CN110527687A

CN110527687A - 一种水稻转录因子基因Osspl10及其应用

Info

Publication number: CN110527687A
Application number: CN201910771570.3A
Authority: CN
Inventors: 田大成; 孙晓光; 张小辉
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻转录因子Osspl10基因及其应用。本发明公开了水稻Ospl10基因的核苷酸序列及其编码的一个SPL家族转录因子的核苷酸序列。本发明中的Osspl10基因移码突变和缺失突变的敲除突变体水稻植株表现出株高、分蘗数和穗型大小的显著降低。这些结果表明Osspl10基因会显著影响水稻产量相关性状，在水稻性状改良领域可能具有重要价值。

Description

一种水稻转录因子基因Osspl10及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻转录因子基因Osspl10及其应用。

背景技术

水稻((Oryza sativa)是一种重要的经济作物，为全世界超过一半的人口提供了主食。作为世界上最大的稻米生产国，我国产出的稻米占据世界稻米总产量的五分之二。国内粮食总产量的约30％为稻米，水稻生产在国民经济中占据重要的地位。

为了满足日益增长的人口对粮食的需求，水稻的性状改良始终是植物学领域的热门研究课题。随着高通量测序和分子生物学技术的不断进步，水稻功能基因组学的重大研究突破正不断为性状改良提供新的理论依据。其中株型和结实率作为影响水稻产量的重要因素，研究其调控机制和鉴定关键基因对于作物培育具有重要指导意义。

SPL(Squamosa promoter binding like)基因家族是一类广泛存在于陆生植物中的转录因子，其在植物生长发育过程中起关键的调控作用。SPL基因家族的特征为编码蛋白中的高度保守SBP结构域(SQUA promoter-binding protein domain)。SBP结构域中具有一个的锌指模体结构，其中包含序列为Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-His的两个锌离子结合位点。目前在大多数陆生植物中都检测到了SPL基因家族的存在，而其他真核生物如真菌和动物中则并不存在SPL基因。

不同的SPL基因在不同发育阶段对植物的生长进行调控。目前对拟南芥、小麦和水稻等众多物种中的SPL基因的研究已取得一系列进展。SPL转录因子控制了植物器官发生、铜离子积累、植物抗逆性和开花结实等过程的发生。在单子叶植物水稻中目前共检测出个19个SPL基因，其中仅有部分基因的功能已被揭示。如Osspl3调控不定根的形成过程；Osspl7同时影响水稻的分蘗、株高和根系发育；Osspl8调控叶片结构形成，参与叶舌发育等过程；Osspl13和Osspl16调控种子的形成过程，并会影响稻米的形状和直径；Osspl14和Osspl17均会调控水稻植株的分蘗和穗长等性状。

SPL家族基因常具有影响作物的生长和产量相关性状的功能，然而水稻中的许多SPL基因的功能目前仍有待研究。研究未知功能的SPL基因可以帮助我们了解水稻不同发育阶段的调控机制，深入解析这些调控机制对于植株外在性状的影响情况，为水稻的高产和优良性状育种提供有力支持。

目前，关于水稻SPL基因缺乏系统性的研究，尚无关于水稻中的Osspl10基因的功能和影响性状的相关报道，对于水稻转录因子基因Osspl10功能及其对产量相关性状的影响仍旧缺乏了解。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，本发明提供了一种改良水稻性状的水稻转录因子基因Osspl10及其应用。

本发明的另一个目的是提供Ospl10基因的序列和其编码的蛋白质序列。

本发明的另一个目的是提供上述基因的CRISPR/Cas9载体及载体构建和应用体系。

本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种水稻转录因子基因Osspl10，所述的水稻转录因子基因Osspl10具有如下核苷酸序列：

(1)所述的水稻转录因子基因Osspl10的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或

(2)所述的核苷酸序列是与SEQ ID NO:1所示的DNA序列在相似度上≥95％相似的核苷酸序列，或

(3)所述的核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1所示DNA序列的亚片段，或如SEQID NO:1所示的DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明涉及水稻的Osspl10基因的DNA片段。此基因的DNA片段如序列表SEQ IDNO:1所示。Osspl10基因可以编码一个SPL家族的转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。Osspl10基因编码的转录因子具有一个主要的SBP结构域。此结构域中包含一个可结合特定DNA序列的锌指模体结构。

