CN109811005B - 株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的应用。本发明公开的蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因可以调控水稻的叶倾角，且降低OsSLA1编码基因的表达后，植物的叶倾角变小，但植株没有变矮，其他农艺性状(如株高、结实率和千粒重)也没有明显改变，因此OsSLA1及其编码基因对调控植物株型具有重要意义。

Description

株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的应用。

背景技术

水稻是重要的农作物，具有良好株型是提高其产量的有效手段之一，因此水稻株型的调控机制研究具有重要的理论价值和实践意义。水稻的株型主要由叶和穗的形态决定，其中叶的形态尤为重要，而叶倾角是影响叶形态的主要因素，叶倾角的变小会使叶片竖直，形成紧凑型株型。水稻中叶片是光合作用的主要场所，叶倾角变小可以减少上层叶片对下层叶片的遮挡，因此可以促进阳光的渗透、增加整株的光合作用效率，同时紧凑的株形可以使植株占据更小空间，因而可以通过提高种植密度达到增产的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的株型。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物株型；

D2)制备调控植物株型产品；

D3)调控植物叶倾角；

D4)制备调控植物叶倾角产品；

D5)培育叶倾角降低植物；

D6)植物育种；

所述蛋白质(名称为OsSLA1)为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的OsSLA1蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的OsSLA1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的OsSLA1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的OsSLA1蛋白质。

本发明还提供了与OsSLA1相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物株型；

D2)制备调控植物株型产品；

D3)调控植物叶倾角；

D4)制备调控植物叶倾角产品；

D5)培育叶倾角降低植物；

D6)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B22)中的任一种：

B1)编码OsSLA1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；

B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；

B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B21)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

B22)含有B21)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)-b4)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsSLA1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsSLA1的cDNA分子或基因组DNA分子；

B21)所述核酸分子可为序列表中序列2的第441-957位所示的核酸分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsSLA1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsSLA1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsSLA1蛋白质且具有OsSLA1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码OsSLA1蛋白质的核酸分子的表达盒(OsSLA1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsSLA1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动OsSLA1基因转录的启动子，还可包括终止OsSLA1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

上述应用中，B2)所述表达盒具体可为包含序列表中序列3所示的OsSLA1启动子和OsSLA1编码基因的表达盒，所述表达盒中所述OsSLA1编码基因的表达由所述OsSLA1启动子驱动。

可用现有的表达载体构建含有所述OsSLA1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1300载体或pTCK303。

B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA OsSLA1pro::OsSLA1-7MYC-6His。所述pCAMBIA OsSLA1pro::OsSLA1-7MYC-6His为将modified pCAMBIA1300的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列2的1-1866位、并将PstI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的OsSLA1启动子得到的重组载体。

B22)所述重组载体可为将序列表中序列2的第441-957位正向插入表达载体并再将序列2的第441-957位反向插入所述表达载体得到的能够抑制OsSLA1编码基因表达的重组载体。B22)所述重组载体具体可为Ri载体，所述Ri载体为将pTCK303的SpeI和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第441-957位所示的DNA片段，再将BamHI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第441-957位所示的DNA片段反向序列，得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)水稻。

本发明还提供了具有调控植物株型的产品，所述产品含有OsSLA1或所述生物材料。

所述产品可以OsSLA1或所述生物材料作为其活性成分，还可将OsSLA1或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述产品中，所述植物可为m1)或m2)或m3)：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)水稻。

本发明还提供了一种降低植物叶倾角的方法，所述方法包括：降低受体植物中OsSLA1的活性和/或含量，或，抑制OsSLA1的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比叶倾角降低的目的植物。

本发明还提供了一种培育叶倾角降低植株的方法，所述方法包括：降低受体植物中OsSLA1的活性和/或含量，或，抑制OsSLA1的编码基因的表达，得到与所述受体植物相比叶倾角降低的目的植物。

