CN114350702A

CN114350702A - 一种柑橘的病毒接种方法

Info

Publication number: CN114350702A
Application number: CN202210097841.3A
Authority: CN
Inventors: 黄素亚; 马海杰; 刘金华; 张瑞峰; 毛熊兴; 孙学鹏; 焦晨; 李春芳; 段硕; 孟心月; 刘宁鸽
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang A&F University ZAFU; Gannan Normal University; Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang A&F University ZAFU; Gannan Normal University; Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Co Ltd
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明提供了一种柑橘的病毒接种方法，属于植物病毒接种技术领域。病毒接种柑橘的传统方法为使用富集病毒的烟草叶片提取物对柑橘进行摩擦接种，该方法存在一定比例的失败率，且因烟草生长周期较短不能做到病毒随用随取。本专利通过使用含有病毒侵染性克隆的农杆菌对多个柑橘品种直接进行农杆菌浸润，实现病毒的定殖和扩散，便于VIGS和病毒介导的外源基因表达等实验操作，利于柑橘内、外源基因功能研究。也可以通过将其他品种的柑橘(如甜橙等)直接嫁接在病毒侵染成功的柑橘上(如香橼、柠檬、枳橙等)或者将病毒侵染成功的柑橘嫁接在其它品种柑橘上，一步实现病毒向其它柑橘品种的传送。

Description

一种柑橘的病毒接种方法

技术领域

本发明属于植物病毒接种技术领域，具体涉及一种柑橘的病毒接种方法。

背景技术

目前，柑橘病毒(CLBV、CTV)和其他病毒(TRV)通过VIGS(virus induce genesilence)技术，即病毒介导的基因沉默；以及病毒介导的基因过表达，被成功应用于柑橘的基因功能研究中。但是病毒接种目前一直依赖烟草富集病毒粒子步骤，之所以如此依赖，是因为农杆菌直接浸润柑橘叶片进行瞬时表达研究成功率极低，因此尚未发现有文章报道使用该方法取得较为显著的结果“。为克服这一现象，佛罗里达大学Wangnian教授通过首先对柑橘叶片注射柑橘溃疡病菌以削弱柑橘叶片的防卫反应，一段时间后再进行农杆菌浸润，并通过该手段实现了农杆菌介导的瞬时表达(Plant gene editing through de novoinduction of meristems)。但柑橘溃疡病菌为柑橘上常见的细菌性病害，其会导致叶片数天后产生溃疡病，因此应用范围有限。

传统柑橘接种病毒方法需要依赖烟草富集病毒粒子，利用携带病毒的烟草对柑橘进行摩擦接种，可见，给柑橘进行病毒粒子接种需要进行烟草种植。而烟草生长周期相对较短，只有新鲜的烟草叶片才能富集较高浓度的病毒粒子，进而提高接种成功率。此外，烟草生长状态也会影响农杆菌侵染的成功率。因此，烟草介导的病毒接种对烟草的状态要求较高，接种源难以做到随时取用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的针对柑橘的病毒接种方法，具有接种成功率高、操作简便的特点。

