CN114381414A - 一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法 - Google Patents

一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，先构建增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，再将荧光标记柑橘黄单胞杆菌悬浮液注射或喷施接种于待评估柑橘品种叶背，经温室培养后取叶片进行研磨，研磨液在荧光显微镜下观察并进行荧光光斑计数，计算细菌增长变化，进行溃疡病抗性评估。本发明研究表明，增强黄色荧光蛋白(eYFP)不影响柑橘黄单胞杆菌(Xcc)的生长和毒力，且eYFP标记Xcc可成功用于定量细菌浓度和评估柑橘对溃疡病的抗性，比平板菌落计数法更快更有效，且与野生柑橘黄单胞杆菌具有一致性，可实现快速评价柑橘品种对溃疡病的抗性。

Description

一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法
技术领域
本发明涉及植物抗病性评估技术领域，更具体地，涉及一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法。
背景技术
柑橘是世界三大重要的经济水果作物之一。柑桔溃疡病(CBC)是最具毁灭性的细菌病害之一，导致柑橘植株严重落叶、果实受损及果实过早脱落，从而降低柑橘的质量和产量。柑橘溃疡病的病原菌是属于革兰氏阴性细菌柑橘黄单胞杆菌(Xcc)，根据寄主范围和引起植株过敏反应(HR)的能力将该病原菌分为多个致病型(A，Aw和A*，B，和C)。其中，亚洲致病性(XccA)在世界范围内普遍存在，大多数的经济类柑橘品种易受其侵染。XccA通过气孔和和伤口等自然开口侵染柑橘叶片，茎和果实。新叶较成熟叶更易感病。此外，直径为20-40mm大小的柑橘果实(根据品种)易感病，但随着果实接近完全展开，它们产生抗性。
柑橘溃疡病是通过转录激活因子PATHA4及它的同源物引起肥大和增生症状(溃疡病症状)，转录激活效应物是通过III型分泌系统(T3SS)进入植物细胞核，诱导溃疡病易感基因LOB1的表达。这一关键特性已被用来培育抗溃疡病柑橘品种，通过突变LOB1启动子区域或编码区域的PthA4结合元件来实现。除T3SS和T3SS效应子之外，与生物膜有关的毒力因子，黄原胶，脂多糖类，及附生植物的适应性同样在Xcc的侵染周期中起重要作用。
目前未有柑橘溃疡病发生的柑橘产区，如地中海和澳大利亚，主要是依靠检疫措施防控溃疡病。重要地是，2018年首次报道溃疡病在澳大利亚出现，直至2021年4月12日，通过清除所有的感病植株使澳大利亚摆脱了溃疡病的危害。在溃疡病流行地区，柑橘种植者主要使用含铜抗菌产品防止Xcc的侵染。防风林通过减少伤口，因此对溃疡病有积极地控制作用。链霉素和土霉素等抗菌剂也被用于佛罗里达的某些柑橘产区。吡虫啉及相关系统获得性耐药(SAR)诱导化合物作用于土壤，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过土壤渗水或叶片渗透外源施用，纳米氧化锌叶面喷施，生物膜抑制剂，及根际细菌作用于根部对溃疡病呈现积极地控制效果。然而，常用的控制溃疡病措施成本高，且造成严重的环境污染，比如铜在土壤中的堆积。
利用抗病作物品种管理病害是最有效和最生态化的方法。某些柑橘品种和野生柑橘种质资源对溃疡病有抗性。有趣地是，金桔已被用来培育抗溃疡的杂交种，即四季桔和莱姆金桔。鉴别抗溃疡病的野生柑橘种质资源是至关重要的，这有助于育种专家进行常规育种或利用微生物技术方法进行遗传改良。目前，喷施和渗透接种是评估柑橘品种抗溃疡病的通用方法(Deng,Z.N.,Xu,L.,Li,D.Z.,Long,G.Y.,Liu,L.P.,Fang,F.,and Shu,G.P.2010.Screening citrus genotypes for resistance to canker disease(Xanthomonas axonopodis pv.citri).Plant Breeding 129:341-345.；Teper,D.,Xu,J.,Li,J.,and Wang,N.2020.The immunity of Meiwa kumquat against Xanthomonas citriis associated with a known susceptibility gene induced by a transcriptionactivator-like effector.PLoS Pathog 16:e1008886.)。抗性分类主要依据症状表现，比如病变或过敏反应及Xcc在植物中的浓度。具体来说，菌浓度依据涂板测细菌生长量来确定，然而这种方法即费时又费力，因此亟需建立一种柑橘种质资源抗溃疡病的快速评价方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌。
