CN107353331B - 油体相关蛋白在调控植物蜡质含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了油体相关蛋白在调控植物蜡质含量中的应用。本发明所提供的油体相关蛋白为下述A1)或A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列1所示的蛋白质；A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的油体相关蛋白及其编码基因可以调控植物的蜡质含量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中油体相关蛋白在调控植物蜡质含量中的应用。
背景技术
水稻不仅是重要的模式植物，也是当今世界种植面积最广的粮食作物之一。极端的外部环境已成为限制水稻种植和产量的一个重要因素。其中，高温、干旱等严重影响水稻适应性和生产。植物蜡质作为覆盖在植物地上部分表面的一层疏水屏障，与外部环境关系密切，具有保水、抗辐射、抗病虫害等功能。因此，深入研究调控水稻叶片蜡质含量，对水稻生产具有重要意义。
蜡质的主要成分是长链脂肪酸及其衍生物。长链脂肪酸起源于质体上合成的C16和C18脂肪酸，这些脂肪酸酯化为酰基辅酶A后在内质网上通过脂肪酸延伸酶复合体延长，然后通过初级醇途径和烷烃途径形成蜡质混合物。因此,蜡质代谢与脂肪酸是密不可分的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物叶片中的蜡质含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了油体相关蛋白在调控植物蜡质含量中的应用。
本发明所提供的油体相关蛋白在调控植物蜡质含量中的应用中，所述油体相关蛋白名称是OsHSD1，为下述A1)或A2)或A3)：
A1)氨基酸序列为序列1所示的蛋白质；
A2)在序列1的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，序列1由354个氨基酸组成。
为了使A1)、A2)和A3)中的蛋白质便于纯化，可在A1)、A2)或A3)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
上述A2)中的OsHSD1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的OsHSD1的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用。
本发明所提供的与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，所述生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：
B1)编码OsHSD1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，B1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)或a4)或a5)所示的基因：
a1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
a2)核苷酸序列是序列表中序列3的基因组DNA；
a3)核苷酸序列是序列表中序列3的第3442-10284位的基因组DNA；
a4)与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsHSD1的cDNA分子或基因组DNA分子；
a5)在严格条件下与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsHSD1的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
序列2由1065个核苷酸组成，编码序列1所示的蛋白质。序列3由11417个核苷酸组成，序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284位分别为OsHSD1基因的六个外显子的序列，序列3中OsHSD1基因的六个外显子的序列依次连接得到序列2；序列3的第1-3204位为启动子的序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsHSD1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsHSD1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsHSD1且具有OsHSD1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码OsHSD1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，B2)所述的含有编码OsHSD1的核酸分子的表达盒(OsHSD1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsHSD1的DNA，该DNA不但可包括启动OsHSD1基因转录的启动子，还可包括终止OsHSD1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述OsHSD1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述农杆菌可为农杆菌EHA105。
