为该基因组基因的第8个外显子，自5’端2861-2970位碱基为该基因组基因的第8个内含子，自5’端2969-3109位碱基为该基因组基因的第9个外显子，自5’端3110-3609位碱基为该基因组基因的第9个内含子，自5’端3608-3949位碱基为该基因组基因的第10个外显子，自5’端3950-4211位碱基为该基因组基因的第10个内含子，自5’端4210-4604位碱基为该基因组基因的第11个外显子，自5’端4605-4899位碱基为该基因组基因的第11个内含子，自5’端4898-5448位碱基为该基因组基因的第12个外显子。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因提高植物抗病性方法。

本发明提高植物抗病性方法，是将所述油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因与非寄主抗性基因共同插入真核细胞表达载体，得到含有所述基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植物，从表达所述植物抗病相关蛋白的植株或所述植物抗病相关蛋白表达量增加的植株中筛选到抗病性增强的植株。

所述重组表达载体可为将所述油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因插入去除GUS基因的pCAMBlA3301得到的pCAMBIA3301-OsBAK1L，进一步将非寄主抗性基因插入该载体构成双价载体。

本发明的BAK1基因可通过现有的方法构建到真核细胞表达载体，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferasc)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物安全性考虑，可将油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因和非寄主抗性基因插入到双元载体pMNDRBBin6，通过对转基因植株后代的筛选，获得只含有目的基因不含有选择标记的转基因植株。

本发明的OsBAK1L基因在携带非寄主抗性基因的水稻植株中抑制表达后，细菌性条斑病菌生长量增加，表明该基因正向调控非寄主抗性基因在异种植物中的表达。本发明的蛋白及其编码基因对于植物抗病机制的研究，以及利用非寄主抗性基因改良植物抗病性具有重要的理论及实际意义，将在植物抗病基因工程改良中发挥作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施实例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1OsBAK1L基因的PCR扩增电泳图

图2OsBAK1L基因与拟南芥SERK家族基因的结构比较

图3OsBAK1L和OsSERKL8氨基酸序列比对

图4转基因水稻PCR鉴定和OsBAK1L表达分析

A：上面载体35s启动子引物和目的基因引物扩增OsBAK1L-RNAi片段；下面扩增选择标记Bar基因；OsBAK1L表达分析；1-5：分别是24h、48h、72h、96h、120h接种Rs105的T₀转基因植株；C：9804-Rxol

图5转基因植株抗病性鉴定

S：感病对照9804；R：抗病对照9804-Rxol；E：T0代转基因水稻.

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、水稻油菜素内酯受体激酶类似蛋白OsBAK1L及其编码基因的获得

按照水稻基因(LOC_Os03g49620.4序列，用Primer Premicr5.00设计一对引物OEBF和OEBR，OEBF序列为：5’ATGGGGAGGTGCCATACTGG3’，OEBR为5’TOTGCCGGCGGAGAGCT3’。用上述引物RT-PCR。以200mg水稻品种9804-Rxol的叶片为材料，采用Trizol方法提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。Ss cDNA的合成按照SuperScript TM II RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。进行RT-PCR反应程序如下：先94℃5分钟；然后30个循环(94℃30秒，52℃1分钟，72℃2分钟)；最后72℃延伸15分钟，4℃保温。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增的结果如图1所示，OsBAK1L引物在在cDNA水平得到了1818bp的条带。图1为OsBAK1L引物在cDNA水平上PCR扩增产物，泳道M为TaKaRa公司的Marker DL2000。

PCR扩增的DNA片段与预期结果相符，电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶试剂盒(购自北京天为时代公司)回收并纯化目的片段。将回收的cDNA片段分别连接入载体pGEM-T Easy(Promega公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5a感受态细胞(TIANGEN公司)，筛选阳性克隆，提取质粒，得到含有目的片段的重组质粒，对其进行测序，分别对3次独立以基因组DNA和cDNA为模板扩增的DNA片段的重组质粒进行了序列测定，测序结果表明获得了正确的OsBAK1L cDNA序列。

序列表中SEQ ID No：2为OsBAK1L基因的cDNA序列。9804水稻的cDNA扩增获得的CDS与数据库(http://www.gramene.org/)中LOC_Os03g49620.4的CDS(Coding sequcnce)序列一致，共1818bp。Gramene数据库LOC_Os03g49620.4注释为BRASSINOSTEROIDINSENSITIVE1-associated receptor kinase 1 precursor，因此，将LOC_Os03g49620.4暂命名为OsBAK1L。