本发明的第二个目的在于提供增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌在快速评估柑橘品种对溃疡病抗性中或在制备快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法。
本发明的第四个目的在于提供一种用于快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒。
本发明的第五个目的在于提供增强黄色荧光蛋白在制备不影响柑橘黄单胞杆菌生长、致病性的转基因柑橘黄单胞杆菌中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，是将增强黄色荧光蛋白基因eYFP转化至柑橘黄单胞杆菌Xcc中，获得Xcc-eYFP菌株。
本发明研究表明，增强黄色荧光蛋白(eYFP)不影响柑橘黄单胞杆菌(Xcc)的生长和毒力，且eYFP标记Xcc可以成功地用于定量细菌浓度和评估柑橘对溃疡病的抗性，比平板菌落计数法更快更有效，且与采用野生柑橘黄单胞杆菌进行抗性评估结果具有一致性。
优选地，是将增强黄色荧光蛋白基因eYFP克隆到广宿主蛋白表达或克隆载体质粒中，构建重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，然后在含抗生素的LB培养基上培养筛选，再将从大肠杆菌转化子中提取的质粒DNA重新导入柑橘黄单胞杆菌中，获得Xcc-eYFP菌株。
进一步优选地，是将eYFP编码区转化至柑橘黄单胞杆菌中，所述eYFP编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步优选地，所述柑橘黄单胞杆菌为亚洲致病性柑橘黄单胞杆菌。
进一步优选地，所述广宿主蛋白表达或克隆载体质粒为pBBR1-MCS5，重组质粒为pBBR1-eYFP。
本发明还提供所述转增强黄色荧光蛋白的柑橘黄单胞杆菌在快速评估柑橘品种对溃疡病抗性或在制备快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒中的应用。
一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，是将增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌Xcc-eYFP的悬浮液接种于待评估的柑橘品种叶片上，培养，研磨，研磨液在荧光显微镜下观察荧光斑，进行荧光光斑计数。
优选地，是将Xcc-eYFP悬浮液注射或喷施接种于待评估柑橘品种叶背，经温室培养后取叶片进行研磨，研磨液在荧光显微镜下观察并进行荧光光斑计数，计算细菌增长变化，进行溃疡病抗性评估。
进一步优选地，所述培养条件为将接种Xcc-eYFP的叶片置于28℃、湿度为60％、光照时间为12h的培养箱中察并记录发病情况。
本发明还提供一种用于快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒，所述试剂盒含有上述任一所述转增强黄色荧光蛋白的柑橘黄单胞杆菌。
本发明还提供所述增强黄色荧光蛋白在制备不影响柑橘黄单胞杆菌生长、致病性的转基因柑橘黄单胞杆菌中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌Xcc-eYFP，本发明研究表明，eYFP蛋白不影响Xcc的生长和毒力，eYFP标记Xcc可以成功地用于定量细菌浓度和评估柑橘对溃疡病的抗性；基于此开发了一种基于eYFP标记的Xcc来快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，所述方法将所需的时间从几天减少到数小时，所述方法不仅快速，同时不需要在琼脂培养基上进行电镀，降低了成本和劳动力，基于Xcc和Xcc-eYFP的抗性评估也得到了一致的结果。此外，报告基因方法比传统的电镀和菌落计数方法更稳固，而且使用荧光定量菌落反映了实时的细菌种群，还不需要稀释培养细菌细胞，简单便捷。通过本发明可以快速评估柑橘品种对溃疡病抗性，可以在传统的育种环境中使用或通过生物科学手段鉴定抗溃疡病基因，以提高经济类柑橘品种对病害的抗性。
附图说明
图1为在共聚焦显微镜下观察Xcc-eYFP的荧光。Xcc-eYFP在NB培养基中培养，然后离心收获，首先用ddH2O洗涤3次，再用10μL ddH2O重悬，然后用共聚焦显微镜观察。左：Xcc-eYFP在荧光显微镜下的图像。中：Xcc-eYFP在明场下的图像。右：荧光和明场的叠加。实验重复3次，结果相似。