所述受体植物含有OsSLA1的编码基因。

上述方法中，所述目的植物可为通过向所述受体植物中导入降低OsSLA1表达量的核酸分子得到的与所述受体植物相比所述蛋白质表达降低的转基因植物。

上述方法中，所述目的植物具体可为通过向所述受体植物中导入所述Ri载体实现。

所述Ri载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular BiologyVIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含OsSLA1编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物可为m1)或m2)或m3)：

m1)单子叶植物或双子叶植物；

m2)禾本科植物；

m3)水稻。

OsSLA1或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

所述叶倾角为叶与其所在茎秆之间形成的夹角。所述叶倾角具体可为灌浆期已经发育的叶与其所在茎秆之间形成的夹角。在本发明的一个实施例中，所述叶倾角为与旗叶紧邻的叶片与其所在茎秆之间形成的夹角。

实验证明，本发明的株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因可以调控水稻的叶倾角，且降低OsSLA1编码基因的表达后，植物的叶倾角变小，但植株没有变矮，其他农艺性状(如株高、结实率和千粒重)也没有明显改变。而叶倾角是决定植物株型的重要因素，植物株型影响植物的光合作用效率及结实率，因此OsSLA1及其编码基因的功能对植物株型调控的理论研究及实践生产都有重要意义。

附图说明

图1为转基因植株鉴定结果。A为阳性转OsSLA1基因植株的半定量RT-PCR鉴定结果；B为阳性转OsSLA1基因植株的OsSLA1蛋白鉴定结果。WT表示野生型水稻(即日本晴)，A和B中1、2、3分别表示阳性转OsSLA1基因植株1、2和3，C中1、2、7、8和22分别表示阳性干涉植株1、2、7、8和22。

图2为阳性转OsSLA1基因植株叶倾角检测结果。A为灌浆期阳性转基因植株的表型及叶枕处放大图；B为阳性转OsSLA1基因植株T1代叶倾角统计结果(*P<0.05)。2表示阳性转OsSLA1基因植株2。

图3为阳性干涉植株叶倾角检测结果。A为待测植株(抽穗期)和叶枕部位图；B为待测植株自上而下的第二片叶叶倾角统计，WT为日本晴，空表示Ri空载对照植株，1、2、7、8和22分别表示阳性干涉植株1、2、7、8和22。(n≥20)

图4为阳性干涉植株结实率和千粒重的检测结果。WT为日本晴，空表示Ri空载对照植株，1、2、7、8和22分别表示阳性干涉植株1、2、7、8和22。(n≥20)

图5为阳性干涉植株株高的检测结果。WT为日本晴，空表示Ri空载对照植株，1、2、7、8和22分别表示阳性干涉植株1、2、7、8和22。(n≥20)

图6为叶枕部位细胞的横切面和纵切面结果。A：叶枕部位细胞的横切面和纵切面观察，右侧为左侧部位方框区域放大图；B为横切半薄切片近轴面细胞长度统计；C为横切半薄切片近轴面细胞层数统计。野生型表示日本晴，干涉1表示阳性干涉植株1。(n≥10)

图7为OsSLA1基因在不同组织的表达分析结果。A为pCAMBIA OsSLA1pro::-GUS转基因植株的GUS染色分析，OsSLA1在叶枕、叶鞘、叶身、茎节、花、胚芽鞘中表达，在根中不表达，叶枕部位活体切片中在近轴面厚壁细胞群中表达较高。图注箭头所指为表达部位；B为半定量RT-PCR检测OsSLA1在水稻不同部位的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1、提高OsSLA1编码基因的表达量导致水稻的叶倾角增加

本实施例提供了一个来源于水稻日本晴(Oryza sativa cv Nipponbare)的株型相关蛋白，其名称为OsSLA1(Oryza sativa Small Leaf Angle 1)，其序列为序列表中序列1，在日本晴中编码OsSLA1的CDS序列为序列表中序列2。OsSLA1及其编码基因可以调控水稻的叶倾角。检测方法如下：