上述与OsHSD1相关的生物材料在调控植物蜡质含量中的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，OsHSD1的编码基因通过含有OsHSD1的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌EHA105中。所述重组载体为将pCAMBIA2300的BamHI和XhoI识别序列间的DNA替换为序列3所示的DNA分子得到的重组载体pCAMBIA2300-OsHSD1。pCAMBIA2300-OsHSD1表达序列1所示的油体相关蛋白(即OsHSD1)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了OsHSD1或所述生物材料在培育蜡质含量降低植物或制备降低植物蜡质含量产品中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育蜡质含量降低的转基因植物的方法，所述方法包括向受体植物中导入下述1)或2)得到转基因植物；
1)OsHSD1的编码基因；
2)含有OsHSD1的编码基因的表达盒；
所述转基因植物与所述受体植物相比蜡质含量降低。
上述方法中，所述OsHSD1的编码基因可为B1)所述核酸分子；
所述表达盒可为B2)所述表达盒。
在本发明的实施例中，所述OsHSD1的编码基因通过含有所述OsHSD1的编码基因表达盒的OsHSD1基因重组表达载体导入受体植物中。
上述方法中，其中所述OsHSD1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsHSD1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述OsHSD1基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述OsHSD1的编码基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了降低植物蜡质含量的产品，所述产品含有OsHSD1或所述生物材料。
上述产品可以以OsHSD1或所述生物材料作为活性成分，还可以将OsHSD1或所述生物材料与其它可以降低植物蜡质含量的物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为禾本科植物，如水稻(Oryza sativa L.)。
本发明中，所述蜡质含量可为长链脂肪酸及其衍生物的含量，如脂肪酸、链烷烃和/或酯类的含量。所述蜡质含量可为叶片蜡质含量。
实验证明，本发明的OsHSD1及其编码基因可以降低植物叶片中蜡质的含量：将OsHSD1基因导入受体植物中得到的转基因植物蜡质组分总含量为受体植物的0.67倍，差异达到显著水平，表明，OsHSD1基因可以降低水稻叶片中的蜡质含量；将OsHSD1基因导入受体植物中得到的转基因植物的C16、C18、C26、C28与C30脂肪酸含量分别为受体植物的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，与受体植物相比，转基因植物中的C16、C18、C26、C28与C30脂肪酸均有极显著的降低，表明，OsHSD1基因可以降低水稻叶片蜡质中的脂肪酸含量。
附图说明
图1为水稻突变体oshsd1中OsHSD1基因的基因组DNA与日本晴的差异。其中，WT表示日本晴。
图2为T1代转OsHSD1基因oshsd1的鉴定结果。其中，Marker为分子量标准，oshsd1表示转基因受体植物，OsHSD1-C1、OsHSD1-C5和OsHSD1-C6分别表示三个T1代转OsHSD1基因oshsd1株系。
图3为OsHSD1基因的亚细胞定位结果。比例尺为4μm
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻突变体oshsd1为将日本晴中的OsHSD1基因敲除得到的突变体，oshsd1来源于国家作物种质库，统一编号为GD-00127。其中，OsHSD1基因的基因组DNA定位在第11号染色体上分子标记M8和M9间，分子标记M8为利用引物TGCGATGATCACCTGCATAC和GGTGTTACCAACCGGGATTA对日本晴基因组进行扩增得到的PCR产物，分子标记M9为利用引物GCGTGCGCCTTACAAATTA和GTTTTGCAATTGTCGTCGTG对日本晴基因组进行扩增得到的PCR产物，分子标记M8和M9位于同一BAC克隆OSJNBb0019E05上，物理距离约为16.9kb。OsHSD1基因的基因组DNA包含六个外显子与五个内含子，与日本晴相比，水稻突变体oshsd1中OsHSD1基因的基因组DNA的第五个外显子上存在一个单碱基的突变和三个碱基的缺失(图1)。