图2为Xcc和Xcc-eYFP生长和致病性的比较。A：Xcc和Xcc-eYFP在NB培养基中的细菌生长曲线。细菌在NB培养基中在28℃下以200rpm振荡生长32小时。实验重复3次，结果相似。显示了来自一个代表性结果的三个重复的平均值和标准偏差。竖线代表平均值的标准偏差。B：在3dpi下以5×108cfu/mL接种Xcc和Xcc-eYFP的哈姆林甜橙叶的溃疡症状。实验重复3次，结果相似。左：哈姆林甜橙，右：滑皮金橘.cfu：菌落形成单位。dpi：接种后的天数。C：Xcc和Xcc-eYFP诱导的CsLOB1基因表达。在不同时间点从注射的哈姆林甜橙和滑皮金橘叶中提取mRNA样品。左：哈姆林甜橙，右：滑皮金橘。管家基因GAPDH用作内源对照。显示了来自一个代表性结果的三个重复的平均值和标准偏差。竖线代表平均值的标准偏差。每组三片叶子的表达值标准化为GAPDH的表达。实验重复3次，结果相似。在相同dpi的哈姆林甜橙和金橘叶中，与Xcc-eYFP相比，Xcc中的Log2(倍数变化)没有显着差异(Student's t检验，p值<0.05)。
图3为使用Xcc-eYFP评估柑橘基因型对溃疡病的敏感性。A：六种柑橘基因型叶片的溃疡病症状。用注射器以5×108cfu/mL接种Xcc菌株。照片是在接种后3天(dpi)拍摄的。B：在荧光显微镜下观察荧光Xcc-eYFP。从以5×108cfu/mL Xcc-eYFP在3dpi接种的柑橘叶收集样品。比例尺表示100μm。该测定进行3次，每次8片叶子，结果相似。模拟处理用无菌ddH2O进行。1.彝良香橼，2.江津酸橙，3.大理香橼，4.卡里佐枳橙，5.宜昌橙，6.哈姆林甜橙。该图表示接种点和不同的注射器处理。
图4为用于定量Xcc-eYFP的常规和荧光点计数方法的比较。哈姆林甜橙叶以5×106cfu/mL接种Xcc-eYFP。Xcc-eYFP的定量是通过在荧光显微镜下计数荧光Xcc-eYFP并使用传统的平板菌落计数方法进行的。FSC：荧光点计数，PCC：平板菌落计数。cfu：菌落形成单位。dpi：接种后的天数。实验重复3次，结果相似。显示了来自一个代表性结果的五次重复的平均值和标准。竖线代表平均值的标准偏差。
图5为Xcc和Xcc-eYFP在不同柑橘品种中柑橘溃疡病表型的比较。A：20种柑橘基因型叶片的溃疡病症状。用注射器以5×108cfu/mL接种Xcc菌株。照片是在接种后3天(dpi)拍摄的。实验重复3次，结果相似。cfu：菌落形成单位。dpi：接种后的天数。1-20代表不同柑橘品种：1.甜橙，2.崇义野柑，3.香橙，4.大理香橼，5.莽山野柑，6.酸橙，7.彝良香橼，8.枳橙，9.宜昌橙，10.海南山金柑11.马蜂橙，12.滑皮金橘，13.龙岩山金柑，14.霸王山金柑，15.红河橙，16.道县野橘，17.广东柠檬，18.酸柚子，19.哈姆林甜橙，20.野生柚。该图代表接种点和不同的注射器处理。
图6为不同柑橘品种Xcc和Xcc-eYFP生长的比较。柑橘叶使用无针注射器以5×106cfu/mL接种Xcc或Xcc-eYFP。实验重复3次，结果相似。PCC：平板克隆计数，FSC：荧光克隆计数。实验重复3次，结果相似。显示了来自一个代表性结果的五次重复的平均值和标准偏差。垂直条表示平均值的标准偏差。cfu：菌落形成单位。dpi：接种后的天数。1-20代表不同柑橘品种：1.甜橙，2.崇义野柑，3.香橙，4.大理柚，5.芒山野柑，6.酸橙，7.宜良柚，8.枳橙，9.宜昌橙，10.海南山金柑，11.马蜂橙，12.滑皮金橘，13.龙岩山金柑，14.霸王山金柑，15.红河橙，16.道县野橘，17.广东柠檬，18.酸柚子，19.哈姆林甜橙，20.野生柚。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
菌株，植株和生长条件：Xcc亚洲致病型菌株从中国江西省分离得到。所有的菌株菌保存在15％的甘油中，并保存在-80℃冰箱中。大肠杆菌细胞在LB培养基上，37℃的培养箱中培养。Xcc菌株活化并在NB培养基和含有相应抗生素的NA培养基上，28℃的培养箱中培养。本发明中使用的柑橘种质资源如表1所示。所有的柑橘植株都是从种子发芽，种植在土壤中，在光照16h和黑暗8h，28/26℃的温度循环，80％的湿度的温室中生长。完全展开的新叶(大概2周左右)被用于研究。
表1
Figure BDA0003422131520000061