本发明提供了一种柑橘的病毒接种方法，包括以下步骤：

待接种的病毒侵染性克隆导入农杆菌感受态中，增菌培养，所得含病毒侵染性克隆的农杆菌菌液离心，菌体重悬，得到农杆菌重悬液；

将所述农杆菌菌液和P19重悬液混合，得到侵染液；

在真空条件下，将柑橘枝条浸没在所述侵染液浸润中，得到感染病毒的柑橘枝条。

优选的，所述柑橘包括以下一种或几种：‘柠檬’、‘枳橙’和‘香橼’。

优选的，所述柑橘为健康的1～2年生的柑橘植株；

优选的，所述柑橘枝条的直径为0.5～1cm；

所述柑橘枝条的长度为10～15cm；

所述柑橘枝条上的叶片进行裁剪，保留的叶片面积占原有叶片面积的1/5～1/3。

优选的，所述浸没时，将所述柑橘枝条的形态学上端朝下浸没在所述侵染液中；

所述浸没的时间为15～30min。

优选的，所述真空条件的压力为为0.1～2.0pa。

优选的，所述农杆菌重悬液和P19重悬液等体积混合；

农杆菌重悬液的OD值为1；所述P19重悬液的OD值为1；

农杆菌重悬液的溶剂为浸润缓冲液；所述浸润缓冲液含有以下浓度的组分：0.05M2-吗啉乙磺酸、2mM Na₃PO₄、5mg/ml D-葡萄糖、0.1M乙酰丁香酮。

优选的，所述待接种的病毒包括柑橘叶斑病毒、柑橘衰退病毒和烟草脆裂病毒。

优选的，所述接种方法还包括将所述感染病毒的柑橘枝条进行扩繁。

优选的，所述扩繁的方法包括将所述感染病毒的柑橘枝条嫁接至无病毒的健康柑橘植株上或将柑橘的健康芽嫁接至感染病毒的柑橘枝条上生长。

本发明提供了一种柑橘的病毒接种方法，通过农杆菌真空浸润实现柑橘病毒的直接接种，而通过将病毒接种成功的柑橘嫁接到其他柑橘品种上，可实现病毒在其他品种柑橘的接种，该方法能大大提高接病毒接种效率，并为助力柑橘基因功能研究，可显著提高柑橘内、外源基因功能研究的效率。所述接种方法还具有以下优点：

1)效率高，一次能浸润数百棵柑橘扦插枝条；

2)易成活，适宜条件下柑橘枝条易抽芽长根，浸润成功率高达80％以上；

3)保持久，一旦侵染成功，柑橘终生带毒，随用随嫁接；

4)成本低，周期短，不需要长达数周的烟草培养时间，取柑橘枝条即可浸润；

5)操作简单，无需烟草富集病毒粒子步骤；

6)易成功，嫁接方式进行病毒接种成功率较烟草提取病毒粒子摩擦接种高，并且通过根癌农杆菌或发根农杆菌浸润均可实现侵染；

7)可用病毒接种源更多，每株烟草叶片有限，可提取的病毒粒子量有限，但是柑橘可长期大量抽芽。

附图说明

图1为本发明实施例中涉及的CLBV侵染性克隆质粒图谱；

图2为本发明实施例中构建的CLBV-YFP病毒侵染性克隆；

图3为CLBV-YFP侵染烟草第15天宏观照片(左1)和共聚焦观测照片(右2-4)；

图4为柑橘(香橼)扦插枝条浸润图，其中上图为柑橘枝条放在浸润液中，下图为真空泵装置正在抽真空；

图5为柑橘(香橼)扦插枝条新叶萌发图，左1和左2为整体图，右1和右2为细节图；

图6为柑橘(香橼)扦插枝条整株图，左1为整体图，右1为细节图；

图7为柑橘(香橼)扦插枝条新叶PCR测序结果，1-8为八个独立扦插枝条的检测结果；

图8为柑橘(香橼)扦插枝条新叶PCR产物测序结果，此为图7的八个测序比对结果；

图9为柑橘(香橼)扦插枝条嫁接甜橙接穗照片，右1为整体图，左1-6为细节图；

图10为甜橙接穗中的病毒检测结果胶图，1-5为五个独立接穗结果；

图11为甜橙接穗中的病毒测序比对结果，此为图10的五个条带的测序比对结果；

图12为注射器注射悬浮液示范图，左1为注射示范，右1为注射器。

具体实施方式

本发明提供了一种柑橘的病毒接种方法，包括以下步骤：

将所述农杆菌菌液和P19重悬液混合，得到侵染液；

本发明将待接种的病毒侵染性克隆导入农杆菌感受态中，增菌培养，得到含病毒侵染性克隆的农杆菌菌液。

在本发明中，所述待接种的病毒优选包括柑橘叶斑病毒、(CLBV)、柑橘衰退病毒(CTV)和烟草脆裂病毒(TRV)。

在本发明实施例中，以柑橘叶斑病毒为例说明本发明的接种方法，但不能理解为对本发明保护范围的限制。

在本发明中，为了便于观察病毒的接种情况，优选在待接种的病毒侵染性克隆中插入报告基因。在本发明实施例中，所述报告基因优选插入YFP序列，具体核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

