CN114561397B

CN114561397B - CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用

Info

Publication number: CN114561397B
Application number: CN202210197138.XA
Authority: CN
Inventors: 贝学军; 李果果; 黄霞; 廖泽达; 邓祥源
Original assignee: Yulin Normal University
Current assignee: Yulin Normal University
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: CN114561397A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及柑橘CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用，本申请研究的是柑橘CsCaBP1基因对柑橘溃疡病抗性作用。通过研究发现过量表达柑橘CsCaBP1基因能有效增强转基因植株对柑橘溃疡病的抗性。因此，可以通过获得CsCaBP1基因的转基因柑橘获得具有抗柑橘溃疡病的植株，为以后柑橘遗传育种提供新思路。

Description

CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用。

【背景技术】

柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease)是由薄壁菌门黄单胞杆菌属地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，是甜橙等易感柑橘的重大病害之一。柑橘溃疡病的严重程度和柑橘溃疡病菌的分型以及柑橘的抗病性相关。已知柑橘溃疡病细菌包含A、B、C、A^*和A^w 5个菌系，其中A类型也叫亚洲种的致病力最强、危害范围最广，溃疡病菌通过柑橘体表的气孔、皮孔和伤口入侵、定植，并随风雨以病树为中心扩散。柑橘不同种类或品种对溃疡病的抗性水平有很大的不同，其中金柑属、柑橘属中的宽皮橘的抗病性最强，而世界上栽培最多最重要的甜橙(Citrussinensis)的所有品种均高度感病，有研究表明，柑橘对溃疡病的抗、感差异与细胞和组织结构差异相关，特别是和气孔的密度与大小相关(潘贞珍等，2020)。但刘利平等(2012)则认为柑橘气孔的密度和开度与抗性没有必然的关系。杨秀娟等(2002)发现，柑橘受溃疡病菌的侵染后，柑橘叶片的氨基酸、全酚、糖以及抗坏血酸含量明显减少，酸度明显增加；病部的叶绿素a和b、胡萝卜素和叶黄素的含量减少，光合作用减弱。Goto等(1981)通过对柑橘叶片中的游离氨基酸的分析，发现脯氨酸是溃疡病的重要营养源，而丝氨酸和赖氨酸明显抑制溃疡病菌的增殖。焦鸿俊(1996)对抗溃疡病的柑橘品种和感病品种的叶细胞膜脂组分及含量的检测表明，抗病品种中的磷脂酞胆碱(PC)，磷脂酞乙醉胺(PE)，磷脂酞甘油(PG)和磷脂酸肌醇(PI)的总含量以及不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率均显著低于感病品种，而游离甾醇与总磷脂的比率均显著高于感病品种。

目前，通过反向遗传学，鉴定了一些与溃疡病抗性相关的基因，如：CsLOB1、CsGH3.6、Csxth04、CsWRKY22、CsAP2-09、CsBZIP40、CsGH3.1和CsGH3.L、CsNBS-LRR、CsWRKY61、CitMYB20、LYKs、CsPAEs、CsWAKL08、CsPrx25，这些基因涉及生长素、茉莉酸和水杨酸信号传导途径，参与细胞内POD和SOD等酶的活性的调节。

柑橘基因组中有30000多个基因，不同基因相互作用形成复杂而精细的调控网络。目前报道的溃疡病抗性相关的基因很少，而研究报道中并未发现类钙调蛋白诱导柑橘溃疡病

【发明内容】

鉴于研究进展，有必要提供CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用，该研究能阐述CsCaBP1在柑橘抗溃疡病中的作用，为柑橘抗性育种利用CsCaBP1提供理论。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

CsCaBP1基因在诱导柑橘溃疡病抗性中的应用，所述CsCaBP1基因的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述CsCaBP1基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述柑橘为伏令夏橙。

