CN112725358A - OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用，涉及分子生物技术领域。本发明通过RNAi技术沉默水稻中的OsBZR1获得OsBZR1超低表达的水稻，同时通过构建OsBZR1过表达植株OsBZR1OX，与野生型水稻相比，OsBZR1RNAi水稻植株均更易感病，OsBZR1OX更抗病，表明OsBZR1基因参与调控水稻纹枯病抗性。

Description

OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用。

背景技术

由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻纹枯病作为一种全球性土传病害，主要危害叶鞘、叶片，具有发病面积广、频率高、危害大的特点，是我国水稻三大病害之一。随着20世纪60年代我国水稻种植模式的改变，矮秆、密植、高氮肥等高产栽培技术的推广，以及近几年直播稻、套播稻面积的不断上升，水稻纹枯病的发生呈逐年加重的趋势。近年来减产量高达6％～11％，严重的甚至减产25％～35％。培育和推广抗病品种是防治作物病害最科学有效的方法，然而由于纹枯病抗性品种匮乏，目前在农业生产上，化学药剂仍为主要防治手段，然而却存在农药残留、环境污染、诱导耐药性等弊端，严重制约粮食的绿色安全生产。因此，培育稳定的抗病品种迫在眉睫。近年来转基因技术以其周期短、效率高等特点已经被广泛应用于水稻育种，大量基于转基因育种技术的水稻抗病及高产新品种。目前，由于我国抗纹枯病水稻种质资源的缺乏，还未发现对纹枯病高抗或免疫的水稻品种。因此，挖掘水稻纹枯病抗性相关基因，利用转基因育种技术改变抗性相关基因表达对水稻抗纹枯病种质资源创制和纹枯病的有效防控具有重要意义。

BR(brassinosteroid,BR)是一种重要的甾醇类植物激素，影响植物的生长发育、种子萌发、光形态建成，以及对生物胁迫和非生物胁迫的响应。BR信号是由BRI1受体激酶及其下游的信号转导级联介导的，导致BZR1家族转录因子的去磷酸化和激活。BZR1属于bHLH家族成员，其N端序列高度保守具有DNA结合功能，去磷酸化的BZR1蛋白进入细胞核后通过结合靶基因启动子的BRRE元件(CGTGT/CG)或G-box(CACGTG)调节相关基因表达。研究表明BZR1作为BR信号的重要转录因子在BR调控的植物免疫中发挥关键作用。此外BZR1也可独立于BR信号外，通过和其它转录调控因子互作调控下游基因的表达。因此BZR1具有重要分子靶点潜质，但BZR1编码基因与水稻纹枯病抗性间的关系尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用，抑制所述OsBZR1基因表达得到的突变体更易感病，过表达所述OsBZR1基因得到的突变体更抗病，因此所述OsBZR1基因可正向调控水稻对纹枯病的抗性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了OsBZR1基因在调控水稻纹枯病抗性中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述OsBZR1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了OsBZR1基因编码的蛋白质在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了过表达OsBZR1基因在增强水稻纹枯病抗性中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种增强水稻纹枯病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)以水稻RNA反转录后得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物为引物对进行PCR扩增，得扩增产物；

(2)将所述扩增产物连接进PGA1611载体的HindIII和BamHI酶切位点间，得到过表达载体；

(3)将所述过表达载体通过农杆菌介导的转化转入水稻中，获得纹枯病抗性增强的转基因水稻。

优选的，步骤(1)所述PCR的体系以50μl计，包括：5×SF buffer10μl、dNTP mix1μl、模板cDNA1μl、上游引物2μl、下游引物2μl、PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase1μl、DMSO 2μl、5×PCR Enhancer10μl和余量的ddH₂O。

优选的，所述PCR的程序包括98℃预变性3min；98℃变性10s，66℃退火20s，72℃延伸30s，循环32次；72℃延伸10min。

本发明提供了OsBZR1基因在调控水稻纹枯病抗性中的应用，通过RNAi技术沉默水稻中的OsBZR1获得OsBZR1超低表达的水稻，同时通过构建OsBZR1过表达植株OsBZR1 OX，与野生型水稻相比，OsBZR1 RNAi水稻植株均更易感病，OsBZR1 OX更抗病，表明OsBZR1基因参与调控水稻纹枯病抗性。