根据本发明提供的Osspl10基因的序列信息(SEQ ID NO:1)，可以通过以下方法获得与Osspl10基因对应的靶位点：(1)通过数据库检索获得基因CDS区域的外显子序列；(2)以Osspl10基因片段为探针筛选水稻的cDNA文库获得。

本发明所述水稻转录因子基因Osspl10的序列编码的蛋白。

进一步地，所述的蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)所述的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或

(2)所述的氨基酸序列是与SEQ ID NO:2所示的序列经过替换、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。

本发明的含有所述的水稻转录因子基因Osspl10的CRISPR/Cas9载体。根据靶位点的序列设计sgRNA序列并合成相应引物sgRNA-F/sgRNA-R，并使用pRGEB31质粒为载体构建CRISPR/Cas9二元表达载体。此后，使用携带载体质粒的根瘤农杆菌介导水稻品系TP309的遗传转化，并对获得的敲除突变体进行PCR鉴定和表型记录。本发明通过CRISPR/Cas9体系，获得Osspl10基因移码突变和缺失突变的敲除突变体水稻植株。突变体表现出株高、分蘗数和穗型大小的显著降低，这些结果表明Osspl10基因在水稻性状改良领域可能具有重要价值。本发明提供的Osspl10基因可用于其他调控元件，如与组成型启动子共同构建表达载体，或通过RNAi、反义RNA等技术对其操控，以调控水稻的株型和性状。

本发明的含有所述的转化载体的宿主细胞根癌农杆菌EHA105。

本发明的含有所述的转化载体在转基因植物育种中的应用。

本发明的所述的水稻转录因子基因Osspl10在水稻性状改良育种中的应用。

有益效果：本发明中的Osspl10基因移码突变和缺失突变的敲除突变体水稻植株表现出株高、分蘗数和穗型大小的显著降低。这些结果表明Osspl10基因会显著影响水稻产量相关性状，在水稻性状改良领域可能具有重要价值。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

(1)本发明Osspl10基因与影响稻米产量的重要性状相关，有助于阐明水稻分蘖和穗型变化的调控分子机制，促进优良水稻品系的育种。对培育高产水稻，或通过转基因方法对其他作物进行性状改良具有很大的应用潜力和广泛的用途。

(2)本发明利用CRISPR/Cas9体系，首次提出了Osspl10基因对水稻株型和穗型的显著影响情况。水稻转录因子基因Osspl10的敲除突变株系表现出产量相关特性的显著改变，说明Osspl10是控制水稻植株孕穗和分蘖过程的关键调节因子。转化载体可以应用于水稻株型和产量的性状改良，在作物育种领域具有重要应用价值。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为CRISPR/Cas9载体结构图；

图2为靶点敲除突变示意图；

图3为转基因与野生型植株的株高和穗型对比图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例1

本发明的一种水稻转录因子基因Osspl10，所述的水稻转录因子基因Osspl10具有如下核苷酸序列：

本发明所述水稻转录因子基因Osspl10的序列编码的蛋白。

所述的蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)所述的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或

本发明含有所述的水稻转录因子基因Osspl10的CRISPR/Cas9载体。根据靶位点的序列设计sgRNA序列并合成相应引物sgRNA-F/sgRNA-R，并使用pRGEB31质粒为载体构建CRISPR/Cas9二元表达载体。此后，使用携带载体质粒的根瘤农杆菌介导水稻品系TP309的遗传转化，并对获得的敲除突变体进行PCR鉴定和表型记录。本发明通过CRISPR/Cas9体系，获得Osspl10基因移码突变和缺失突变的敲除突变体水稻植株。突变体表现出株高、分蘗数和穗型大小的显著降低，这些结果表明Osspl10基因在水稻性状改良领域可能具有重要价值。本发明提供的Osspl10基因可用于其他调控元件，如与组成型启动子共同构建表达载体，或通过RNAi、反义RNA等技术对其操控，以调控水稻的株型和性状。