本发明还包括过表达CsCaBP1基因在提高柑橘溃疡病抗性中的应用，所述过表达载体含有如权利要求2所述的核酸序列SEQ ID NO.2。

本发明还包括一种构建过量表达CsCaBP1基因载体的方法，具体步骤如下：

(1)根据CsCaBPs1基因序列，设计基因特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4克隆CsCaBP1基因全长CDS区，琼脂糖凝胶电泳回收纯化扩增产物；其中，SEQ ID NO.3为上游引物，其序列为5’-ATGAGTGTGGAAGTGTTAGATAGTGC-3’；SEQ ID NO.4为下游引物5’-TTAAGCAGCCGCTTTGGC-3’。

(2)将步骤(1)的扩增产物连接到PMD-19T载体中得到PMD-19T-CsCaBP1重组质粒，对重组质粒验证并挑取阳性克隆、测序；利用限制性内切酶ASCⅠ、BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒PMD-19T-CsCaBP1和过表达载体PFGC5941，然后从PMD-19T-CsCaBP1载体中回收CsCaBP1基因和线性化的PFGC5941片段，利用和T4连接酶连接上述产物，得到过表达CsCaBP1基因的过表达载体，并将过表达载体命名为PFGC-OeCsCaBP1。

本发明还包括一种应用所述过表达CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性的研究，所述方法包括如下步骤：

(1)将权利要求4构建好的过表达载体转入农杆菌感受态细胞EHA105，挑选抗性克隆进行PCR检测，证明含有目的基因的质粒是否转入农杆菌；

(2)用步骤(1)获得的含有目的基因的农杆菌对柑橘实生苗进行原位转化。

原位转化具体步骤如下：

(1)将5周龄的土播伏令夏橙实生苗真叶着生部位切断，将吸有农杆菌浸染液的枪头倒扣于切口，使切口浸没于浸染液中，浸染45min后用Parafilm薄膜包被切口保湿，用黑色塑料膜覆盖后进行共培养，培养温度25℃；

(2)共培养3天后揭开黑膜，去除Parafilm薄膜，进行二次浸染。

(3)3天再次揭开黑膜，去除Parafilm薄膜，用50mg.L^-1Kan溶液轻擦切口3次，使之覆有明显的抗生素溶液；

(4)用Parafilm薄膜包被切口后暗处理以促进切口再生，2周后揭去黑膜，自然光条件下培养。

(5)经过近50d的培养，将获得抗性芽嫁接到枳壳砧木上。

本发明还包括一种获得抗溃疡病的柑橘育种方法，所述方法为：构建柑橘CsCaBP1基因的过量表达载体，通过农杆菌介导法将CsCaBP1基因转入伏令夏橙基因组，获得具有抗柑橘溃疡病的转基因植株。

本发明具有如下有益效果：

本申请阐明CsCaBP1在柑橘抗溃疡病中的作用，为今后柑橘抗溃疡病育种利提供理论和材料基础；通过申请人研究发现：过量表达CsCaBP1基因能明显增强转基因植株对溃疡病的抗性。因此，通过过量表达CsCaBP1基因来生产具有抗柑橘溃疡病的抗病植株，为今后的植物遗传育种研究提供了新的思路。

【附图说明】

图1：CsCaBP1基因过表达载体构建及PCR检测图；

图中，A为经过ASCⅠ/BamHⅠ双酶切PFGC5941载体的PCR扩增图，图中，M为MarkerDL5000；1为经过ASCⅠ/BamHⅠ双酶切PFGC5941的骨架；2为未经酶切的PFGC5941载体；

B为经过ASCⅠ/BamHⅠ双酶切TA克隆质粒的PCR扩增图，图中，M为Marker DL5000；1为未酶切的PMD-19T-CsCaBP1载体质粒；2为从PMD-19T-CsCaBP1载体中经过ASCⅠ/BamHⅠ双酶切的含CsCaBP1的基因片段；

C为过表达载体pFGC-Oe CsCaBP1的PCR检测图；图中，M为Marker DL5000；1、2、3为阳性克隆PCR结果。

图2：CsCaBP1基因载体转入农杆菌后PCR检测结果。

图3：CsCaBP1基因过量表达原位遗传转化法实验处理过程图；

图中，A1为筛选培养1周后上胚轴切口处再生愈伤的示意图；B1为筛选培养1周后上胚轴切口再生芽的示意图；C1为筛选培养1周后愈伤处再生多个芽点的示意图；A2为筛选培养2周后由愈伤形成的再生枝条的示意图；B2为筛选培养2周后上胚轴切口处形成的器官型再生枝条的示意图；C2为筛选培养2周后由愈伤形成的多个再生枝条的示意图；