附图说明

图1为OsBZR1 RNAi和过表达使用的载体图谱；

图2为野生型(WT)、OsBZR1基因沉默和过表达植株的差异图，其中A表示OsBZR1表达差异图，B表示叶鞘接种纹枯病菌表型差异，C表示病斑面积占叶鞘面积百分比。

具体实施方式

本发明提供了OsBZR1基因在调控水稻纹枯病抗性中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ATGACGTCCGGGGCGGCGGCGGCGGGGAGGACGCCGACGTGGAAGGAGAGGGAGAACAACAAGAGGCGGGAGCGGCGGCGGCGTGCCATCGCCGCCAAGATCTTCACGGGGCTCCGGGCGCTCGGGAACTACAACCTCCCCAAGCACTGCGACAACAACGAGGTGCTCAAGGCGCTCTGCCGCGAGGCCGGCTGGGTTGTCGAGGACGACGGCACCACCTACCGCAAGGGATGTAAGCCGCCGCCATCGTCGGCTGGGGGAGCGTCGGTGGGGATGAGCCCCTGCTCGTCAACGCAGCTGCTGAGCGCGCCGTCGTCGTCGTTCCCGAGCCCGGTGCCGTCGTACCACGCGAGCCCGGCGTCGTCGAGCTTCCCGAGCCCCAGCCGGATCGACAACCCGAGCGCCTCCTGCCTCCTCCCGTTCCTCCGGGGGCTCCCCAACCTCCCGCCGCTCCGCGTCTCCAGCAGCGCGCCCGTCACGCCGCCGCTCTCGTCGCCGACGGCGTCGCGGCCGCCCAAGATCAGGAAGCCGGACTGGGACGTCGACCCGTTCCGGCACCCCTTCTTCGCGGTCTCCGCGCCGGCGAGCCCCACCCGCGGCCGCCGCCTCGAGCACCCGGACACGATACCGGAGTGCGACGAGTCCGACGTCTCCACGGTGGACTCCGGCCGGTGGATCAGCTTCCAGATGGCCACGACGGCGCCGACGTCGCCCACCTACAACCTCGTCAACCCGGGCGCCTCCACCTCCAACTCCATGGAGATAGAAGGGACGGCCGGCCGAGGCGGCGCGGAGTTCGAGTTCGACAAGGGGAGGGTGACGCCATGGGAGGGCGAGAGGATCCACGAGGTCGCCGCCGAGGAGCTCGAGCTCACGCTCGGCGTCGGCGCGAAATGA。

本发明所述OsBZR1基因编码的蛋白质的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：MTSGAAAAGRTPTWKERENNKRRERRRRAIAAKIFTGLRALGNYNLPKHCDNNEVLKALCREAGWVVEDDGTTYRKGCKPPPSSAGGASVGMSPCSSTQLLSAPSSSFPSPVPSYHASPASSSFPSPSRIDNPSASCLLPFLRGLPNLPPLRVSSSAPVTPPLSSPTASRPPKIRKPDWDVDPFRHPFFAVSAPASPTRGRRLEHPDTIPECDESDVSTVDSGRWISFQMATTAPTSPTYNLVNPGASTSNSMEIEGTAGRGGAEFEFDKGRVTPWEGERIHEVAAEELELTLGVGAK*。

在本发明中，抑制所述OsBZR1基因表达获得的突变体植株(OsBZR1RNAi)，相较于野生型植株，更易感水稻纹枯病；过表达所述OsBZR1基因获得的突变体植株(OsBZR1 OX)相较于野生型植株，更抗水稻纹枯病，所以OsBZR1基因参与调控水稻对纹枯病的抗性。