实施例1、OsHSD1可以调控水稻叶片中蜡质的含量
本实施例提供了来源于日本晴(中国农业科学院国家种质库)的油体相关蛋白及其编码基因(即OsHSD1基因)，油体相关蛋白的名称为OsHSD1，油体相关蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，OsHSD1基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，OsHSD1基因的基因组序列如序列3所示。序列3中，序列3的第3442-3639位、第6939-7131位、第8110-8195位、第8720-8851位、第9527-9691位和第9994-10284位分别为OsHSD1基因的六个外显子的序列；序列3的第1-3204位为启动子的序列。
1、转基因植物的构建
1.1重组载体和重组农杆菌的构建
将载体pCAMBIA2300的EcoRI与PstI识别序列间的片段替换为序列3所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为pCAMBIA2300-OsHSD1。pCAMBIA2300-OsHSD1与pCAMBIA2300的差别仅在于：pCAMBIA2300-OsHSD1为将pCAMBIA2300的Bam HI和Xho I识别序列间的DNA替换为序列3所示的DNA分子得到的重组载体。pCAMBIA2300-OsHSD1表达序列1所示的油体相关蛋白(即OsHSD1)。
将pCAMBIA2300-OsHSD1导入农杆菌EHA105菌株中，得到含有pCAMBIA2300-OsHSD1重组农杆菌，将其命名为EHA105-pCAMBIA2300-OsHSD1；将载体pCAMBIA2300导入农杆菌EHA105菌株中，得到含有载体pCAMBIA2300的重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌EHA105-pCAMBIA2300。
1.2转基因植物的构建
将步骤1.1的EHA105-pCAMBIA2300-OsHSD1菌株转化水稻突变体oshsd1，具体方法为：
(1)28℃培养EHA105-pCAMBIA2300-OsHSD1 16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD600≈0.5，获得菌液；
(2)将培养至一个月的水稻突变体oshsd1成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；
(3)将步骤(2)共培养后的愈伤组织接种在N6固体筛选培养基1(N6固体筛选培养基1为向N6固体培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为100mg/L的培养基)上24℃培养16天进行第一次筛选；
(4)挑取步骤(3)第一次筛选后的健康的愈伤组织转入上述N6固体筛选培养基1上24℃下培养进行第二次筛选，每15天继代一次；
(5)挑取步骤(4)第二次筛选后的健康的愈伤组织转入N6固体筛选培养基2(N6固体筛选培养基2为向N6固体培养基中加入卡那霉素得到的卡那霉素浓度为50mg/L的培养基)上24℃下培养进行第三次筛选，每15天继代一次；
(6)挑取步骤(5)得到的抗性愈伤组织转入水稻分化培养基上24℃下进行分化，得到分化成苗的T0代转OsHSD1基因oshsd1，培养T0代转OsHSD1基因oshsd1并收获其种子，得到T1代转OsHSD1基因oshsd1种子，培养T1代转OsHSD1基因oshsd1种子，得到T1代转OsHSD1基因oshsd1。
按照上述步骤(1)-(6)的方法，将EHA105-pCAMBIA2300-OsHSD1替换为EHA105-pCAMBIA2300，其他步骤均不变，得到T1代转空载体oshsd1。
利用引物5′-AAAATTTTGGAACGAATTTTTCA-3′和5′-TATCATGCGATCATAGGCGTCTC-3′对T1代转OsHSD1基因oshsd1进行鉴定，用oshsd1作为阴性对照，结果如图2所示。结果显示，T1代转OsHSD1基因oshsd1中能扩增出大小约1600bp的目的条带。
2、转基因植物与突变体的表型鉴定
分别将水稻突变体oshsd1、T1代转OsHSD1基因oshsd1和T1代转空载体oshsd1在正常条件下进行培养，利用气相色谱与质谱联用仪分别测定各水稻叶片的蜡质组分(脂肪酸(fatty acids)、伯醇(primary alcohols)、链烷烃(alkanes)和酯类(esters))，结果如表2所示。
利用气相色谱与质谱联用仪测定水稻叶片蜡质组分，具体采用岛津的气质联用工作站进行。检测条件如下：气相-质谱检测器(SHIMADZU,GCMS-QP2010,Japan)，毛细管柱为HP-1MS(Agilent,America)低流失柱，型号为30m×0.32mm×0.25μm，以1.2mL min-1的氦气为载气，柱箱温度50℃，进样口温度250℃，上样1μL。升温程序为：50℃保持2min，然后以20℃min-1升温至200℃，在200℃保持2min，随后以2℃min-1升温至320℃，在320℃保持14min。程序运行结束得到各个样品的scan峰图，对照内标C24出峰位置，推断先后出峰的脂肪酸组分，参照标样的峰面积，确定各个组分的物质的量。
