CN110950944B - OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明公开了OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用，属于植物基因工程与遗传改良。该水稻转录因子OsHCRF1编码DNA序列如SEQ ID No：1所示，其蛋白产物氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明水稻转录因子可调控水稻株高、穗长、叶绿体发育和叶绿素含量等重要农艺性状，为水稻遗传育种提供了有重大潜在利用价值的基因和应用基础数据。

Description

OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程与遗传改良，具体涉及一种OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用。
背景技术
近年来，水稻功能基因组研究的快速发展，为我国水稻遗传育种鉴定了大量的有重要利用价值的基因，水稻育种正迈向设计育种的新时代（中国稻米，周正平等，2019）。水稻育种的创新发展为我国口粮安全提供了重要保障，提高单产仍是未来一段时期内我国水稻育种的主攻方向。因此仍要继续重视发掘、克隆和鉴定新的水稻重要农艺性状调控基因，为设计育种提供元件，服务于新时期水稻育种的精准化、数据化和智能化战略需求（中国稻米，周正平等，2019）。
根据维基百科（https://en.wikipedia.org/wiki/Homeodomain），典型的DNA结合homeodomain由60个氨基酸长的HTH（helix-turn-helix）结构组成，而TALE（three aminoacid loop extension）homeodomain由63个氨基酸组成。根据这些homeodomain蛋白保守的内元-外元结构以及独特的codomain，分为HD-ZIP I-IV, BEL, KNOX, PLINC, WOX, PHD等14个不同类型。
水稻KNOX 类homeobox基因OSH15功能缺失突变以后，导致植株矮化（The EMBOJournal, Sato et al. 1999）。研究发现BEL1‐LIKE HOMEODOMAIN11（SlBEL11）沉默导致了未成熟的番茄果实中叶绿素的积累（the plant journal, Meng et al. 2018）。RNA-seq分析发现与野生型果实相比， RNAi‐SlBEL11果实中有48个参与叶绿素合成、光合作用和叶绿体发育的基因显著上调表达（the plant journal, Meng et al. 2018）。并证实SlBEL11转录因子可结合到TKN2, CAB 和POR的启动子，直接负调控叶绿体发育和叶绿素合成相关基因的表达（the plant journal, Meng et al. 2018）。
目前相较于BEL, KNOX, WOX和PHD类型的转录因子，homeodomain-like转录因子超家族成员研究报道相对较少，还未见OsHCRF1调控水稻重要农艺性状的相关报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种水稻转录因子功能蛋白、编码基因及其在水稻育种中的应用。
本发明提供的技术方案是：通过基因编辑技术创制OsHCRF1功能缺失突变体，通过转基因过表达技术创制OsHCRF1过表达材料，研究其在调控水稻重要农艺性状方面的功能。
从OsHCRF1编码序列（SEQ ID No：1）选取了一条19 bp的特异编辑靶序列（SEQ IDNo：2），利用T4 DNA Ligase （NEB, Ipswich, MA, USA）构建敲除载体pHUN4c12-OsHCRF1。通过农杆菌介导的转化获得了多个靶序列插入1个碱基的水稻株系。突变的靶序列如SEQID No：3所示。突变产生移码，从N端第161个氨基酸开始与野生型不同，并在第182个氨基酸后提前终止。与由300个氨基酸组成的OsHCRF1蛋白序列（SEQ ID No：4）相比，突变蛋白少了118个氨基酸，且C端22个氨基酸发生改变。突变后氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。
将完整的OsHCRF1编码序列（SEQ ID No：1）通过同源重组方法整合进改造的并经BamHⅠ (NEB)和SacⅠ (NEB)双酶切的pCAMBIA1303载体，使其处于Ubi-1启动子之3’端，受其驱动。利用农杆菌介导的转化获得粳稻品种Kitaake为背景的OsHCRF1过表达转基因株系。
本发明的有益效果是：
1. 本发明克隆到一个调控水稻重要农艺性状的转录因子，其编码DNA序列比NCBI数据库中序列多120bp，是更准确的序列信息。
2. 本发明OsHCRF1是调控株高、穗长、叶绿体发育和叶绿素含量的重要负调控因子。因为这些性状是水稻株型和产量相关的重要性状，本发明对OsHCRF1的功能解析为水稻设计育种增加新的备选基因，具有很大潜在利用价值。