本发明还提供了OsBZR1基因编码的蛋白质在调控水稻抗纹枯病中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述应用中，OsBZR1基因编码的蛋白质的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了过表达OsBZR1基因在增强水稻纹枯病抗性中的应用，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对所述过表达OsBZR1基因的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规过表达方法即可。在本发明实施例中，优选通过构建过表达载体的方法使所述OsBZR1基因过表达，，更优选的将SEQ ID NO.1所示序列的5′末端第981位至1327位核苷酸连接进PGA1611载体的HindIII和BamHI位点之间，从而获得过表达载体，而后通过农杆菌介导的转化法获得增强水稻纹枯病抗性的转基因植物。

本发明还提供了一种增强水稻纹枯病抗性的方法，包括以下步骤：(1)以水稻RNA反转录后得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物为引物对进行PCR扩增，得扩增产物；

(2)将所述扩增产物连接进PGA1611载体的HindIII和BamHI酶切位点间，得到过表达载体；

(3)将所述过表达载体通过农杆菌介导的转化转入水稻中，获得纹枯病抗性增强的转基因水稻。

本发明步骤(1)中所述PCR的体系以50μl计，优选包括：5×SF buffer(with10mMMgSO₄)10μl、dNTP mix(10mM each)1μl、模板cDNA1μl、上游引物(10μM)2μl、下游引物(10μM)2μl、Phanta^TMSuper-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)1μl、DMSO 2μl、5×PCR Enhancer10μl、ddH₂O补足至50μl；所述PCR的程序包括98℃预变性3min；98℃变性10s，66℃退火20s，72℃延伸30min，循环32次；72℃延伸10min。

本发明优选将所述过表达载体导入农杆菌，利用农杆菌介导的转化法获得转基因植物，并从T₁代转基因植物中筛选鉴定纯合株系。本发明所述农杆菌优选包括农杆菌lba4404。本发明所述水稻的品种优选包括Nipponbare(日本晴)。

下面结合实施例对本发明提供的OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、构建抑制和超表达OsBZR1基因的突变体

提取水稻品种日本晴的RNA，反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以SEQ ID NO.3：5′-GTCGACACTAGTCACACTCTTTGAAAAGCAATC-3′和SEQ ID NO.4：5′-GGTACCGAGCTCCATCGCCTGCGATTATGCTAC-3′为引物扩增，得到347bp的PCR产物，该PCR产物具有SEQ IDNO.1所示序列自5′末端第981位至1327位核苷酸；该PCR产物为正向片段。

如图1中A所示，用SpeI和SacI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14610bp的pTCK303载体骨架连接，使该PCR产物正向插入pTCK303载体的SpeI、SacI位点间，得到中间载体；

再用SalI和KpnI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的14612bp的中间载体骨架连接，使该PCR产物反向插入中间载体的SalI和KpnI位点间，得到重组载体，为RNA干扰载体。

经过测序，该RNA干扰载体为将SEQ ID NO.1所示的序列自5′末端第981位至1327位核苷酸(B)插入pTCK303载体的SpeI和SacI酶切位点间，且将序列表中序列1自5′末端第981位至1327位核苷酸的反向互补片段(A)插入pTCK303载体的SalI和KpnI酶切位点间得到的载体，命名为pTCK-OsBZR1 RNAi(结构示意图如图1所示)，为RNA干扰载体，具有反向重复的重组表达载体用Ubiquitin基因的启动子。

如图1中B所示，构建过表达载体用HindIII和BamHI酶切该PCR产物，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的13094bp的PGA1611载体骨架连接，使该PCR产物插入PGA1611载体的HindIII和BamHI位点间，得到过表达载体。

之后RNA干扰载体或过表达载体分别转入农杆菌中，得到重组菌，分别将所述重组菌导入到水稻中，即利用农杆菌介导的转化方法分别获对纹枯病抗性减弱的OsBZR1 RNAi水稻和纹枯病抗性增强的转基因植物。

2、对上述OsBZR1 RNAi植物和OsBZR1转基因植物进行分子鉴定，提取水稻的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR：