1、重组载体的构建

利用正向引物(5′-CGAATTTCGGAAAATTTGGATG-3′)和反向引物(5′-GGAGTGGTTTGACCAGGTGG-3′)组成的引物对对日本晴的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，序列正确的DNA片段其序列为序列表中序列3，在日本晴基因组DNA中位于OsSLA1的编码基因上游，记为OsSLA1启动子。

将载体1(文献“Zhang et al.,Altered Architecture and Enhanced DroughtTolerance in Rice via the Down-Regulation of Indole-3-Acetic Acid by TLD1/OsGH3.13Activation,Plant Physiology,December 2009,Vol.151,pp.1889–1901”中的modified pCAMBIA1300)的XbaI和BamHI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第1-1866位所示的OsSLA1编码基因，并将PstI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的OsSLA1启动子，得到重组载体，将该重组载体记为pCAMBIA OsSLA1pro::OsSLA1-7MYC-6His，该重组载体能表达OsSLA1与MYC标签和His标签的融合蛋白质，该融合蛋白的表达由OsSLA1启动子驱动。

2、转OsSLA1基因水稻的构建

将步骤1得到的pCAMBIA OsSLA1pro::OsSLA1-7MYC-6His导入农杆菌EHA105中后，利用农杆菌介导的植株转化方法转化日本晴(即受体植物，记为野生型水稻，WT)的胚所诱导的愈伤组织，经过筛选及植株再生培养得到转OsSLA1基因植株。

按照上述方法，利用载体1转化日本晴，得到空载体对照植株。

3、转基因植株的鉴定

DNA水平上的鉴定：利用正向引物(5′-ACCACCATGCCTCCCTCG-3′)和反向引物(5′-CATGGTATCTGATTCATCCTTGTTATAGG-3′)组成的引物对对步骤2得到的转OsSLA1基因植株进行PCR扩增，能扩增得到约1866bp DNA片段的植株即为阳性转OsSLA1基因植株。

RNA水平上的鉴定：提取T1代阳性转OsSLA1基因植株的RNA，并反转录为cDNA，利用正向引物(5′-ACCACCATGCCTCCCTCG-3′)和反向引物(5′-CATGGTATCTGATTCATCCTTGTTATAGG-3′)组成的引物对进行半定量RT-PCR检测OsSLA1基因的表达水平，利用OsACTIN1作为内参，内参引物为：正向引物：5′-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3′；反向引物：5′-GAGAAACAAGCAGGAGGACGGC-3′。利用野生型水稻和空载体对照植株作为对照。

结果如图1中A所示，结果显示，3株T1代阳性转OsSLA1基因植株(记为阳性转OsSLA1基因植株1、2和3)中OsSLA1基因的表达水平均显著高于野生型水稻和空载体对照植株，野生型水稻和空载体对照植株中OsSLA1基因的表达水平无显著差异。

蛋白质水平上的鉴定：应用免疫印迹杂交方法，检测RNA鉴定中的3株T1代阳性转OsSLA1基因植株中蛋白质的表达水平，所用一抗为MYC抗体(Monoclonal Anti-c-MYCantibody(M4439,Sigma))，二抗为Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody(L3032-1，SAB)产品。利用野生型水稻和空载体对照植株作为对照。

结果如图1中B所示，结果显示，与野生型水稻相比，阳性转OsSLA1基因植株1中目的蛋白的表达增加，阳性转OsSLA1基因植株2和3中目的蛋白的表达显著增加。野生型水稻与空载体对照植株中目的蛋白的表达无显著差异。