附图说明
图1 — OsHCRF1亚细胞定位。
图2 — OsHCRF1转录激活活性分析。
图3 — OsHCRF1敲除（knockout, KO）水稻株系的鉴定。
图4 — OsHCRF1过表达（overexpression, OE）水稻株系的鉴定。
图5 — OsHCRF1过表达和敲除水稻株系株高存在显著差异。
图6 — 株高统计数据。
图7 — 穗表型。
图8 — 穗长统计数据。
图9 — 水稻叶片叶绿素相对含量。
图10 — 水稻叶片叶绿体超微结构观察（x2.0k）。
图11 — 水稻叶片叶绿体超微结构观察，WT和OE: x5.0k；oshcrf1: x4.0k。
序列列表说明
SEQ ID No：1 — OsHCRF1编码DNA序列。
SEQ ID No：2 — 19bp编辑靶序列。
SEQ ID No：3 — 突变的靶序列。
SEQ ID No：4 — OsHCRF1蛋白序列。
SEQ ID No：5 — OsHCRF1突变蛋白序列。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1
OsHCRF1编码一个功能未知的转录因子
以粳稻品种Kitaake叶片cDNA为模板，克隆到一新的CDS全长序列，在NCBI数据库（National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library ofMedicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA）进行BLAST分析，比已公布的一致性最高的序列多出120bp，全长903bp，如SEQ ID No：1所示。本发明将该903bp编码的基因命名为OsHCRF1。生物信息学分析预测OsHCRF1可能编码homeodomain-like转录因子超家族蛋白。
首先进行OsHCRF1亚细胞定位分析。为做CaMV35S:OsHCRF1-GFP融合构建，采用引物对OsHCRF1-SL（表1），通过RT-PCR扩增OsHCRF1 CDS全长序列，将其利用GBclonartSeamless Cloning Kit (GBI，苏州)同源重组到SacⅠ和KpnⅠ双酶切的pRTL2载体（BMCGenomics, Zhou et al. 2013）。分别将CaMV35S:OsHCRF1-GFP和CaMV35S:GFP（对照）瞬时转化到水稻原生质体细胞，以WI solution [0.6molL−1mannitol,4mmolL−1KCl,and4mmolL−1MES(pH5.7)]在暗处28 °C孵育16-18 h. GFP绿色荧光信号采用Zeiss LSM 700 Metaconfocal microscope（Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany）观察、拍照。如图1白色箭头所示，OsHCRF1在细胞核表达。
酵母转录激活实验证实OsHCRF1具有转录激活活性。采用引物对OsHCRF1-BD（表1）扩增的OsHCRF1 CDS片段通过GBclonart Seamless Cloning Kit克隆到pGBKT7载体，得到pGBKT7-OsHCRF1，转化到Y2H Gold酵母菌株（欧易生物，上海），将OsHCRF1与GAL4 DNA结合功能域融合表达。单独转pGBKT7作为负对照。OsHCRF1与GAL4 DNA结合功能域的融合蛋白表达，与酵母中GAL UAS结合，激活下游报告基因ADE2和His3的转录，能够在SD/-Ade/-His/-Trp的营养缺陷培养基上生长，而只含pGBKT7载体的酵母则不能在该培养基上生长（图2）。由此推断OsHCRF1含转录激活功能域，具有转录激活活性。
综上，证实了OsHCRF1的细胞核定位和转录激活活性，推断OsHCRF1是一个功能未知的转录因子。
实施例2
OsHCRF1敲除载体的构建和OsHCRF1敲除水稻株系的获得
一、敲除载体pHUN4c12- OsHCRF1的构建
利用E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)选定了一条19 bp的特异靶序列用于产生sgRNA（single-guide RNA）。该序列（SEQ ID No：2）位于OsHCRF1全长903 bp CDS序列（SEQ ID No：1）的465-483 bp处（5’- ACCTGATGGATTTTATACA-3’）。合成引物对OsHCRF1-CRIS （表1），采用如下体系将序列5’端加上磷酸基团：
OsHCRF1-CRISF (10 mM) 1μl,
OsHCRF1-CRISR (10 mM) 1μl,
10x T4 DNA Ligase Buffer (with 10 mM ATP) 2 μl,
T4 polynucleotide kinase (3’ phosphatase plus；NEB) 1 μl,
H2O 15 μl.