本发明对所述导入农杆菌感受态的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的导入方法即可。在本发明实施例中，所述导入的方法为冻融转化法。本发明对所述农杆菌感受态的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的农杆菌感受态即可，在本发明实施例中，所述农杆菌感受态为GV3101感受态，购自上海唯地生物技术有限公司。导入后，优选将GV3101感受态经抗性筛选、鉴定。所述抗性筛选时，采用含抗生素的平板进行筛选培养。所述抗生素包括Kana和Rif。所述鉴定优选采用PCR扩增和测序验证插入序列的准确性。获得验证正确的农杆菌菌株后，进行增菌培养。所述增菌培养的方法优选为在含双抗的YEP固体培养基上划单斑，挑取单斑的农杆菌接种于YEP液体培养基振荡培养，所得菌液接种于新的YEP液体培养基振荡培养，所得菌液离心分离菌体，经重悬，得到农杆菌菌液。所述振荡培养的温度优选为27～29℃，更优选为28℃。所述振荡培养的时间优选为15～17h，更优选为16h。所述振荡培养的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。所述接种时接种量优选为1％。所述振荡培养优选培养至OD＝1～1.5。所述菌液离心的转速优选为2800～3200rpm，更优选为3000rpm。所述菌液离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。得到菌体后，采用浸润缓冲液重悬菌体，得到农杆菌菌液。所述浸润缓冲液含有以下浓度的组分：0.05M 2-吗啉乙磺酸、2mM Na₃PO₄、5mg/ml D-葡萄糖、0.1M乙酰丁香酮。0.05M 2-吗啉乙磺酸、2mM Na₃PO₄、5mg/ml D-葡萄糖对于维持农杆菌的活性至关重要，0.1M乙酰丁香酮对于激活农杆菌的毒力、促进其侵染植物很重要，在实验中对浸染提高接种效率有显著的作用。这种缓冲液在农杆菌浸润实验中经常用用到，不属于本专利的创新点。

得到农杆菌菌液后，本发明将所述农杆菌菌液和P19重悬液混合，得到侵染液。

在本发明中，所述农杆菌菌液和P19重悬液优选等体积混合。农杆菌菌液的OD值为1；所述P19重悬液的OD值为1。所述P19重悬液是指有p19蛋白的序列的质粒。p19蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的RNA沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片，拟南芥叶片，番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。目前，在使用含有病毒侵染性克隆的农杆菌侵染植物的时候，为避免或者降低植物对病毒侵染性克隆的转录，提高病毒侵染性克隆定殖和扩繁的效率，常使含有P19相关质粒的农杆菌与含有病毒侵染性克隆的农杆菌混合侵染。

所述混合优选为在25～27℃黑暗放置2.5～3.5h，更优选为在26℃黑暗放置3h。

得到浸染液后，本发明在真空条件下，将柑橘枝条浸没在所述侵染液浸润中，得到感染病毒的柑橘枝条。

在本发明中，所述柑橘优选包括以下一种或几种：‘柠檬’、‘枳橙’和‘香橼’。所述柑橘优选为健康的1～2年生的柑橘植株，有利于新的枝条的再生和盆栽培养。愈伤组织的形成和。所述柑橘枝条的优选为当年生的直径为0.5～1cm的枝条，有利于枝条的存活和愈伤组织的形成，优选将纸条的两端进行斜口剪切，有利于增大侵染的面积和增大愈伤组织形成的面积。所述柑橘枝条的长度优选为10～15cm。优选对所述柑橘枝条上的叶片进行裁剪，保留的叶片面积占原有叶片面积的1/5～1/3，有利于有利于降低枝条的蒸腾左右，减少水分的散失，从而有助于枝条的存活。