4、表型的鉴定

待测植株：日本晴(WT)、T1代阳性转OsSLA1基因植株1、T1代阳性转OsSLA1基因植株2、T1代阳性转OsSLA1基因植株3和空载体对照植株。

检测待测植株灌浆期的5个主分蘖中从上到下第二片叶(即旗叶之前长出的最后一片叶子，与旗叶紧邻)的叶倾角，结果显示，与WT相比，阳性转OsSLA1基因植株1、2和3的叶倾角均增加，阳性转OsSLA1基因植株2的叶倾角显著增加(图2)，WT与空载体对照植株的叶倾角无显著差异。

实施例2、降低OsSLA1编码基因的表达量导致水稻的叶倾角变小

1、重组载体的构建

将pTCK303(Sun et al.,Two Rice Authentic Histidine PhosphotransferProteins,OsAHP1and OsAHP2,Mediate Cytokinin Signaling and Stress Responses inRice,Plant Physiology,May 2014,Vol.165,pp.335–345)的SpeI和SacI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第441-957位所示的DNA片段，得到重组载体，再将重组载体中BamHI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第441-957位所示的DNA片段反向序列，得到重组载体，将该重组载体记为Ri载体。

2、转基因水稻的构建

将步骤1得到的Ri载体导入农杆菌EHA105中后，利用农杆菌介导的植株转化方法转化日本晴的胚所诱导的愈伤组织，经过筛选及植株再生培养得到7个转基因株系，将得到的转基因植株分别记为干涉植株。利用pTCK303作为对照，将这利用该载体得到的植株记为Ri空载对照植株。

3、转基因植株的鉴定

对干涉植株应用半定量RT-PCR，扩增OsSLA1的CDS序列检测OsSLA1基因在RNA上的表达水平，所用引物为：正向引物(5′-ACCACCATGCCTCCCTCG-3′)和反向引物(5′-CATGGTATCTGATTCATCCTTGTTATAGG-3′)，利用OsACTIN1作为内参，内参引物为：正向引物：5′-CTTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3′；反向引物：5′-GAGAAACAAGCAGGAGGACGGC-3′。利用日本晴(野生型水稻)和Ri空载对照植株作为对照。

结果(图1)显示，在RNA水平上5个干涉植株(即干涉植株1、2、7、8和22)OsSLA1基因的表达水平与日本晴相比明显降低，将这5个干涉植株均为阳性干涉植株。Ri空载对照植株与日本晴中OsSLA1基因的表达水平无显著差异。

4、表型的鉴定

待测植株：日本晴(WT)、阳性干涉植株、Ri空载对照植株。

检测待测植株灌浆期的5个主孽中自上而下的第二片叶(即旗叶之前长出的最后一片叶子，与旗叶紧邻)的叶倾角，结果显示，与WT相比，阳性干涉植株的叶倾角均显著变小(图3)，WT与Ri空载对照植株叶倾角的叶倾角无显著差异。WT(日本晴)叶倾角为15.9°，而阳性干涉植株叶倾角在2.6°至5°之间，Ri空载对照植株叶倾角为11°左右。

进一步对各植株的农艺性状进行检测，结果显示，阳性干涉植株没有变矮(图5)，其他农艺性状(如结实率和千粒重，图4)也没有明显改变。

发明人进一步通过半薄切片对WT、阳性干涉植株叶枕处细胞进行观察。横切面的结果(图6中A)显示，在阳性干涉植株中叶枕处横切面中各类细胞的排布和WT相比没有明显差异，但阳性干涉植株近轴面细胞排列紧致且明显小于WT细胞，同样的结果在叶枕纵切面中也能观察到。统计结果(图6中B)显示位于表皮细胞和维管束之间的细胞长度在WT植株中为59.3μm，而阳性干涉植株中仅为34.6μm，但二者细胞层数上没有差异，WT和阳性干涉植株均为3至4层(图6中C)，此外阳性干涉植株中近轴面维管束直径稍大于WT，表明阳性干涉植株近轴面的细胞变小，维管束稍有变大。可见阳性干涉植株中叶枕处近轴面细胞的伸长受到抑制，近轴面细胞变小的结构变化可能使阳性干涉植株近轴面机械力强度增加，从而具有叶直立的表型。