37°C 40 min, 65 °C 20 min（酶热失活），94 °C 5 min, 50 °C 2 min.
质粒pHUN4c12（In Vitro Mutagenesis，Xu et al. 2017）经BsaⅠ（NEB）酶切，体系如下：
pHUN4c12 3μl (0.3μg/μl),
10x CutSmart Buffer 2μl,
BsaⅠ (NEB) 1μl,
H2O 14 μl.
共3管。37 °C 5 h，65 °C 20 min（酶热失活）。3管酶切液60μl补足至200 μl，加500μl无水乙醇，混匀后放-80 °C 1 h。12000 rpm 12 min 离心沉淀，晾干后加20μl H2O溶解。
然后将加磷酸基团后的OsHCRF1-CRIS引物通过T4 DNA Ligase（NEB）连接到BsaⅠ酶切过的pHUN4c12载体。
二、OsHCRF1敲除水稻株系的获得
将构建好的敲除载体pHUN4c12-OsHCRF1按照产品说明书（热击法）转入农杆菌EHA105 (pSoup)感受态细胞（2nd Lab，上海）。水稻转化工作委托未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司完成。简述如下：将含有pHUN4c12-OsHCRF1的农杆菌EHA105(pSoup)侵染粳稻品种Kitaake愈伤组织，再转到共培养基上24 °C暗培养2-4天，清洗后的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选，经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基7-10天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至2-4 cm时转至生根培养基生长3周。T0代小苗炼苗3天后移栽至土中。收到种子再种下去，得到T1代。
三、OsHCRF1敲除水稻株系的鉴定
首先鉴定T0代转基因水稻株系是否整合进了含OsHCRF1-CRIS的T-DNA片段。以野生型和T0代叶片基因组DNA为模板，用U3bF/UbiR（表1）进行PCR （polymerase chainreaction）扩增，有特异扩增带者为转基因阳性植株。在编辑靶序列两侧设计特异引物OsHCRF1-target（表1），以阳性植株基因组DNA为模板，对其PCR扩增产物测序来检测T0代靶序列。以野生型为对照，T0代鉴定出22株纯合突变体苗和30多株杂合突变体苗。其中21株为图3所示纯合突变，命名为oshcrf1，突变的靶序列如SEQ ID No：3所示。oshcrf1突变产生移码，从N端第161个氨基酸开始与野生型不同，并在第182个氨基酸后提前终止。与由300个氨基酸组成的OsHCRF1蛋白序列（SEQ ID No：4）相比，突变蛋白少了118个氨基酸，且C端22个氨基酸发生改变。突变后氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。T1代突变体用同样的测序方法检测。
表1 实施例所用引物
Figure 295239DEST_PATH_IMAGE001
实施例3
OsHCRF1过表达水稻株系的获得和鉴定
为构建OsHCRF1过表达载体，完整的OsHCRF1编码序列（SEQ ID No：1）采用引物对OsHCRF1-OE（表1）进行RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）扩增。利用GBclonart Seamless Cloning Kit，将经测序验证的扩增片段整合进改造的并经BamHⅠ (NEB)和SacⅠ (NEB)双酶切的pCAMBIA1303载体，使其处于Ubi-1启动子之3’端，受其驱动。与实施例1相同，利用农杆菌介导的转化获得粳稻品种Kitaake为背景的过表达转基因株系。以基因组DNA为模板，用引物对OsHCRF1-C（表1）PCR扩增出外源CDS片段来鉴定阳性转基因系（图4A）。图4B中半定量RT-PCR结果显示过表达转基因系OsHCRF1-OE1和OsHCRF1-OE2中OsHCRF1转录水平显著高于野生型（WT），引物对为OsHCRF1-RT（表1），内对照为Actin1（引物见表1）。
实施例4
OsHCRF1敲除和过表达水稻株系株高和穗长存在显著差异
OsHCRF1过表达水稻株系显著变矮，OsHCRF1敲除后株高增加（图5，图6）。OsHCRF1过表达水稻穗长显著变短，OsHCRF1敲除后穗长略微增加（图7，图8）。表明OsHCRF1是调控株高和穗长的负调控因子。
实施例5
OsHCRF1调控叶绿体发育和叶绿素含量
与野生型和OsHCRF1过表达水稻植株叶片呈较深绿色不同，OsHCRF1过表达水稻植株叶色较浅。用SPAD-502Plus叶绿素计（柯尼卡美能达，上海）测量营养生长中期叶片叶绿素相对含量。如图9所示，OsHCRF1敲除后略微上调叶绿素含量，而过表达则显著下调叶绿素含量。