在本发明中，所述浸没时，优选将所述柑橘枝条的形态学上端朝下浸没在所述侵染液中，优选浸没的深度为所述柑橘枝条的下端距离浸没叶面1cm。所述浸没的时间优选为15～30min，更优选为20min，以便菌体充分接触柑橘枝条。所述真空条件的压力优选为为0.1～2.0pa，更优选为2pa。所述浸没，可以同时处理不同的接种病毒。

在本发明中，真空处理后，恢复自然大气压，将柑橘枝条的下端插入蛭石基质中。所述蛭石的粒径优选为3～5mm。所述蛭石的平铺厚度优选为3～3.5cm。所述蛭石中加入适量清水，使蛭石湿润但底部不积水为宜。柑橘枝条的扦插株距优选为5～6cm，覆盖配套的透明盖子保湿。每种不同的质粒必须扦插在单独的育苗盘中。在培养期间，所述蛭石的温度优选为27～29℃，更优选为28℃。培养期间进行光照，所述光照的强度优选为5000lux。所述培养期间的环境湿度优选为70％～80％。基质保持湿润且不积水，待新叶和新根长出，20天后可移除盖子，30天可在新生叶片上检测病毒侵染情况。所述检测病毒侵染的方法优选采用PCR扩增方法检测病毒的基因。在本发明实施例中，以柑橘叶斑病毒为例，使用Snapgene针对RdRp、CP和MP基因设计引物，具体如下：RdRp-RT-F：AATCCGTCTTCCCTTCTG(SEQ ID NO:2)；RdRp-RT-R：GCATCTTATTTGGACCTTTT(SEQ ID NO:3)；CP-RT-F：GTGTCGGTAGCATTCAGG(SEQ IDNO:4)；CP-RT-R：CGTGTCGCACTCTATCTTAT(SEQ ID NO:5)；MP-RT-F：AGAAATACTCCTCCTGAAA(SEQ ID NO:6)；MP-RT-R：TAGTCTAACGCTCCCATC(SEQ ID NO:7)。还设计了植物内参基因引物，GAPDH-RT-F：AATCAATGGGTTTGGTAGA(SEQ ID NO:8)；GAPDH-RT-R：TCGTACTTGAGGAGGTGAG(SEQ ID NO:9)。

在本发明中，感染病毒的柑橘枝条扦插后具有较高的存活率，存活率达到80％以上。比较不同品种的柑橘枝条的扦插成活，具体如下：

1)香橼，能够快速繁殖，扦插存活率在90以上，真空浸润的成活率均在91％以上，一个月内(一般为2～3周)能够实现新芽新根的生长，能够高效传导CLBV病毒。

2)尤里克柠檬，新叶生长相对较快，扦插存活率在80％，真空浸润的成活率均在80％以上，一个月左右能够实现新芽新根的生长，能够高效传导CLBV病毒。

3)香水柠檬，能够快速长新叶，扦插存活率在70％，真空浸润的成活率均在70％以上，一个月左右能够实现新芽新根的生长，能够高效传导CLBV病毒。

在本发明中，携带病毒的侵染性克隆可以作为长期稳定病毒接种来源。为了获得大量的感染病毒的植株，所述接种方法优选还包括将所述感染病毒的柑橘枝条进行扩繁。所述扩繁的方法优选包括将所述感染病毒的柑橘枝条嫁接至无病毒的健康柑橘植株上或将柑橘的健康芽嫁接至感染病毒的柑橘枝条上生长。在本发明实施例中，所述嫁接的方法以健康的甜橙为对象，将感染病毒的柑橘枝条嫁接至健康的甜橙植株上，或者将健康的甜橙芽嫁接至感染病毒的柑橘上。嫁接后，优选对嫁接枝条进行检测。所述检测方法同感染病毒的柑橘枝条的方法，在此不做赘述。