以上实验结果说明，OsSLA1及其编码基因可以调控植物的株型。

实施例3、OsSLA1基因表达模式

构建pCAMBIA OsSLA1pro::GUS载体，方法如下：将pCAMBIA1300M(Zhang et al.,Molecular and Genetic Evidence for the Key Role of AtCaM3in Heat-Shock SignalTransduction in Arabidopsis,Plant Physiology,April 2009,Vol.149,pp.1773–1784)的PstI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的OsSLA1启动子区序列，得到重组载体，将该重组载体记为pCAMBIA OsSLA1pro::GUS。

将得到的pCAMBIA OsSLA1pro::GUS载体导入农杆菌EHA105中后，利用农杆菌介导的植株转化日本晴的成熟胚所诱导的愈伤组织，经过筛选及植株再生培养得到转基因植株。对转基因植株的GUS染色分析发现，OsSLA1主要在叶枕，叶身、叶鞘、茎节、胚芽鞘和颖花中表达，在根中不表达。对叶枕进行活体横切观察后发现，OsSLA1主要在叶枕的近轴面的细胞，特别是厚壁细胞群中有强表达，在薄壁细胞中也有表达(图7中A)。

提取日本晴不同组织的RNA，通过半定量RT-PCR的方法(方法同实施例1)检测OsSLA1在水稻不同部位的表达情况，结果显示OsSLA1基因在水稻的叶片(图中叶身)、叶枕及叶鞘部位表达量较高,在水稻的根和颖花中表达量较低(图7中B)。OsSLA1基因的组织表达模式与其在叶枕部位的功能相一致。

<110> 河北师范大学

<120> 株型相关蛋白OsSLA1及其编码基因在调控水稻叶倾角中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 622

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

Met Pro Pro Ser Pro Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ser Ala Thr Pro Arg Glu Asp Asp

20 25 30

Val Arg Cys Leu Lys Glu Val Lys Ala Glu Leu Arg Asp Pro Asp Gly

35 40 45

Arg Leu Ser Ala Trp Ser Phe Gly Asn Thr Ser Ala Gly Ala Leu Cys

50 55 60

Leu Leu Ser Gly Val Ser Cys Trp Asn Pro Gln Glu Ser Arg Ile Ile

65 70 75 80

Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Ser Ala

85 90 95

Leu Gln Phe Cys Ser Ala Ala Thr Thr Leu Asp Leu Ser Asn Asn Ala

100 105 110

Leu Val Gly Val Ile Pro Pro Ala Leu Cys Asp Trp Ile Pro Phe Val

115 120 125

Val Asn Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gln Leu Ser Gly Gln Leu Pro Ser

130 135 140

Glu Leu Ala Asn Cys Arg Phe Leu Asn Ser Leu Lys Leu Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Phe Ser Gly Gln Ile Pro Asp Ser Leu Gly Arg Leu Asp Arg Leu

165 170 175

Lys Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Arg Leu Asp Gly Gln Ile Pro Pro

180 185 190

Gln Leu Ala Thr Phe Gly Lys Asp Ser Phe Ala Gly Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Cys Gly Arg Pro Val Ser Ser Arg Cys Gly Arg Ala Leu Ser Gly Ala

210 215 220

Gly Leu Gly Ile Val Ile Ala Ala Gly Val Phe Gly Ala Ala Ala Ser

225 230 235 240

Leu Leu Leu Ala Phe Phe Phe Trp Arg Cys Thr Gly Lys Ser Lys Gly

245 250 255

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Ser Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala

260 265 270

Glu Asp Gly Ser Trp Trp Ala Glu Arg Leu Arg Ala Ala His Asn Arg

275 280 285

Leu Ala Pro Val Ser Leu Phe Gln Arg Pro Ile Val Lys Val Lys Leu

290 295 300

Ala Asp Leu Met Ala Ala Thr Gln Asp Phe Ser Thr Ser His Ile Val

305 310 315 320

Val Ala Gly Ser Ser Arg Ala Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Val Leu Arg