图4：转基因植株的嫁接及生长的示意图；

图中，A为嫁接到枳壳砧木上的抗性芽的示意图；B为嫁接3个月后的植株的示意图；

图5：转入CsCaBP1基因部分柑橘植株PCR检测图；

图中，M为Trans 2K plus DNA markers，从上至下依次为：5000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp、100bp；

1～2为未转基因植株的检测示意图(负对照)；3为空载的过表达载体PFGC5941的检测示意图(正对照)；4～16为含目的基因的转基因植株的检测示意图；其中，4、6、7、9并未能将含目的基因的过表达载体转入植株中；

图6：过量CsCaBP1基因的转基因柑橘对溃疡病抗性评价结果；

图中，A为转基因植株中CsCaBP1相对表达量检测结果示意图；B：转基因植株的表型示意图；C为转基因植株接种溃疡病后发病情况统计结果图；D为转基因植株叶片接种溃疡病之后表型图。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

CsCaBP1基因的克隆：

(1)采取伏令夏橙枝条，将枝条放入水后在水中剪掉枝条末端，将枝条放入体积50L的密闭容器中，静置过夜。在容器中注入纯乙烯至终浓度20ppm，25℃下处理24h。将乙烯处理后的叶片作为RNA提取的材料，RNA的提取按照北京百泰克生物技术有限公司的多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒说明书进行。

(2)RNA反转录为cDNA，在本实施例中,反转录反应按TaKaRa的PrimeScript RTreagent Kit Perfect Real Time试剂盒说明书进行；

(3)用cDNA为模板，用基因特异性引物：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4采用PCR扩增克隆CsCaBP1基因全长CDS区，琼脂糖凝胶电泳回收纯化扩增产物；其中，SEQ ID NO.3为上游引物，其序列为5’-ATGAGTGTGGAAGTGTTAGATAGTGC-3’；SEQ ID NO.4为下游引物5’-TTAAGCAGCCGCTTTGGC-3’；

其中，上述PCR反应总体系的体积为50μL，包括TaKaRa LA Taq 0.5ul、10×LA PCRbuffer 5ul、dNTP(2.5mM)8ul、模板1ul、Forward Primer(10μM)1ul、Reverse Primer(10μM)1ul、灭菌ddH₂O 32.5μL，PCR扩增程序为94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；最后，72℃延5min后。

(4)在步骤(3)的PCR反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，再使用天根生物技术有限公司的Universal DNAPurification Kit试剂盒进行DNA片段的纯化回收，进行TA克隆，挑选阳性克隆送华大基因测序，测得的基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

根据实施例1CsCaBP1基因(Ciclev10017119m)蛋白氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示。

实施例3：

根据实施例1CsCaBP1基因构建过表达载体，该表达载体能将实施例1的CsCaBP1基因插入至植物表达载体PFGC5941中的35S启动子后面，上述过表达载体的构建方法如下：

(1)根据CsCaBP1基因序列，设计基因特异性引物(上游序列如SEQ ID NO.3所示和下游序列如SEQ ID NO.4所示)，PCR克隆CsCaBP1基因的完整CDS区，琼脂糖凝胶电泳回收纯化扩增产物。

(2)PCR反应总体系的体积为50μL，包括TaKaRa LA Taq 0.5ul、10×LA PCRbuffer 5ul、dNTP(2.5mM)8ul、模板1ul、Forward Primer(10μM)1ul、Reverse Primer(10μM)1ul、灭菌ddH₂O 32.5μL，PCR扩增程序为94℃预变性1min；94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；最后，72℃延5min后。

(3)扩增产物克隆到PMD-19T载体，挑选阳性克隆，利用载体通用引物M13F/R(通用引物不需要提供)测序。挑选序列正确的阳性克隆得到PMD-19T-CsCaBP1重组质粒。