在中国农业科学院作物科学研究所大型科研仪器设施共享平台，通过HT7700透射电镜（HITACHI，东京）观察叶绿体超微结构。透射电镜样品制备步骤参照平台透射电镜生物样品常规制备步骤：1. 取材，组织块小于1mm3；2. 前固定，2.5%戊二醛，磷酸缓冲液配制（0.1mol l-1，pH 7.2）固定2 h以上；3. 清洗，用0.1 mol l-1磷酸缓冲液漂洗，3-4次，每次15分钟；4. 后固定，1%锇酸固定，磷酸缓冲液配制（0.1 mol l-1，pH 7.2），1-2 h；5. 清洗，用0.1 mol l-1磷酸缓冲液漂洗，3-4次，每次15分钟以上；6. 梯度脱水，30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇（可过夜）、90%醇（两次）、100%丙酮（两次）, 每次10分钟；7. 树脂渗透，100%丙酮:树脂 = 2:1（1 h），100%丙酮:树脂 = 1:1（2 h），100%丙酮:树脂 = 1:2（2 h），纯树脂过夜；8. 包埋，利用包埋模具包埋，如需定位，注意方向；9. 固化，45℃烘箱内12 h，60℃烘箱内48 h；10. 超薄切片，超薄切片机切片，厚度70 nm；11. 铅铀双染色，2%醋酸双氧铀染色10分钟，柠檬酸铅染色3分钟；12. 电镜观察。如图10和图11所示，与野生型水稻叶片叶绿体相比，OsHCRF1过表达材料叶绿体体积小，oshcrf1突变体材料叶绿体体积大且含有较多的淀粉粒。暗示这些水稻材料在光合效率方面存在差异。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 1
atggccgccg attccagcat gggattccat caggggatca cggcctcgat gtacaaccat 60
cacatgctct ccttccaatc taacagcgac ttgggcggtg gcgccggcgc tgcggccggt 120
atggtgatgg ccccgaggag catgaacggg actagtagca gcgctgggct gttcgtctct 180
ccgaacaccg gtgtgctggg caacgcatcg gtggccggcc cgtcgaggag ctcgtcgggg 240
gatgcgttca gtagcacggt ggcgcccaag tacaagttcg tcactggttc gccttcagat 300
tggaatgacc gtgagctgaa cacactgaag gaagggcttg tgagatatgc tcgcgaaccg 360
aatatcatga agtacataaa aatagcagct atgctaccca acaggactgt cagggatgtt 420
gcattgcggt gttggtgggc tacaagtaaa gatagaagga agaaacctga tggattttat 480
acagggaaaa agataagaga catgaagcca atccaggaca agatggttgc atctgcctcc 540
atggctaatt ttcacctggc acctgcaaac actgtgaccc ctttctcaat atcgatgcaa 600
catacaaatc agcaatgtca ggttcctaag gaagaagttc ctgtcgtgga tagtgcaaca 660
cagcatctcc tggaagaaaa caatcattta ctcaaccaaa tcgccacaaa tatcgaaaca 720
ttcaagacgg gagagaacac ggatctcttt tttcggacaa acaacaactt caaaaatatt 780
ttaagcagaa tgagcgagac gcctggtatc atgggccaga tgccccaatt gccagtgcaa 840
gtaaacgaag accatctgag ttcacttctt cagctggaca gaatggtaag aggggacccg 900
taa 903
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
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<210> 4
<211> 300
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 4
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1 5 10 15