下面结合实施例对本发明提供的一种柑橘的病毒接种方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CLBV-YFP病毒侵染性克隆载体构建方法

该实验的目的是建成本研究实验所需病毒侵染性克隆。

1)CLBV质粒提取：A.将含有CLBV侵染性克隆(图1)的大肠杆菌于含有kana抗生素的LB平板上划单菌落，37℃过夜培养；B.挑取单菌落于含有800μl的LB(含有kana)的1.5ml离心管中，在37℃、200rpm条件下摇菌8h；C.吸取上述菌液至含有5ml的LB(含有kana)的三角瓶中，37℃200rpm摇菌过夜；D.使用质粒提取试剂盒进行质粒提取，使用nanodrop进行质粒浓度检测。

2)质粒酶切：使用BamHI限制性内切酶对CLBV侵染性克隆进行酶切。反应温度为37℃，反应体系如下：

限制性内切酶	1ul
		模板DNA	1μg
10×缓冲液	5μl(1×)
		总反应体积	50μl
反应时间	1h*
		反应温度	37℃

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，对正确的条带(单一条带，大小在12kb附近)使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收。回收后的酶切产物进行浓度检测。

3)目的片段接头设计：本研究载体构建使用同源重组法，因此需要插入片段两端序列(约15～25bp)与CLBV的BamHII位点两端序列保持一致。本实施例所用接头序列为：插入序列5'端：taatgatagattgagaaaat(SEQ ID NO:10)；插入序列3'端：tcctgaattctggcatgggc(SEQ ID NO:11)。接头中间的YFP序列ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO:1)。一步连接体系根据使用的酶切产物和目的片段的浓度而定，具体如下：

1.根据公式计算重组反应所需DNA量。

为了确保加样的准确性，在配制重组体系前可将线性化载体与插入片段做适当稀释，各组分加样量不低于1μl。

2.于冰上配制以下反应体系:

a.XY根据公式计算得到载体用量和各插入片段用量。

载体、片段使用量计算:

ClonExpress MultiS重组反应体系最适DNA使用量为每个片段(包括线性化载体)各0.03pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

每个片段最适使用t＝[0.02×片段碱基对数]ng(0.03pmol)

例如，将长度分别为0.5kb、1kb、2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，载体与各片段最适使用量为：

线性化克隆载体最适使用量：0.02×5000＝100ng；

0.5kb插入片段最适使用量：0.02×500＝10ng；

b.阴性对照-1可用来确认线性化克隆载体中有无环状质粒残留，推荐进行。

c.阴性对照-2当插入片段扩增模板是与克隆载体抗性相同的环状质粒时，推荐进行。建议将线性化载体与插入片段的环状质粒残留检测独立进行。

d.阳性对照反应可用来排除其他实验材料及操作因素的影响。

3.使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。

4.在37℃下反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

▲推荐在PCR仪等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。

▲重组产物可于-20℃存放一周，待需要时解冻转化即可。

4)重组产物转化：

A：在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(如：DH5αCompetent cell，Vazyme#C502)。

B：取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。注意：重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2～3min。

C：加入900μl SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。

D：将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5，000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。

E：37℃培养箱中倒置培养15h。

5)重组产物鉴定：过夜培养后，重组反应转化平板上形成数百个单克隆，而阴性对照反应转化平板上的克隆数应显著少于前者。首先使用PCR检测目的片段是否插入CLBV侵染性克隆中，确认无误后将质粒或菌液送至杭州擎科公司(http://www.tsingke.net/)进行测序，建成后的质粒如下图(图2)所示。