表2、水稻叶片中的蜡质组分含量(单位:μm/cm2)
结果显示，水稻突变体oshsd1和T1代转空载体oshsd1的各蜡质组分含量基本无差异，T1代转OsHSD1基因oshsd1蜡质组分总含量为水稻突变体oshsd1的0.67倍，差异达到显著水平。表明，OsHSD1基因可以降低水稻叶片中的蜡质含量。
结果显示，水稻突变体oshsd1和T1代转空载体oshsd1中的各脂肪酸无显著差异。T1代转OsHSD1基因oshsd1中的C16、C18、C26、C28与C30脂肪酸含量分别为水稻突变体oshsd1转OsHSD1基因植株的0.41、0.44、0.34、0.25和0.41倍，与oshsd1相比，T1代转OsHSD1基因oshsd1中的C16、C18、C26、C28与C30脂肪酸含量均有极显著的降低。表明，OsHSD1基因可以降低水稻叶片蜡质中的脂肪酸含量。
实施例2、OsHSD1基因的亚细胞定位
将载体PAN580(PAN580的序列为序列表中序列4)的Spe1与Xbal识别序列间的片段替换为序列2所示的DNA分子，得到重组载体，将该重组载体命名为PAN580-OsHSD1-GFP。PAN580-OsHSD1-GFP表达序列1所示的油体相关蛋白与GFP融合得到的融合蛋白质，即OsHSD1-GFP。
分别将日本晴与拟南芥的叶肉细胞去细胞壁，分别得到日本晴原生质体与拟南芥原生质体。日本晴原生质体按照如下方法制备：
(1)选取80粒粳稻日本晴种子，经催芽后在密闭的透明塑料盒中，30℃光照培养大约10天左右；
(2)将幼苗茎秆切成1mm大小的节段，放入三角瓶，加10mL用K3溶液配置的酶解液(含有1.5％的Cellulase和0.3％的Macerozyme)；然后置于恒温摇床进行酶解(40rpm，28℃)4h；此段时间内需要镜检，以观察酶解状况；
(3)将酶解液用200目的尼龙膜过滤，固体沉淀转移新的三角瓶中，加入10mLW5溶液，继续恒温轻摇1h；
(4)摇晃结束后，转移5mL上述W5溶液至体积为10mL的塑料试管中，1200rpm、离心4min收集原生质体用于下一步的转化。
将PAN580-OsHSD1-GFP用PEG介导方法分别转化日本晴原生质体与拟南芥原生质体中后进行培养。观察之前，用1mg/mL尼罗红(油体Marker)对转化的原生质体染色10min，然后用W5溶液洗3次。观察融合蛋白质的定位情况如图3所示。结果显示，融合蛋白质定位在油体上。转化程序如下：
(1)先加10μg质粒DNA(PAN580-OsHSD1-GFP)，再轻柔加入200μL的重悬的原生质体，接着缓慢加入220μL的40％浓度PEG4000溶液，轻柔混匀，室温静置10-20min；
(2)加入1mL W5溶液，混匀，150g离心3min，并收集原生质体；
(3)用1mL K3溶液重悬原生质体，28℃、黑暗条件下过夜培养；
(4)使用Zeiss LSM 700激光共聚焦显微镜观察荧光。
Claims (10)
1.油体相关蛋白在调控水稻蜡质含量中的应用；所述油体相关蛋白为氨基酸序列为序列1所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述蜡质含量为长链脂肪酸及其衍生物的含量。
3.与权利要求1所述油体相关蛋白相关的生物材料在调控水稻蜡质含量中的应用；
所述生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述油体相关蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
a1)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
a2)核苷酸序列是序列表中序列3的基因组DNA；
a3)核苷酸序列是序列表中序列3的第3442-10284位的基因组DNA。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于：所述蜡质含量为长链脂肪酸及其衍生物的含量。
6.权利要求1中所述油体相关蛋白或权利要求3或4中所述生物材料在培育蜡质含量降低水稻或制备降低水稻蜡质含量产品中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述蜡质含量为长链脂肪酸及其衍生物的含量。
8.培育蜡质含量降低的转基因水稻的方法，包括向受体水稻中导入下述1)或2)得到转基因水稻；
1)权利要求1中所述油体相关蛋白的编码基因；
2)含有权利要求1中所述油体相关蛋白的编码基因的表达盒；
所述转基因水稻与所述受体水稻相比蜡质含量降低。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述油体相关蛋白的编码基因为权利要求3或4中B1)所述核酸分子；
所述表达盒为权利要求3或4中B2)所述表达盒。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于：所述蜡质含量为长链脂肪酸及其衍生物的含量。
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