本发明的含有所述的转化载体的宿主细胞根癌农杆菌EHA105。

本发明的含有所述的转化载体在转基因植物育种中的应用。

实施例2

Osspl10基因的靶点设计

如图1至图3所示，利用TP309基因组和公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)为参考序列，根据CRISPR/Cas9系统特异性识别序列的特点，编写perl语言程序筛选合适的靶点，并对符合条件的结果进行人工筛查，选取特异性最好且位于基因前端外显子序列的位点作为后续实验的靶点。

实施例3

CRISPR/Cas9表达载体的构建

对靶点序列及互补序列添加酶切后的粘性末端序列和保护碱基，做为引物序列sgRNA-F/sgRNA-R并进行人工合成。sgRNA-F/sgRNA-R序列参见序列表，sgRNA-F序列如SEQID NO:3，sgRNA-R序列如SEQ ID NO:4。取合成的引物sgRNA-F/sgRNA-R各4μM稀释至25μL体系，于如下程序进行退火反应：95℃3min；95℃～25℃缓慢冷却；-1℃30S；16℃5min。

对退火后的引物双链DNA片段进行进一步磷酸化处理。磷酸化反应体系如下：10×T4核苷酸激酶缓冲液2μL；T4核苷酸激酶2μL；ATP(10mMol)5μL；已退火的DNA片段11μL。磷酸化反应程序如下：37℃60min；70℃10min。

同时，取载体质粒进行酶切。酶切的反应体系如下：10×内切酶缓冲液5μL；BsaI酶2μL；载体质粒20μL；SEQ ID NO:4H2O 23μL。酶切的反应条件如下：37℃8h。酶切后的质粒需进行一次割胶回收和纯化。

取纯化的酶切载体质粒(载体质粒结构见图2)和磷酸化的双链引物DNA于如下反应体系进行连接：10×缓冲液1μL；T4连接酶1μL；酶切载体6μL；磷酸化的双链DNA 2μL。连接反应条件如下：15℃10h。

取2μL连接反应液加入到200μl农杆菌感受态中混匀，冰浴5min后于液氮中冷冻60s，再于37℃水浴5min。向农杆菌细胞中加入500μl YEB液体培养基于28℃振荡培养过夜，涂在含利福平和卡那霉素的的YEB平板上28℃培养2天。对所得阳性菌落进行挑菌培养备用。

实施例4

水稻的遗传转化

使用携有CRISPR/Cas9表达载体的根瘤农杆菌EHA105侵染水稻胚性愈伤组织，以获得多个独立的转化个体。

实施例5

转基因植株的分子检测和性状测定

取转化体植株叶片提取DNA。以此DNA为模板，使用潮霉素抗性基因及Osspl10基因的特异性引物进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参见序列表，正向引物序列如SEQID NO:5；反向引物序列如SEQ ID NO:6。Osspl10基因引物序列参见序列表，正向引物序列如SEQ ID NO:7；反向引物序列如SEQ ID NO:8。对Osspl10基因PCR反应的产物进行Sanger测序，并对结果分析可得突变体敲除位点情况(图2)。

于水稻灌浆期观察并记录突变体和野生型的株型和穗型的具体表型情况(图3)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种水稻转录因子基因Osspl10及其应用

<130> 2019

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2172

<212> DNA

<213> 稻属水稻 (Orysa sativa L.)