植物接种，致病性试验和细菌生长量测定：细菌被接种在完全展开的叶片上(Zhang et al.,2019)。Xcc菌株用10mM MgCl2 or ddH2O稀释至所需浓度。本发明采用两种浓度：每毫升5×108个菌落形成单位(cfu/mL)监测致病性试验，采用5×106cfu/mL监测细菌在植物中的生长。一到四年生的干那句植株的完全展开的的新叶(出芽后的两至三周)。首先在柑橘叶片背面刺一个小孔，以促进接种过程中细菌悬浮液的扩散。然后用无针注射器将5×106cfu/mL的1mL细菌悬液注入柑橘叶片的背面表面。然后将植株置于可控温室中，28℃，光周期16小时，暗周期8小时。为了测量细菌在植物中的生长情况，用无菌水冲洗接种的叶片，以去除叶片表面的Xcc。在接种区域采集1cm2的叶圆片，放在1mL的ddH2O中进行研磨。取10μL的不同浓度的10倍稀释液涂在NA培养基上，并进行菌落计数。在不同的时间点用数码相机观察和捕捉接种叶片的症状(佳能EOS，200D))。致病性试验采用5×108cfu/mL的菌液进行接种。
实施例1增强型黄绿色荧光蛋白(eYFP)质粒与Xcc-eYFP菌株的构建
一、方法
将eYFP编码区(SEQ ID NO.1)：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgcagtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtga；克隆到pBBR1-MCS5质粒中，构建了广域宿主的载体pBBR1-eYFP。将pBBR1-eYFP的重组质粒转入DH5a大肠杆菌感受态细胞，然后在含有20μg/mL大霉素的LB培养基上培养筛选。用电穿孔法将从大肠杆菌转化子中提取的质粒DNA重新导入Xcc亚洲菌株感受态细胞中。用于Xcc转化的GenePulser Xcell(Bio-Rad，Irvine，CA，USA)系统在以下条件下进行：1mm试管，2400V电压，电容25μF。将重建的Xcc菌株涂布在含有20μg/ml庆大霉素的NA培养基上。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Bio-Rad)测定DNA浓度。所有构建的质粒均经PCR和限制性酶切法鉴定。同时，用LUYOR-3415RG手持灯(Luyor，中国上海)进行荧光观察，验证Xcc-eYFP菌株；并按照上述方法进行致病性试验和细菌生长量测定。
二、结果
利用广域宿主载体pBBR1-MCS5在Xcc菌株中表达eYFP(以下简称Xcc-eYFP)。用荧光显微镜验证eYFP的表达(如图1所示)。Xcc-eYFP与Xcc在NB培养基上的生长曲线相似(如图2A所示)。此外，Xcc-eYFP在哈姆林甜橙和滑皮金柑上引起的反应与野生型Xcc菌株相似(如图2B所示)，它们分别是对溃疡病敏感和抗性柑橘基因型。已知Xcc通过TAL效应子PthA4诱导溃疡易感基因LOB1引起溃疡症状(Hu et al.,2014；Zhang et al.,2017；Duan etal.,2018)。本实施例中，我们检测了在哈姆林甜橙和金柑叶片上由Xcc和Xcc-eYFP菌株诱导的LOB1基因的表达(如图2C所示)。在不同时间点对LOB1的诱导作用相似，与宿主的反应一致。以上结果表明，eYFP不影响Xcc的生长和致病性。
进一步，利用荧光显微镜进一步监测在彝良香橼、江津酸橙、大理香橼、卡里佐枳橙、宜昌橙和哈姆林甜橙柑橘品种上Xcc-eYFP菌株的生长情况。在接种后第3天记录接种叶片上的溃疡病症状(如图3A所示)，在以上6种柑橘品种测试中，江津酸橙、卡里佐枳橙和哈姆林甜橙叶片上观察到病变症状，但在彝良香橼、大理香橼和宜昌橙品种上未观察到病变症状。这与前期报道的香橼和宜昌橙抗柑橘溃疡病的报道一致(Deng et al.,2010)。将接种区域均质稀释，在荧光显微镜下观察荧光斑(如3B所示)。我们观察到，江津酸橙、卡里佐枳橙和哈姆林甜橙上Xcc-eYFP浓度高于彝良香橼、大理香橼和宜昌橙(如图3B所示)，这与其相应的症状相符(如图3A所示)。因此，荧光Xcc亚洲菌株可用于柑橘品种对溃疡病的抗性评估。
实施例2常规和荧光斑点计数法测定Xcc的比较
在培养基上用平板稀释计数法是测定细菌生长量的常用方法，但这种方法费时又费力。本发明的目的是利用荧光显微镜计数Xcc-eYFP的荧光量来简化和加快Xcc的定量。为了验证该方法的准确性，我们采用传统的电镀法和荧光光斑计数法对从受感染叶片中提取的Xcc-eYFP进行了定量分析。在接种后1、3、5、7、9天(dpi)，从接种的哈姆林甜橙叶片中提取Xcc-eYFP。两种方法在所有时间点观察到Xcc-eYFP的细菌浓度相似(如图4所示)，表明荧光光斑计数方法的准确性与传统的平板菌落计数方法一致。其次，荧光斑点计数法测定的浓度标准差低于平板菌落计数法的标准差。
实施例3利用Xcc-eYFP评估柑橘品种对溃疡病的易感性
将浓度为5×108cfu/mL的Xcc-eYFP和Xcc接种在20个柑橘品种上，其中包括18个野生柑橘种质(表1)。分别接种了Xcc-eYFP和Xcc的柑橘品种上观察有相似的症状出现(如图5所示)。在这20种柑橘品种中，大理香橼、宜良香橼、宜昌橙、滑皮金柑、龙岩金桔、霸王金桔和道县野橘没有或表现明显减轻的溃疡病症。相反的，屏边野生甜橙，建水香橙，龙门柠檬，崇义野橘，莽山野橘，江津酸橙，卡里左枳橙，乐东金桔，马蜂橙，红河橙，勐腊酸柚和城固野生柚表现典型的溃疡病症状。