将水稻基因OsBAK1L(LOC_Os03g49620.4)的氨基酸序列与与拟南芥SERK1-5家族成员结构比对(图2)发现：它们结构构类似，都具有信号肽、亮氨酸拉链、LRR结构、跨膜域和膜内RD激酶域，但OsBAK1在LLRRC-末端结构域上不含有SPP模体。由于SERK家族成员是以SPP模体作为分类标志，所以OsBAK1L不是SERK家族成员。

Singla等发现OsSERKL1-9中OsSERKL8的基因座位号与OsBAK1L相同(Singla B，Khurana JP，Khurana P. Structural characterization and expression analysis of the SERK/SERL genefamily in rice(Oryza sativa).Int.J PlantGenomics，2009；2009：539402)，都为LOC_Os03g49620。将OsSERKL8和OsBAK1L的DNA、cDNA和氨基酸序列比对，发现两者DNA序列一致，但cDNA和氨基酸之间均存在差异。但两者主要差异是OsSERKL8的CDS序列5’部缺失外显子，致使OsSERKL8肽链中缺失信号肽和LRRNT结构域(图3)。虽然OsSERKL8和OsBAK1L的DNA序列比对结果一致，但氨基酸序列存在外显子组合的差异。因此，OsSERKL8和OsBAK1L是LOC_Os03g49620不同转录形式，从结构上OsBAK1L不同于OsSERKL8。

实施例2OsBAK1L转基因水稻的获得及抗病性鉴定

1、OsBAK1L植物RNAi表达载体的构建

根据NCBI在线BLAST对OsBAK1L同源序列分析，选择其中540bp特异核苷酸序列(GGTGAGGAGGTGAAGTGGGAGAGGCGGCGTGGACCTGCGACGACCTGCTTGCTGCCCAGCCTGCGAGGGGCAAGCCACTGGTAGGTGCCATACTGGACTGGCTTGCTTGTTAACTGGGGTTAGCCAGGGGACTCCGGTATTATACTACTATGATCAGTTCGTGTACTTTTTTTCGCCGGGGCAAGTTTCCCCAAGGAACTCTTTTGATGCTGTAATTATAACTGAAGAGTCATGGATCTGCTCAGCGTCCTCCTAATTATAGCATCTCTGCTCCCATTTTCAGCATCTGACCGTCAAGGTGATGCACTATATGATATGAAGCTGAAGCTGAATGCTACTGGTAACCAGCTTTCTGACTGGAACCAAAATCAAGTTAACCCATGCACTTGGAATTCTGTTATTTGTGACAACAACTACAATGTTGTGCAAGTAACATTGGCATCTATGGGATTCACTGGAGTTCTATCACCACGAATTGGAGAGCTTCAGTTTTTGAATGTTTTGTCCTTGCCTGGTAATAAGATTACTGGTGGCATACCTGAGC)作为RNAi干扰区段。设计引物RiBF/R，RiBF序列为：5′GGTGAGGAGGTGAAGTGGGA3′，RiBR序列为：5′GCTCAGGTATGCCACCAGTAA3′。PrimeSTARPCR扩增OsBAK1L特异540bp的区段，再用分别带有attB1/2接头RiBF/R的引物用PrimeSTAR PCR扩增OsBAK1L特异目的片段，使其5′和3′端分别带上attB1：5′GGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3′和attB2：5′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT3′接头。PrimeSTARPCR反应程序为95℃4min；98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 2min，30个循环；72℃10min。将长约600bp的PCR产物回收并纯化，通过BP反应将其整合到pDONR201载体，形成pENTER201-OsBAK1L并测序后与540bp的特异序列比对。比对验证无误后，将pENTER201-OsBAK1L和pB7GWIWG2(II)通过LR反应重组到pB7GWIWG2(II)上，构建OsBAK1L-RNAi载体。