Met Tyr Asn His His Met Leu Ser Phe Gln Ser Asn Ser Asp Leu Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Met Val Met Ala Pro Arg Ser Met
35 40 45
Asn Gly Thr Ser Ser Ser Ala Gly Leu Phe Val Ser Pro Asn Thr Gly
50 55 60
Val Leu Gly Asn Ala Ser Val Ala Gly Pro Ser Arg Ser Ser Ser Gly
65 70 75 80
Asp Ala Phe Ser Ser Thr Val Ala Pro Lys Tyr Lys Phe Val Thr Gly
85 90 95
Ser Pro Ser Asp Trp Asn Asp Arg Glu Leu Asn Thr Leu Lys Glu Gly
100 105 110
Leu Val Arg Tyr Ala Arg Glu Pro Asn Ile Met Lys Tyr Ile Lys Ile
115 120 125
Ala Ala Met Leu Pro Asn Arg Thr Val Arg Asp Val Ala Leu Arg Cys
130 135 140
Trp Trp Ala Thr Ser Lys Asp Arg Arg Lys Lys Pro Asp Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Lys Ile Arg Asp Met Lys Pro Ile Gln Asp Lys Met Val
165 170 175
Ala Ser Ala Ser Met Ala Asn Phe His Leu Ala Pro Ala Asn Thr Val
180 185 190
Thr Pro Phe Ser Ile Ser Met Gln His Thr Asn Gln Gln Cys Gln Val
195 200 205
Pro Lys Glu Glu Val Pro Val Val Asp Ser Ala Thr Gln His Leu Leu
210 215 220
Glu Glu Asn Asn His Leu Leu Asn Gln Ile Ala Thr Asn Ile Glu Thr
225 230 235 240
Phe Lys Thr Gly Glu Asn Thr Asp Leu Phe Phe Arg Thr Asn Asn Asn
245 250 255
Phe Lys Asn Ile Leu Ser Arg Met Ser Glu Thr Pro Gly Ile Met Gly
260 265 270
Gln Met Pro Gln Leu Pro Val Gln Val Asn Glu Asp His Leu Ser Ser
275 280 285
Leu Leu Gln Leu Asp Arg Met Val Arg Gly Asp Pro
290 295 300
<210> 5
<211> 182
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
<400> 5
Met Ala Ala Asp Ser Ser Met Gly Phe His Gln Gly Ile Thr Ala Ser
1 5 10 15
Met Tyr Asn His His Met Leu Ser Phe Gln Ser Asn Ser Asp Leu Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Met Val Met Ala Pro Arg Ser Met
35 40 45
Asn Gly Thr Ser Ser Ser Ala Gly Leu Phe Val Ser Pro Asn Thr Gly
50 55 60
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180

Claims (1)

1.水稻转录因子OsHCRF1功能蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻转录因子OsHCRF1功能蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：4所示，基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示；
所述OsHCRF1功能蛋白及其编码基因用于调控株高；
所述OsHCRF1功能蛋白及其编码基因用于调控穗长；
所述OsHCRF1功能蛋白及其编码基因用于调控叶绿体发育和叶绿素含量。
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