根据Xcc-eYFP和Xcc在植物中的生长情况，大理香橼、宜良香橼、宜昌橙、滑皮金柑和霸王金桔中的细菌浓度最低。崇义野橘、莽山野橘、乐东金桔、马蜂橙、红河橙、龙岩金桔、道县野橘的细菌浓度低于屏边野生甜橙、建水香橙、龙门柠檬、江津酸橙、卡里左枳橙、勐腊酸柚、哈姆林甜橙、城固野生柚(如图6所示)。
本发明研究表明，eYFP蛋白不影响Xcc的生长和毒力，eYFP标记Xcc可以成功地用于定量细菌浓度和评估柑橘对溃疡病的抗性；基于此开发了一种基于eYFP标记的Xcc来快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，所述方法将所需的时间从几天减少到数小时，所述方法不仅快速，同时不需要在琼脂培养基上进行电镀，降低了成本和劳动力，基于Xcc和Xcc-eYFP的抗性评估也得到了一致的结果。此外，报告基因方法比传统的电镀和菌落计数方法更稳固，而且使用荧光定量菌落反映了实时的细菌种群，还不需要稀释培养细菌细胞，简单便捷。通过本发明可以快速评估柑橘品种对溃疡病抗性，可以在传统的育种环境中使用或通过生物科学手段鉴定抗溃疡病基因，以提高经济类柑橘品种对病害的抗性。
序列表
<110> 赣南师范大学
<120> 一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法
<141> 2021-12-20
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 720
<212> DNA
<213> 增强黄色荧光蛋白基因(eYFP)
<400> 1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720

Claims (10)

1.一种增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，其特征在于，将增强黄色荧光蛋白基因eYFP转化至柑橘黄单胞杆菌中，获得Xcc-eYFP菌株。
2.根据权利要求1所述增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，其特征在于，将增强黄色荧光蛋白基因eYFP克隆到广宿主蛋白表达或克隆载体质粒中，构建重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，然后在含抗生素的LB培养基上培养筛选，再将从大肠杆菌转化子中提取的质粒DNA重新导入柑橘黄单胞杆菌中，获得Xcc-eYFP菌株。
3.根据权利要求1或2所述增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，其特征在于，是将eYFP编码区转化至柑橘黄单胞杆菌中，所述eYFP编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1或2所述增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，其特征在于，所述柑橘黄单胞杆菌为亚洲致病性柑橘黄单胞杆菌。
5.根据权利要求2所述增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌，其特征在于，所述广宿主蛋白表达或克隆载体质粒为pBBR1-MCS5，重组质粒为pBBR1-eYFP。
6.权利要求1～5任一所述转增强黄色荧光蛋白的柑橘黄单胞杆菌在快速评估柑橘品种对溃疡病抗性或在制备快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒中的应用。
7.一种快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，其特征在于，将增强黄色荧光蛋白标记的柑橘黄单胞杆菌Xcc-eYFP的悬浮液接种于待评估的柑橘品种叶片上，培养，研磨，研磨液在荧光显微镜下观察荧光斑，进行荧光光斑计数。
8.根据权利要求7所述快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述培养条件为将接种Xcc-eYFP的叶片置于28℃、湿度为60％、光照时间为12h的培养箱中察并记录发病情况。
9.一种用于快速评估柑橘品种对溃疡病抗性的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～5任一所述转增强黄色荧光蛋白的柑橘黄单胞杆菌。