(4)分别将含有测序正确的目的基因的PMD-19T-CsCaBP1重组质粒和PFGC5941载体采用限制性内切酶ASCⅠ和BamHⅠ进行双酶切，回收含CsCaBP1目的基因片段及PFGC5941载体骨架，通过T4连接酶将目的基因插入PFGC5941载体中，过表达载体：PFGC-OeCsCaBP1。

上述酶切反应体系总体积为50μl：质粒25μl(2ug)，ASCⅠ1ul、BamHⅠ1ul、10×buffer 5ul、dH₂O 28μl。37℃酶切8h；80℃失活处理20min。酶切后，对酶切产物进行凝胶糖电泳检测，回收酶切产物，置于-20℃保存备用。

连接反应时目的基因与载体的摩尔比为3：1，4℃过夜，将目的基因插入载体PFGC5941中。转化DH5α感受态细胞，挑选抗性克隆进行PCR检测，证明目的基因质粒是否连接到载体PFGC5941中，结果如图1所示。

实施例4：

超表达CsCaBPs1基因的转基因植株获得：

一、pFGC-OeCsCaBP1载体转化农杆菌感受态细胞

用含有目的基因双元质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105，具体步骤为：取5μl的pFGC-OeCsCaBP1质粒加入农杆菌感受态细胞中，冰上孵育5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min；加入500μl YEB液体培养基，28℃孵育2.5h后，将菌液均匀的涂布在含有Kan和利福的YEB固体培养基。28℃培养2天后，挑出单克隆在含有Kan和利福YEB液体培养基培养。28℃培养2天后，进行PCR鉴定。如图2所示，在图中能扩增出大小约500bp的片段，证明含有目的基因的质粒已成功转入农杆菌中。

二、用农杆菌介导的原位转化法转化柑橘：

将5周龄的土播伏令夏橙实生苗真叶着生部位切断，并吸有农杆菌浸染液(OD600＝0.5)的枪头倒扣在上胚轴的切口，使切口浸没于浸染液中，浸染45min后用Parafilm薄膜包被切口保湿，用黑色塑料膜覆盖后进行共培养，培养温度25℃；共培养3天后揭开黑膜，去除Parafilm薄膜，进行二次浸染；3天再次揭开黑膜，去除Parafilm薄膜，用50mg.L^-1Kan溶液轻擦切口3次，使之覆有明显的抗生素溶液；用Parafilm薄膜包被切口后暗处理以促进切口再生，2周后揭去黑膜，自然光条件下培养，具体操作方法如图3所示。

经过近50d的培养，参照普通甜橙抗性芽茎尖嫁接方法将抗性芽嫁接到枳壳砧木上将获得抗性芽嫁接到枳壳砧木上，并置于网室中继续培养；具体操作方法如图4所示。

提取转化了pFGC-OeCsCaBP1质粒的抗性芽叶片DNA,用Basta引物(F:5’-CAATACAAAGACAGATAAAGCCACG-3’,R：5’-ACGCTCTACACCCACCTGCT-3’)对转基因植株进行PCR检测。如图5所示，阳性植株有500bp左右的目标片段扩增，而未转基因植株无扩增产物。

三、转基因柑橘的RT-PCR检测

为了进一步证实目的基因在柑橘中是否过量表达，使用基因特性引物F:5’-CGACGAGAAACCACAGACCCAGAAG-3’，R：5’-TTGAACTCCTCCAAATCCACCG-3’，对DNA水平上检测呈阳性的植株提取RNA进行了RT-PCR分析。结果表明，目的基因在RNA水平上分别有不同程度的转录，如图6所示；图6中的A图显示,目的基因CsCaBP1在转基因植株中表达量为野生型植株的13倍以上，说明目的基因CsCaBP1在柑橘植株中高表达。

实施例5：

本实施例为柑橘中过表达CsCaBP1基因后，转基因植株的表型，实施例中选择3株转基因植株进行平行试验，分别命名为CsCaBP1-1、CsCaBP1-2、CsCaBP1-3：