OsBZR1引物为：

OsBZR1-F(SEQ ID NO.5):TGGAAGGAGAGGGAGAACAA；

OsBZR1-R(SEQ ID NO.6):GCTTACATCCCTTGCGGTAG；

内参基因为Ubiquitin，内参引物为：

Ubiquitin-F(SEQ ID NO.7):CACGGTTCAACAACATCCAG；

Ubiquitin-R(SEQ ID NO.8):TGAAGACCCTGACTGGGAAG。

结果如图2中A所示，OsBZR1基因沉默突变体OsBZR1 RNAi中OsBZR1的平均相对表达量明显低于野生型水稻日本晴(WT)中OsBZR1的平均相对表达量，而OsBZR1基因过表达突变体OsBZR1 OX植物中OsBZR1表达量高于日本晴(WT)中。

3、野生型(WT)、OsBZR1 RNAi和OsBZR1 OX活体叶鞘接种纹枯病菌后表型观察

采用活体叶鞘接菌的方法进行抗性鉴定。野生型(WT)、OsBZR1 RNAi和OsBZR1 OX水稻种植于桶内，每桶种一株，每个品种种5株作为重复，待水稻分蘖期接菌。PDA培养基表面转圈铺满1×0.5cm灭菌木皮，然后将4℃保存的纹枯病菌菌株R.solani AG1-IA(沈阳农业大学植物保护学院魏松红教授课题组馈赠)于超净工作台内接种在培养基上，置于28℃培养箱连续培养2～3d，待菌丝布满木皮，可用来接菌。用喷壶将待接菌的水稻喷湿。用灭好菌的镊子轻轻从培养皿中轻轻夹取长满菌丝的木皮，插入水稻苗下数第三片叶子的叶鞘中。再次用喷壶喷湿夹有木皮的叶鞘部位。然后用保鲜膜缠住接菌部位以充分保湿，置于正常生长条件下继续培养。约3d左右开始发病，取下保鲜膜。五次重复。

接菌后15d拍照记录发病情况。结果如图2所示，与野生型对照相比，OsBZR1 RNAi水稻植株更感病，病斑长度占茎秆长度80％左右；OsBZR1 OX更抗病，近乎免疫(图2中B和C)，表明OsBZR1基因参与调控水稻对纹枯病的抗性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> OsBZR1基因及编码蛋白在调控水稻纹枯病抗性中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 897

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgacgtccg gggcggcggc ggcggggagg acgccgacgt ggaaggagag ggagaacaac 60

aagaggcggg agcggcggcg gcgtgccatc gccgccaaga tcttcacggg gctccgggcg 120

ctcgggaact acaacctccc caagcactgc gacaacaacg aggtgctcaa ggcgctctgc 180

cgcgaggccg gctgggttgt cgaggacgac ggcaccacct accgcaaggg atgtaagccg 240

ccgccatcgt cggctggggg agcgtcggtg gggatgagcc cctgctcgtc aacgcagctg 300

ctgagcgcgc cgtcgtcgtc gttcccgagc ccggtgccgt cgtaccacgc gagcccggcg 360

tcgtcgagct tcccgagccc cagccggatc gacaacccga gcgcctcctg cctcctcccg 420

ttcctccggg ggctccccaa cctcccgccg ctccgcgtct ccagcagcgc gcccgtcacg 480

ccgccgctct cgtcgccgac ggcgtcgcgg ccgcccaaga tcaggaagcc ggactgggac 540

gtcgacccgt tccggcaccc cttcttcgcg gtctccgcgc cggcgagccc cacccgcggc 600

cgccgcctcg agcacccgga cacgataccg gagtgcgacg agtccgacgt ctccacggtg 660

gactccggcc ggtggatcag cttccagatg gccacgacgg cgccgacgtc gcccacctac 720

aacctcgtca acccgggcgc ctccacctcc aactccatgg agatagaagg gacggccggc 780

cgaggcggcg cggagttcga gttcgacaag gggagggtga cgccatggga gggcgagagg 840

atccacgagg tcgccgccga ggagctcgag ctcacgctcg gcgtcggcgc gaaatga 897

<210> 2

<211> 298

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Thr Ser Gly Ala Ala Ala Ala Gly Arg Thr Pro Thr Trp Lys Glu