325 330 335

Asp Gly Ser Ala Leu Thr Val Lys Arg Leu His Ser Cys Pro Leu Ser

340 345 350

Glu Lys Ala Phe Arg Ala Glu Met Gly Arg Val Gly Gln Leu Arg His

355 360 365

Pro Asn Ile Val Pro Leu Leu Gly Phe Cys Val Val Glu Asp Glu Arg

370 375 380

Leu Leu Val Tyr Lys His Met Glu Ser Gly Ala Leu Ser Ser Val Met

385 390 395 400

Lys Glu Pro Gly Glu Ala Pro Leu Asp Trp Ala Thr Arg Leu Arg Ile

405 410 415

Ala Val Gly Ala Ala Arg Gly Leu Ala Trp Leu His His Gly Phe Gln

420 425 430

Val Pro Gln Ile His Gln Asn Leu Ser Ser Ser Ala Val Leu Leu Asp

435 440 445

Glu Asp Tyr Glu Ala Arg Phe Ile Asp Val Gly Leu Thr Arg Leu Val

450 455 460

Arg Met Ala Pro Gly Glu Gly Gly Asp Thr Ser Pro Phe Leu Asn Gly

465 470 475 480

Asp Phe Gly Glu Tyr Gly Tyr Val Ala Pro Glu Cys Ala Ser Asn Pro

485 490 495

Val Ala Thr Met Lys Gly Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Ile Leu Leu