实施例2

构建的CLBV病毒侵染性克隆侵染能力验证

使用CLBV-YFP病毒侵染性克隆进行预实验，用烟草首先检验病毒病毒侵染性克隆的活性，需对烟草苗叶片进行含有病毒侵染性克隆载体农杆菌的浸润，并在后续的实验中取新叶进行荧光观察。

1)将质粒CLBV-YFP用冻融转化法导入GV3101感受态中，选取在双抗板上生长的单斑于700μlYEP培养基中，通过pcr扩增并测序验证序列准确性，50％甘油保存菌种。

2)在特定抗生素的YEP固体培养基上划单斑，28℃黑暗培养箱，两天后观察。

3)挑取农杆菌接种于5mLYEP液体培养基，在180rpm，28℃振荡培养过夜(16h)，至OD₆₀₀＝1.5。

4)以1：100的比例转接至新鲜YEP液体培养基，在180rpm、28℃条件下振荡培养过夜(16h)，至OD₆₀₀＝0.8。

5)3000rpm离心10min，去上清，重悬菌体，重复共两次。

6)使用浸润缓冲液重悬菌体(可先用菌液一半体积的重悬液)。

7)测量重悬液OD₆₀₀的数值。.

8)使用浸润缓冲液调整载体菌液至OD₆₀₀＝0.2，P19重悬液至OD₆₀₀＝0.2，等体积混合菌液。其中，配制烟草瞬时表达的浸润缓冲液，配方如下：0.5M MES 1ml、20mM Na₃PO₄1ml、D-葡萄糖50mg、1M乙酰丁香酮1μl、水(一般情况下最先加入)补齐至10ml。

9)取生长40天左右的，并且叶片浓绿、厚实的本氏烟进行实验。

10)用1ml注射器将农杆菌菌液从背面注射至小叶烟草叶肉(见图12)，吸水纸吸去叶片表面多余的菌液。

11)放有盖子的育苗盆中，光照10000lux；温度24～28℃；湿度50％-60％，15天后共聚焦观察注射部分的荧光结果。

荧光结果结果见图3。可以看到，病毒在第15天时可在烟草叶片中表达出绿色荧光，说明本研究所构建的病毒侵染性克隆具有侵染和表达外源基因的活性。

实施例3

通过真空浸润柑橘扦插枝条接种CLBV的方法

1)使用冻融转化法将实施例1构建的CLBV侵染性克隆导入GV3101感受态中，选取在Kana和Rif板上生长形态正常的单斑于700μl YEP培养基中，通过PCR扩增并测序验证侵染性克隆序列准确性，使用50％甘油保存菌种。

2)在含有Kana和Rif的YEP固体培养基上进行单斑分离，28℃黑暗培养箱，两天后观察。

3)挑取农杆菌于5mLYEP液体培养基(+50mg/L Kana+50mg/L Rif)，180rpm，28℃振荡培养过夜(16h)，至OD₆₀₀＝1.5。

4)以1：100转接至新鲜YEP液体培养基(+50mg/LKana+50mg/L Rif)，180rpm，28℃振荡培养过夜(16h)，至OD₆₀₀＝1。

5)3000rpm离心10min，去上清，重悬菌体，重复共两次。

6)使用浸润缓冲液重悬菌体(可先用菌液一半体积的重悬液)。

7)测量重悬液OD₆₀₀的数值。

8)使用浸润缓冲液调整载体菌液至OD₆₀₀＝1，P19重悬液至OD₆₀₀＝1，等体积混合菌液，26℃黑暗放置3h，得到浸润液。

9)选择4mm的蛭石，高温灭菌锅121℃灭菌15min，冷却后装入扦插盆中，厚度为3.5cm，加入适量清水，使蛭石湿润但底部不积水为宜。

10)在气候室中选取直径在1cm的柑橘(分别为香橼、枳橙和柠檬)枝条，去掉每片叶片的绝大部分，用修枝剪剪成15cm长的小枝条，并将形态学上端朝下放入合适的烧杯中，在烧杯中加入摸过枝条1cm的步骤8)中的菌液，放入真空泵中，抽至真空状态后静置等待20min，使菌液充分进入柑橘枝条中(如图4)。然后使恢复大气压，取出扦插枝条，生态学下端插入步骤9)中的蛭石中，株距为6cm，覆盖配套的透明盖子保湿。每种不同的质粒必须扦插在单独的育苗盘中。