10.增强黄色荧光蛋白在制备不影响柑橘黄单胞杆菌生长、致病性的转基因柑橘黄单胞杆菌中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350702A (zh) * 2022-01-27 2022-04-15 浙江农林大学 一种柑橘的病毒接种方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010054348A2 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Two Blades Foundation Pathogen-inducible promoters and their use in enhancing the disease resistance of plants
CN102245775A (zh) * 2008-11-03 2011-11-16 双刃基金会 增强植物对细菌病原体的抗性的方法
CN102559843A (zh) * 2012-03-02 2012-07-11 湖南农业大学 一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法
WO2015200519A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Ting-Yu Yeh Disease control of the plant bacterial pathogens causing citrus canker and rice blight
CN110295185A (zh) * 2019-07-26 2019-10-01 西南大学 一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
US20210189410A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-24 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Targeted editing of citrus genes for disease resistance

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102245775A (zh) * 2008-11-03 2011-11-16 双刃基金会 增强植物对细菌病原体的抗性的方法
WO2010054348A2 (en) * 2008-11-10 2010-05-14 Two Blades Foundation Pathogen-inducible promoters and their use in enhancing the disease resistance of plants
CN102559843A (zh) * 2012-03-02 2012-07-11 湖南农业大学 一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法
WO2015200519A2 (en) * 2014-06-25 2015-12-30 Ting-Yu Yeh Disease control of the plant bacterial pathogens causing citrus canker and rice blight
CN110295185A (zh) * 2019-07-26 2019-10-01 西南大学 一种基于CsWAKL08超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
US20210189410A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-24 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Targeted editing of citrus genes for disease resistance

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
殷幼平;黄冠军;赵云;刘洪;王中康;: "柑桔溃疡病菌实时荧光定量PCR检测与应用", 植物保护学报, no. 06 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350702A (zh) * 2022-01-27 2022-04-15 浙江农林大学 一种柑橘的病毒接种方法

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