1 5 10 15

Arg Glu Asn Asn Lys Arg Arg Glu Arg Arg Arg Arg Ala Ile Ala Ala

20 25 30

Lys Ile Phe Thr Gly Leu Arg Ala Leu Gly Asn Tyr Asn Leu Pro Lys

35 40 45

His Cys Asp Asn Asn Glu Val Leu Lys Ala Leu Cys Arg Glu Ala Gly

50 55 60

Trp Val Val Glu Asp Asp Gly Thr Thr Tyr Arg Lys Gly Cys Lys Pro

65 70 75 80

Pro Pro Ser Ser Ala Gly Gly Ala Ser Val Gly Met Ser Pro Cys Ser

85 90 95

Ser Thr Gln Leu Leu Ser Ala Pro Ser Ser Ser Phe Pro Ser Pro Val

100 105 110

Pro Ser Tyr His Ala Ser Pro Ala Ser Ser Ser Phe Pro Ser Pro Ser

115 120 125

Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ala Ser Cys Leu Leu Pro Phe Leu Arg Gly

130 135 140

Leu Pro Asn Leu Pro Pro Leu Arg Val Ser Ser Ser Ala Pro Val Thr

145 150 155 160

Pro Pro Leu Ser Ser Pro Thr Ala Ser Arg Pro Pro Lys Ile Arg Lys

165 170 175

Pro Asp Trp Asp Val Asp Pro Phe Arg His Pro Phe Phe Ala Val Ser

180 185 190

Ala Pro Ala Ser Pro Thr Arg Gly Arg Arg Leu Glu His Pro Asp Thr

195 200 205

Ile Pro Glu Cys Asp Glu Ser Asp Val Ser Thr Val Asp Ser Gly Arg

210 215 220

Trp Ile Ser Phe Gln Met Ala Thr Thr Ala Pro Thr Ser Pro Thr Tyr

225 230 235 240

Asn Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Thr Ser Asn Ser Met Glu Ile Glu

245 250 255

Gly Thr Ala Gly Arg Gly Gly Ala Glu Phe Glu Phe Asp Lys Gly Arg

260 265 270

Val Thr Pro Trp Glu Gly Glu Arg Ile His Glu Val Ala Ala Glu Glu

275 280 285

Leu Glu Leu Thr Leu Gly Val Gly Ala Lys

290 295

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gtcgacacta gtcacactct ttgaaaagca atc 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ggtaccgagc tccatcgcct gcgattatgc tac 33

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tggaaggaga gggagaacaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gcttacatcc cttgcggtag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

cacggttcaa caacatccag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tgaagaccct gactgggaag 20

Claims (7)

1.OsBZR1基因在调控水稻纹枯病抗性中的应用，其特征在于，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述OsBZR1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.OsBZR1基因编码的蛋白质在调控水稻抗纹枯病中的应用，其特征在于，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.过表达OsBZR1基因在增强水稻纹枯病抗性中的应用，其特征在于，所述OsBZR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种增强水稻纹枯病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以水稻RNA反转录后得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物为引物对进行PCR扩增，得扩增产物；

(2)将所述扩增产物连接进PGA1611载体的HindIII和BamHI酶切位点间，得到过表达载体；

(3)将所述过表达载体通过农杆菌介导的转化法获得增强纹枯病抗性的转基因水稻。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR的体系以50μl计，包括：5×SF buffer10μl、dNTP mix1μl、模板cDNA1μl、上游引物2μl、下游引物2μl、PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase1μl、DMSO 2μl、5×PCR Enhancer 10μl和余量的ddH₂O。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，所述PCR的程序包括98℃预变性3min；98℃变性10s，66℃退火20s，72℃延伸30s，循环32次；72℃延伸10min。

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