11)培养期间使用加热垫使土温保持在28℃，光照5000lux，湿度85％；

土壤保持湿润且不积水，待新叶和新根张出，20天后可移除盖子新叶长出(如图5)，再过10天左右，根就能长得很不错(如图6)，30天可检测病毒侵染情况如图7、图8所示。

实施例4

携带病毒的侵染性克隆可以作为长期稳定病毒接种来源

1.将病毒侵染成功的柑橘嫁接到不含病毒的甜橙上，选择嫁接的方式是芽接。为了嫁接的成功，选择健壮无病的甜橙。

1)携带病毒的柑橘接穗嫁接至甜橙：用嫁接刀在病毒接种成功的半木质化柑橘枝条上取一个或多个完整健康的芽(或者韧皮部)，为了保证芽的完整，需要在上下距离芽0.5-1cm的地方往芽的方向切，由薄切厚，形成一个比较平整的切面，使芽完全取下来(小小的一片约1.5cm)。在甜橙枝条上，用嫁接刀由下向上切，形成一个平整的切面，这个切面的直径与接穗的切面直径相近。用嫁接膜将芽两端的韧皮部和枝条紧密固定，再在芽位置用嫁接膜覆盖固定，一层即可，确保两者结合的形成层贴合紧密。

2)甜橙嫁接到携带病毒的柑橘上：用嫁接刀在半木质化甜橙枝条上取一个或多个完整健康的芽(或者韧皮部)，为了保证芽的完整，需要在上下距离芽0.5～1cm的地方往芽的方向切，由薄切厚，形成一个比较平整的切面，使芽完全取下来(小小的一片约1.5cm)。在携带病毒的柑橘枝条上，用嫁接刀由下向上切，形成一个平整的切面，这个切面的直径与接穗的切面直径相近。用嫁接膜将芽两端的韧皮部和枝条紧密固定，再在芽位置用嫁接膜覆盖固定，一层即可，一定确保两者结合的形成层贴合紧密。

约一周后形成层就会形成明显的连接的愈伤组织，培养至接穗生长出新叶，一个月后便可在甜橙上检测病毒传播情况。具体见图6和图9。

2.检测甜橙上病毒的传导效率

通过使用Vazyme公司的试剂盒提取新嫁接的甜橙接穗中RNA或甜橙植株新叶中RNA，反转cDNA，通过常规PCR检测或者荧光定量PCR验证病毒的传播，本实验采取的常规PCR检测。