500 505 510

Glu Leu Val Ser Gly Gln Glu Ala Ala Thr Val Thr Gly Asp Ala Ala

515 520 525

Gly Glu Gly Phe Lys Gly Thr Leu Val Asp Trp Val Asn Gln Leu Lys

530 535 540

Ala Ser Gly Arg Ile Gly Asp Ala Val His Lys Ser Leu Arg Gly Asn

545 550 555 560

Gly His Asp Ser Glu Ile Asp Glu Phe Val Lys Ile Ala Phe Ala Cys

565 570 575

Ile Met Val His Pro Arg Glu Arg Phe Ser Met Tyr Arg Val Tyr His

580 585 590

Ser Leu Lys Ser Ile Gly Gln Gly Arg Asp Val Ser Glu Gln Phe Asp

595 600 605

Glu Phe Pro Leu Ala Tyr Asn Lys Asp Glu Ser Asp Thr Met

610 615 620

<210> 2

<211> 1869

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

atgcctccct cgccgcctcc cctcctcctc ctcctcgcgg tcctcctcgc agccgcgccg 60

gcggcggcgc agtcggcgac gccccgggag gacgacgtgc ggtgcctcaa ggaggtgaag 120

gccgagctcc gggacccgga cgggcgcctc tcggcgtgga gcttcggcaa cacctcggcg 180

ggagccctgt gcctgctgtc gggggtgtcg tgctggaacc cgcaggagtc gcgcatcatc 240

ggcctctcgc tctccgggtt cggcctccag ggcgggatcc cctccgcgct gcagttctgc 300

agcgccgcca ccacgctcga cctctccaac aacgcgctgg tgggggttat cccgcccgcg 360

ctctgcgact ggatcccgtt cgtcgtcaac ctcgacctct ccgggaacca gctctccggc 420

cagctcccca gcgagctcgc caactgccgc ttcctcaact cgctcaagct ctccggcaac 480

tccttctccg gccagatccc cgactccctc ggccgcctcg accgcctcaa gtcgctcgac 540

ctctccgaca acaggctcga cggccagatc ccgccccagc tcgccacgtt cgggaaggac 600

tccttcgccg gtaacaaggg cctgtgcggc cgccccgtgt cctcgcgatg cggccgcgcg 660

ctgagcggcg cgggcctcgg catcgtcatc gccgcggggg tgttcggagc cgccgcgtcg 720

ctgctcctcg ccttcttctt ctggcgttgc accgggaaga gcaagggcgg tcgccgccgc 780

cgccgcggag ggagcgagtc cggcggcggc tccgcggagg acgggagctg gtgggcggag 840

cggctgcggg cggcgcacaa ccggctggcg cccgtctcgc tgttccagag gccgatcgtc 900

aaggtcaagc tcgccgacct gatggcggcc acccaggact tcagcacgag ccacatcgtg 960

gtggccggga gctcgcgggc ggggacggcg taccgagccg tgctgcgcga cggctccgct 1020

ctgacggtga agcggctcca ctcgtgcccg ttgtcggaga aggcgttccg ggcagagatg 1080

ggacgggttg ggcagctgcg gcaccctaac atcgtgccgc tgctggggtt ctgtgtcgtt 1140

gaggatgagc ggctgcttgt gtacaagcat atggagagtg gagctctttc ttcggtgatg 1200

aaggagccag gggaggcacc gctggattgg gcgacacggc ttcggattgc tgtcggggcg 1260

gcacgcggtc ttgcttggct gcaccatggg ttccaagttc cgcaaattca ccagaatttg 1320

agctcaagtg cagtgcttct ggatgaggac tatgaagctc ggttcataga tgttgggctt 1380

acaaggctgg tccgaatggc accaggcgag ggtggagata caagcccctt cctgaatggg 1440

gacttcgggg agtatgggta tgtcgcccca gagtgtgcta gcaatccagt tgctaccatg 1500

aagggtgatg tgtatgcatt tggtgtgata ctgctcgagc tcgtgagtgg gcaggaggct 1560

gccactgtaa cgggtgatgc ggcaggtgaa ggattcaagg ggacattggt ggattgggta 1620

aatcagctta aggcctccgg ccggatcggt gatgctgttc ataaatcatt gcgtgggaat 1680

ggccatgatt cagagattga tgagtttgtg aagatagctt ttgcgtgtat catggttcac 1740

ccgagggaga ggttctcaat gtaccgggtt taccactctc tgaagagcat tggacagggt 1800

cgtgatgtct cagagcaatt tgatgagttc ccgctggcct ataacaagga tgaatcagat 1860

accatgtaa 1869

<210> 3

<211> 2081

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 3

cgaatttcgg aaaatttgga tgaattttaa tcaaatttaa accaaatttg ataaaaattg 60

gtaaaaatga accatattta ggtgaaatag aagtgaattg ttgtcttgga ccttaccgaa 120

atgggtgaaa ttcaccgaca ttcggacctt tcggaccgaa tcccagaatc ttgaattggt 180

gaacgggaca tcagccgctg tcgtctagct tggttttccc gttaccagct cgtcggcttg 240

attcagctat tgcgtttgca tcatctaaaa cgaggcggtc gagaggatgg ggaatcggga 300

tagtagcgta ggttggtggc ttcaatttta ttttcctcct ccgcgtgttg tgggtgactg 360

ggtgatgggc tcggtagact tggcccgata cgatggcaag cacgtggctg ggcgggggat 420