<400> 1

ctgccttttt aaccacccct gcattgcaac ccctcctcct cctctcctgc aagctcacac 60

actagcttag cttagccacc tcactcacta gctcactcta gctcgagctc cacttcgttg 120

gaagccacca cgccacgacg gcgacggcgg cggcgaggag gaggcgggca tgatgagcgg 180

taggatgaac gcggcggggg acgagtcgcc gttcccgttc ggggcgatgc aggcgccggg 240

gccgggggcg tacgtcgggt tcgaccatgg cgcggcggcg gtggcggcgg cggctgcggc 300

ggcgcagcgg gcggggatgc tgcagcacca ccaccaccac atgtacgacg gcttggactt 360

cgcggcggcg atgcagttcg gcggcgggca ggacgcgccg ccgcacccgc agctgctggc 420

gctgccgccg agcatggcgg cgccgccgcc gccgcccatg ccgatgccgc tgcagatgcc 480

catgacgatg ccgatgcccg gagacgtgta cccggcgctc ggcatcgtga agcgcgaggg 540

cgggggcgga ggtcaggacg ccgccgccgg gaggatcggg ctcaacctcg gccgccggac 600

ctacttctcc cccggcgaca tgctcgccgt cgaccgcctc ctcatgcgct cccgcctcgg 660

cggcgtgttc ggcctcggct tcggcggcgc ccaccaccag ccacctcgct gccaggccga 720

gggctgcaag gccgacctct ccggcgccaa gcactaccac cgccgccaca aggtctgcga 780

gtaccacgcc aaggcctccg tcgtcgccgc ctccggcaag cagcagcgct tctgccagca 840

atgcagcagg taagctactg ctccgccatc accgtgctac agcgtgtcgc catgattcgc 900

tgtacttgct ttcttgaatt ctttctctcg ccatgaccgg tctcgggatc gatggagaga 960

gagagagaga caagcggaaa atcgcgcagg aatcgaacga aaagctgcga gctagtagct 1020

gccaactttt tcttgattcc tcctctcttt ctgcactgcc acgatgcgac gatggtctgt 1080

gcgtatctct ctgcgtcgcc tgcatgatat gcttttcttt ttgagttttt ctctctcttt 1140

atctctgctg ctgctgctgc tgttactgcc atcccatcca cgcattgacc aatgcagcag 1200

cattattcgt atagtgtact acgtatagta tgttgtgtga tgtacacgtt ttaatctaca 1260

gaattgtgac attgtgggtg tacgtacatg tgttggatag gtttcacgtg ctcacggagt 1320

ttgatgaggc caagaggagc tgccggaagc ggctggcgga gcacaaccgt cgccggcgga 1380

agccggcggc ggcggcgacg accgccgtgg cggcggccaa ggacgcggcg gcggcgccgg 1440

tagccgccgg gaagaagcct agcggcggcg ccgccacgtc ttacaccggt gacaacaaga 1500

gtaagctcta atcgatgacg ctagatagct gtaataattg gctgtattac ctgagcaaag 1560

gccgggattc tattctatta tctaaaaaaa aagattgcat tctctgctac actctgccgt 1620

tcgtttttaa catgaactga tcgattaatt gatgcagacg tggtgtccat gagcgcggcc 1680

aagtcgccca tctcgtcgaa caccagcgtg atcagctgcc tgcccgagca gggcaagcat 1740

gcggcggcgg cggcgaggcc gacggcgctc acgctcggcg gcgcgccgcc gcacgagagc 1800

tccgcgccgc agatcggcgc catgctccat caccaccacc atcaccagca agaccacatg 1860

caggtgagct ccctggtcca catcaatggc ggcggcggcg gcggtagcaa caacatcttg 1920

tcgtgctcgt cggtgtgctc cagcgcgctg ccgtcgacgg cgaccaacgg cgaggtatca 1980

gaccagaaca acgacaacag ccacaacaat ggcggcaaca acaacaacat gcatctgttc 2040

gaggtcgact tcatgtagag ctttacctta gcttagctac ttcaattcct actcgatcct 2100

accatgtgtt cgtgtcattt cacctcttgt gtagctaaaa gtaaaaaaag aagggagagc 2160

agaaaagggt at 2172

<210> 2

<211> 426

<212> PRT

<213> 稻属水稻 (Orysa sativa L.)