1)每次均用干净的PE手套提取香橼的新叶，避免交叉污染；

2)使用Vazyme公司的试剂盒提取RNA；

3)使用Vazyme公司的试剂盒转录成cDNA；

4)使用snapgene设计引物；

5)使用常规PCR检测；

具体引物如下：

CP-F：CATTGCAAATGATGAGCGACCTC(SEQ ID NO:12)；

CP-R：CATCCGCCCATGCCAG(SEQ ID NO:13)。

通过常规PCR来检测植物中CLBV病毒中CP的是否表达。

反应体系如下：

反应程序如下：

反应结束后通过电泳观察并测序。

图7为甜橙新叶的PCR扩增产物的电泳图，测序后将测序比对到质粒序列上，结果见图8。由图7和图8可知，甜橙上已经成功感染病毒。

图10为甜橙接穗的PCR扩增产物的电泳图，测序后将测序比对到质粒序列上，结果见图11。由图10和图11可知，甜橙接穗已经成功感染病毒。

6)使用荧光定量仪器进行荧光定量PCR；

具体引物如下：

RdRp-RT-F：AATCCGTCTTCCCTTCTG(SEQ ID NO:2)；

RdRp-RT-R：GCATCTTATTTGGACCTTTT(SEQ ID NO:3)；

MP-RT-F：GTGTCGGTAGCATTCAGG(SEQ ID NO:4)；

MP-RT-R：CGTGTCGCACTCTATCTTAT(SEQ ID NO:5)；

CP-RT-F：AGAAATACTCCTCCTGAAA(SEQ ID NO:6)；

CP-RT-R：TAGTCTAACGCTCCCATC(SEQ ID NO:7)；

GAPDH-RT-F：AATCAATGGGTTTGGTAGA(SEQ ID NO:8)；

GAPDH-RT-R：TCGTACTTGAGGAGGTGAG(SEQ ID NO:9)。

前三组为分别检测CLBV三个编码基因表达水平的荧光定量验证引物；最后一组是用来检测植物内参基因(RdRp、CP、MP、GAPDH即为对应的基因)的荧光定量验证引物。

反应体系如下：

反应程序如下：

6)通过浸润后不同时间段对扦插枝条采样，来分析病毒传播的时间长短，并检测病毒的有效性。

根据普通PCR的测序结果和原始CLBV的序列对比可以判断CLBV病毒在新叶上传播的有效；或者根据qPCR的CT值结果小于30时，判断在新叶中是已经传播上病毒了。

不同品种的枝条的存活情况：

1)香橼，能够快速繁殖，扦插存活率在90％以上，真空浸润的成活率均在90％以上，一个月内(一般为2～3周)能够实现新芽新根的生长，能够高效传导CLBV病毒。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江农林大学

浙江养生堂天然药物研究所有限公司

浙江大学

赣南师范大学

<120> 一种柑橘的病毒接种方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aatccgtctt cccttctg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcttatt tggacctttt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgtcggtag cattcagg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtgtcgcac tctatcttat 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaatactc ctcctgaaa 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tagtctaacg ctcccatc 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatcaatggg tttggtaga 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcgtacttga ggaggtgag 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatgataga ttgagaaaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcctgaattc tggcatgggc 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cattgcaaat gatgagcgac ctc 23

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catccgccca tgccag 16

Claims

1.一种柑橘的病毒接种方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述农杆菌菌液和P19重悬液混合，得到侵染液；

2.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述柑橘包括以下一种或几种：‘柠檬’、‘枳橙’和‘香橼’。

3.根据权利要求1或2所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述柑橘为健康的1～2年生的柑橘植株。

4.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述柑橘枝条的直径为0.5～1cm；

所述柑橘枝条的长度为10～15cm；

5.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述浸没时，将所述柑橘枝条的形态学上端朝下浸没在所述侵染液中；

所述浸没的时间为15～30min。

6.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述真空条件的压力为0.1～2.0pa。

7.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述农杆菌重悬液和P19重悬液等体积混合；

农杆菌重悬液的OD值为1；所述P19重悬液的OD值为1；

农杆菌重悬液的溶剂为浸润缓冲液；所述浸润缓冲液含有以下浓度的组分：0.05M 2-吗啉乙磺酸、2mM Na₃PO₄、5mg/ml D-葡萄糖、0.1M乙酰丁香酮。

8.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述待接种的病毒包括柑橘叶斑病毒、柑橘衰退病毒和烟草脆裂病毒。

9.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述接种方法还包括将所述感染病毒的柑橘枝条进行扩繁。

10.根据权利要求1所述柑橘的病毒接种方法，其特征在于，所述扩繁的方法包括将所述感染病毒的柑橘枝条嫁接至无病毒的健康柑橘植株上或将柑橘的健康芽嫁接至感染病毒的柑橘枝条上生长。