cgaacggggc agatttttgg gcgacatggc cgcgcgggtg agtgagcagt aacagcgtga 480

ggattataat attttatatg ataagctatt gcatttgcat tattgcatag tatctggctt 540

gcccacaaat aaatcacgct gttaagaggg gttagtcgct gtaaccaaaa acatggttta 600

tactactcta taggttggca aagtttggtt tgtgaaggtt tttttttttt ttgcaagatt 660

ttttaaggat tttagctcgg ttgtgcaagg gcgtggagct cagtggctgc atttacttaa 720

acaaattatt tacatcctca gtttactatg taaaggatca cataaataag aaattaagtt 780

tttgaaaaat aataaatgaa accaattgag aataataata tatatggacc ctcttcctcc 840

tatgtcgtct ctttcgagaa tgacggcaat cagaaattaa ttcaaacgaa tatcagttgg 900

tgttatcgat aaacgaatgt ctctatggca atctgcattt ggatcgaggg ttatgcttaa 960

ttggcacctg caacgagcgt atttcaatta ttgctatctc acgtagagca cacaaccaat 1020

gattcctaag aattgaggtg acggtgcact cctatatgtc cctcaaatat gggacaagaa 1080

aaaatcaagt agagaaaaat tagtcctcaa ttgtactagt gatagagcaa gttgaaaccg 1140

tgcagtatgc catgtggtta gagctcacaa aacttaaacc gtggtaatcc atagatgagc 1200

acacaaaatg accatccaat ccaatgagtt gattcactct cacaacggct tctatttgga 1260

tagcatatat tttatagatt ttccacatga aatagttcca tttctctaaa tttttcagaa 1320

aattcctcct atttaaatag gctcttaagc ttaggcttac gtgccacagc tatagttata 1380

attttcaaac ttaattttag aacatatttt atttttacac acttggattt aaactgctaa 1440

aatagaagtg taaaatctgt actgtaaaat tatttttgtt gcatcaatca tcttttttcc 1500

tctcacaaga cacaacccaa acaatatctt atgaaccatc acaaattcat gatgaagata 1560

tatcttacat taatgacatt tataaacggc tagagacaga ttttcaccca gcccccgaac 1620

tcaattcaat ggcacaacaa ccggactaca ggagacgaat ccacgacgat atgtaagcta 1680

cgcaactcct aaaactctct ttaaaagacg gtagtcctac attgaaaaca ctccttaaac 1740

tccttaacac cgtacaccac agttacaaaa gcacacgtgt cgtggagccc gaaaatcgac 1800

cgagagggaa ggaaccaggc caaaaaaacc gcaccactcc gcgcgcactg tcactgacga 1860

ccacggggac agtagtcacc accaccacca ccactgtggc tcggtcactt cttcccaatc 1920

tcattctcat ctccctcttt tttttccacc aaaaaccaac ccctccccct ccccgtcgca 1980

gcgcggcgca gcccaaccca accccaccaa aacccgcacc accccccatc atccgctcca 2040

cccccccgca gtctggtctc cccacctggt caaaccactc c 2081

Claims (6)

1.氨基酸序列是序列1的蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1）调控水稻株型；

D2）制备调控水稻株型产品；

D3）调控水稻叶倾角；

D4）制备调控水稻叶倾角产品；

D5）培育叶倾角降低水稻；

D6）水稻育种。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：

D1）调控水稻株型；

D2）制备调控水稻株型产品；

D3）调控水稻叶倾角；

D4）制备调控水稻叶倾角产品；

D5）培育叶倾角降低水稻；

D6）水稻育种；

所述生物材料为下述B1）至B14）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；

B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；

B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；

B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B9）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B10）含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B11）含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

B12）含有B4）所述重组载体的转基因植物细胞系；

B13）降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

B14）含有B13）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b1）或b2）：

b1）编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2）序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

B21）所述核酸分子为序列表中序列2的第441-957位所示的核酸分子。

4.一种降低水稻叶倾角的方法，包括：降低受体水稻中权利要求1中所述蛋白质的活性和/或含量，或，抑制权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达，得到与所述受体水稻相比叶倾角降低的目的水稻。

5.一种培育叶倾角降低植株的方法，包括：降低受体水稻中权利要求1中所述蛋白质的活性和/或含量，或，抑制权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达，得到与所述受体水稻相比叶倾角降低的目的水稻。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述目的水稻为通过向所述受体水稻中导入降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子得到的与所述受体水稻相比所述蛋白质表达降低的转基因水稻。

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