2、转化水稻和转基因苗鉴定

将pB7GWIWG2(II)-OsBAK1L热击转化农杆菌EHA105。采用常规的农杆菌介导遗传转化程序转化9804-Rxol水稻愈伤，加1mL(50mg/mL)除草剂筛选阳性愈伤，再生转基因苗。种植转基因苗的同时，种植9804-Rxol、9804分别作为阳性和阴性对照。根据Trizol试剂操作手册提取水稻组织的总RNA，DNaseI处理后，取约1-2μg的总RNA用于cDNA第一链的合成。以水稻Actin(Os03g0718100)作为内参(GACTCTGGTGATGGTGTCAGCCACACTGTCCCCATCTATGAAGGATATGCTCTCCCCCATGCTATCCTTCGTCTCGACCTTGCTGGGCGTGATCTCACTGATTACCTCATGAAGATCCTGGACGGAGCGTGGTTACTCATTCACCACAACGGCCGAGCGGGAAATTGTGAGGGACATGAAGGAGAAGCTTTCCTACATCGCCCTGGACTATGACCAGGAAATGGAGACTGCAAGACCAGCTCCTCCGTGGAGAAGAGCTACGAGCTTCCTGATGGACAGGTTATCACCATTGGTGCTGAGCGTTTCCGCTGCCCTGAGGTCCTCTTCCAGCC)，ActinF/R(ActinF：5′GACTCTGGTGATGGTGTCAGC3′，ActinR：5′GGCTGGAAGAGGACCTCAGG3′)为引物半定量PCR扩增后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，成像观察。荧光定量PCR参照Takara说明书DRR041A。

根据载体启动子35S片段和目的基因的干扰片段序列，分别设计正向和反向引物35s/RiBR。特异引物(35S：5′GACGCACAATCCCACTATCC3′；RiBR：5′CGCTCAGGGTATGCCACCAGTAA3′)和载体Bar基因引物BarF/R(BarF：5′CAACTACGACGGGCAGGAG3′；BarR：5′CAGATGCGACTTGGGACT3′)，用于转基因阳性植株、9804-Rxol、pB7GWIWG2(II)-OsBAK1L质粒和pB7GWIWG2(II)扩增。结果在T₀转基因植株和pB7GWIWG2(II)-OsBAK1L获得1000bp的目的片段。Bar基因检测结果发现在9804-Rxol没有扩增出731bp的目的片段(图4A)。用干扰的目的基因引物RTBF/R和Actin引物ActinF/R扩增。RNAi转基因植株与抗病对照相比，OsBAK1L表达量下降(图4B)。

种植转基因苗的同时，种植9804-Rxol和9804，分别作为阳性和阴性对照。待水稻孕穗期采用针刺法接种，每株选取三个分蘖每个分蘖选两片生长正常叶接钟。在主脉两侧接种6次，接种点间隔3-5cm。接种后每天喷雾保湿，并观察记录表型变化。抗病品种9804-Rxol接种4天出现过敏性褐色坏死反应，第5天抗病品种褐色病斑更加明显，并且病斑停止进一步扩展。转基因植株第4天侵染点坏死干枯，没有水浸状细条形病斑出现，也没有像抗病品种9804-Rxol那样出现明显褐色HR反应。接种第5天出现明显过敏性褐色HR反应，与抗病品种第四天HR反应病斑表型类似。感病品种9804第4天出现明显水浸状细条形病斑，第5天感病品种细条形病斑扩展(图5)。接种细菌型条斑病菌后，转基因植株中OsBAK1L基因表达受到抑制，过敏性抗病反应推迟减弱，可见OsBAK1L基因正向调控水稻对细菌性条斑病的抗性。

Claims (9)

1.来自水稻的油菜素内酯受体激酶类似蛋白，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：1；2)将序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列经过一至几个氨基酸残基的取代、缺失或填加且与植物抗病性相关的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

3.根据权利要求1所述的与植物非寄主抗性在异种植物中表达相关的油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因的cDNA序列如序列表SEQ IDNo：2所示。

5.编码权利要求1或2所述油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因的cDNA序列，具有下列核酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：32的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：1蛋白质的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6.含有权利要求3、4或5所述编码基因的表达载体。

7.含有权利要求3、4或5所述编码基因的细胞系。

8.含有权利要求3、4或5所述编码基因的宿主菌。

9.一种提高植物抗病性的方法，是将权利要求3或4或5所述油菜素内酯受体激酶类似蛋白基因或与所述基因具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列与非寄主抗性基因共同导入植物组织、细胞或器官，植物抗病性获得提高。

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