本实施例的柑橘品种为：伏令夏橙

采用离体接种法进行转基因植株对溃疡病抗性评价。选取健康的7成老熟的叶片10张，用接种针在每片叶背刺4组孔，每组6个，每个针孔接种溃疡病菌菌液10ul(OD₆₀₀＝0.1)。接种后的叶片与28℃光照培养10天后统计叶片发病情况。具体如图6C、图6D所示，从图6的C图可见，3株转基因植株的发病率均小于野生型，从图6的D图中可见3株转基因植株病斑面积均小于野生型；由此说明：当过表达CsCaBPs1基因，能有效诱导柑橘溃疡病抗性。

综上所述，本申请的过量表达CsCaBP1基因，能显著提高柑橘的抗溃疡病能力，为构建柑橘抗溃疡病相关育种提供了理论支持。

由此可见，当过表达CsCaBPs1基因，能有效诱导柑橘溃疡病抗性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 玉林师范学院

<120> CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Val Glu Val Leu Asp Gly Ala Thr Ile Val Ser Phe Val Glu

1 5 10 15

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Asn Ser Ile Arg Asn Arg Phe Ala His Leu

20 25 30

Asp Thr Asp His Asp Gly Leu Leu Ser Tyr Ala Glu Met Met Gln Glu

35 40 45

Leu Lys Ser Leu Arg Val Phe Glu Thr His Phe Gly Ile Asp Glu Lys

50 55 60

Pro Asp Pro Glu Glu Leu Ala Ser Val Tyr Asn Ser Leu Phe Val Gln

65 70 75 80

Phe Asp His Asp Ser Asn Gly Thr Val Asp Leu Glu Glu Phe Lys Glu

85 90 95

Glu Thr Lys Gln Met Met Leu Ala Met Ala Asn Gly Leu Gly Phe Leu

100 105 110

Pro Val Gln Met Val Leu Glu Glu Asp Ser Phe Leu Met Lys Ala Val

115 120 125

Glu Lys Glu Phe Thr Ala Lys Ala Ala Ala

130 135

<210> 2

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagtgtgg aagtgttaga tagtgccaca attgtaagct ttgtggaaga tgaagaagca 60

ttcaacaact cgatacgaaa ccgttttgcc catcttgata cagatcatga tggtctcctt 120

tcttatgcag aaatgatgca ggagctcaag agtctgaggg tctttgagac ccatttcggc 180

atcgacgaga aaccagaccc agaagagctt gctagtgttt acaactctct gtttgtccaa 240

ttcgatcatg actcaaatgg cacggtggat ttggaggagt tcaaggcaga gaccaagcaa 300

atgatgcttg ccatggccaa tggtctcggt ttcttgcctg tacaaatggt ccttgaagaa 360

gatagctttc tgatgaaggc tgtggagaag gagtccactg ccaaagcggc tgcttaa 417

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtgtgg aagtgttaga tagtgc 26

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaagcagcc gctttggc 18

Claims

1.过表达CsCaBP1基因诱导伏令夏橙溃疡病抗性的应用，其特征在于，所述CsCaBP1基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

2.过表达CsCaBP1基因诱导伏令夏橙溃疡病抗性的应用，其特征在于，过表达载体含有如权利要求1所述的核酸序列SEQ ID NO.2。

3.过表达CsCaBP1基因的载体诱导伏令夏橙溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)通过化学转化法，将权利要求2构建好的过表达载体转化农杆菌感受态细胞EHA105；

(2)用步骤(1)所得得含有目的质粒的农杆菌对伏令夏橙实生苗进行2次侵染即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的转染方法为原位转化法，具体包括如下步骤：

(1)将四周龄的伏令夏橙实生苗去顶，并吸有含有目的质粒的农杆菌浸染液的枪头倒扣在上胚轴的切口，浸染45min；

(2)用封口膜包裹切口，25℃暗培养3d，再进行第二次浸染；

(3)将2次侵染后的伏令夏橙植株培养50d后，获取抗性芽，将抗性芽嫁接到枳壳砧木上即得。