<400> 2

Met Met Ser Gly Arg Met Asn Ala Ala Gly Asp Glu Ser Pro Phe Pro

1 5 10 15

Phe Gly Ala Met Gln Ala Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Val Gly Phe Asp

20 25 30

His Gly Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Arg Ala

35 40 45

Gly Met Leu Gln His His His His His Met Tyr Asp Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Ala Ala Ala Met Gln Phe Gly Gly Gly Gln Asp Ala Pro Pro His Pro

65 70 75 80

Gln Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Met Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro

85 90 95

Met Pro Met Pro Leu Gln Met Pro Met Thr Met Pro Met Pro Gly Asp

100 105 110

Val Tyr Pro Ala Leu Gly Ile Val Lys Arg Glu Gly Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Gln Asp Ala Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Asn Leu Gly Arg Arg Thr

130 135 140

Tyr Phe Ser Pro Gly Asp Met Leu Ala Val Asp Arg Leu Leu Met Arg

145 150 155 160

Ser Arg Leu Gly Gly Val Phe Gly Leu Gly Phe Gly Gly Ala His His

165 170 175

Gln Pro Pro Arg Cys Gln Ala Glu Gly Cys Lys Ala Asp Leu Ser Gly

180 185 190

Ala Lys His Tyr His Arg Arg His Lys Val Cys Glu Tyr His Ala Lys

195 200 205

Ala Ser Val Val Ala Ala Ser Gly Lys Gln Gln Arg Phe Cys Gln Gln

210 215 220

Cys Ser Arg Phe His Val Leu Thr Glu Phe Asp Glu Ala Lys Arg Ser

225 230 235 240

Cys Arg Lys Arg Leu Ala Glu His Asn Arg Arg Arg Arg Lys Pro Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Ala Ala Ala Lys Asp Ala Ala Ala Ala

260 265 270

Pro Val Ala Ala Gly Lys Lys Pro Ser Gly Gly Ala Ala Thr Ser Tyr

275 280 285

Thr Gly Asp Asn Lys Asn Val Val Ser Met Ser Ala Ala Lys Ser Pro

290 295 300

Ile Ser Ser Asn Thr Ser Val Ile Ser Cys Leu Pro Glu Gln Gly Lys

305 310 315 320

His Ala Ala Ala Ala Ala Arg Pro Thr Ala Leu Thr Leu Gly Gly Ala

325 330 335

Pro Pro His Glu Ser Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ala Met Leu His His

340 345 350

His His His His Gln Gln Asp His Met Gln Val Ser Ser Leu Val His

355 360 365

Ile Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Asn Asn Ile Leu Ser Cys Ser

370 375 380

Ser Val Cys Ser Ser Ala Leu Pro Ser Thr Ala Thr Asn Gly Glu Val

385 390 395 400

Ser Asp Gln Asn Asn Asp Asn Ser His Asn Asn Gly Gly Asn Asn Asn

405 410 415

Asn Met His Leu Phe Glu Val Asp Phe Met

420 425

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 稻属水稻 (sgRNA-F引物序列)

<400> 3

ggcagcgcct gcatcgcccc gaac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 稻属水稻 (sgRNA-R引物序列)

<400> 4

aaacgttcgg ggcgatgcag gcgc 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 稻属水稻 (潮霉素抗性基因的上游引物序列)

<400> 5

ctgctccata caagccaacc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 稻属水稻(潮霉素抗性基因的下游引物序列)

<400> 6

tgtcctgcgg gtaaatagc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 稻属水稻 (Osspl10基因上游引物序列)

<400> 7

tcctgcaagc tcacacacta 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 稻属水稻(Osspl10基因下游引物序列)

<400> 8

aagccgtcgt acatgtggt 19

Claims

1.一种水稻转录因子基因Osspl10，其特征在于：所述的水稻转录因子基因Osspl10具有如下核苷酸序列：

(3)所述的核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1所示DNA序列的亚片段，或如SEQ IDNO:1所示的DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

2.权利要求1所述水稻转录因子基因Osspl10的序列编码的蛋白。

3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于：所述的蛋白具有如下氨基酸序列：

(1)所述的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或

4.含有权利要求1所述的水稻转录因子基因Osspl10的CRISPR/Cas9载体。

5.含有权利要求4所述的转化载体的宿主细胞根癌农杆菌EHA105。

6.含有权利要求4所述的转化载体的在转基因植物育种中的应用。

7.权利要求1所述的水稻转录因子基因Osspl10在水稻性状改良育种中的应用。