CN102559843A - 一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法 - Google Patents
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Abstract
一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法，包括以下步骤：（1）利用三亲本杂交法将广泛寄主载体pMP2463上的增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）导入野生型柑橘溃疡病菌，获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的溃疡病菌；（2）将获得的EGFP标记的柑橘溃疡病菌通过喷雾方式接种到柑橘叶片表面，通过注射方式接种到柑橘叶肉间隙；（3）撕取叶表皮或者利用冷冻切片方法制样，在激光共聚焦显微镜下观察柑橘溃疡病菌在叶表面及叶肉间隙的数量和分布情况。采用本发明，能够利用EGFP标记的柑橘溃疡病菌对该病原菌在侵染柑橘过程中的附着、繁殖和空间分布进行实时观察，从而获得柑橘溃疡病与柑橘互作的时空关系；且操作简便，快捷。
Description
技术领域
本发明涉及一种柑橘溃疡病菌侵染过程观察方法，尤其是涉及一种利用增强型绿色荧光蛋白基因egfp对柑橘溃疡病菌进行标记，实现对柑橘溃疡病菌侵染过程进行实时观察的方法。
背景技术
对柑橘溃疡病菌入侵途径的传统研究手段，主要是扫描电镜和透射电镜两种观察方法，但是，这两种方式均费时、费力，且不能实时地进行跟踪。
利用绿色荧光蛋白基因对病原菌进行标记，可以对病原菌进行快速、原位、实时、活体的观察，有利于观察病原菌的入侵过程和了解病原菌与寄主的互作。
目前，国内外已有不少利用荧光标记这一手段对病原菌进行标记，从而观察植物病原菌与寄主互作的报道。
但是，在柑橘溃疡病菌的研究中，由于多种原因，目前仅限于将绿色荧光蛋白基因作为报告基因与目的基因融合，以辅助研究目的基因。迄今为止，尚无利用绿色荧光蛋白标记对柑橘溃疡病菌侵染过程进行实时观察的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术使用扫描电镜和透射电镜等费时费力的不足，提供一种操作简便快捷的柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法。
本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是， 一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法，包括以下步骤：
（1）利用三亲本杂交法将广泛寄主载体pMP2463上的egfp基因导入野生型柑橘溃疡病菌，使野生型溃疡病菌在不丧失其致病能力的情况下能产生绿色荧光蛋白，这种EGFP在紫外光激发下可经荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测到绿色荧光信号，从而获得EGFP标记的溃疡病菌；
（2）将步骤（1）所得EGFP标记的溃疡病菌通过喷雾方式接种到柑橘叶片表面及通过注射方式接种到柑橘叶肉间隙；
（3）于不同的时间点撕取叶表皮或者利用冷冻切片等快速制样方法制样，EGFP标记的溃疡病菌在激发光的激发下呈绿色，通过激光共聚焦显微镜观察柑橘溃疡病菌在叶片表面及叶肉间隙的数量和分布。
采用本发明，能够利用EGFP标记的柑橘溃疡病菌对该病原菌在侵染柑橘过程中的附着、繁殖和空间分布进行实时观察，从而获得柑橘溃疡病与柑橘互作的时空关系；不同柑橘品种对该病原菌的抗病性也能得到直观体现；操作简便、快捷。
附图说明
图1 是野生型和EGFP标记的柑橘溃疡病菌菌株荧光显微镜观察到的形态及活体针刺接种后的症状图；
图 2是EGFP标记的溃疡病菌侵染冰糖橙叶片的过程图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
本实施例包括以下步骤：
（1）利用三亲本杂交法将供体菌大肠杆菌DH5α所含广泛寄主载体pMP2463上的egfp基因导入野生型柑橘溃疡病菌，获得EGFP标记的溃疡病菌；经EGFP标记的柑橘溃疡病菌在紫外光激发下发出绿色荧光，经荧光显微镜检测到绿色荧光信号，被EGFP 标记的柑橘溃疡病菌，其生长动力学及致病力较野生型没有显著差异；
所述三亲本杂交法使用的供体菌大肠杆菌DH5α (含egfp质粒pMP2463，该质粒具有庆大霉素抗性)由华中农业大学微生物重点实验室提供；辅助菌大肠杆菌DH5α（含mob位点的质粒pRK2013，该质粒具有卡那霉素抗性）由意大利卡塔尼亚大学Vittoria Catara教授提供；受体菌黄单胞杆菌柑橘致病变种 Xac DL509（Xanthomonas axonopodis pv. citriXac DL509，具氨苄青霉素抗性)由本发明者分离得到，该菌株于2012年2月24日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： M 2012034。
（2）将步骤（1）所得EGFP标记的溃疡病菌通过喷雾方式接种到冰糖橙叶片表面及通过注射方式接种到冰糖橙叶肉间隙；
（3）于不同的时间点撕取叶表皮或者利用冷冻切片等快速制样方法制样，EGFP标记的溃疡病菌在激发光的激发下呈绿色，通过激光共聚焦显微镜可观察溃疡病菌在冰糖橙叶表面及叶肉间隙的数量和分布情况。
荧光观察所用显微镜型号为Nikon SMZ1000。
冰糖橙溃疡病菌在叶片表面及叶肉间隙的数量和分布情况观察所用激光共聚焦显微镜型号为Zeiss LSM 710。
图1中：A 为EGFP标记的柑橘溃疡病菌菌株在Nikon SMZ1000显微镜明场下的形态；B为EGFP标记的柑橘溃疡病菌菌株在Nikon SMZ1000显微镜紫外激发光下的形态（带绿色荧光菌落，菌落形态清晰可见）；C为EGFP标记的柑橘溃疡病菌活体针刺接种后的症状；D为野生型柑橘溃疡病菌菌株在Nikon SMZ1000显微镜明场下的形态；E为野生型柑橘溃疡病菌菌株在Nikon SMZ1000显微镜紫外激发光下的形态（非绿色荧光菌落，菌落形态不清晰）；F为野生型柑橘溃疡病菌活体针刺接种后的症状。
图2中：A为喷雾接种冰糖橙叶面后24小时观察到溃疡病菌的分布情况（菌体为白色箭头所指）；B为喷雾接种6天时叶面溃疡病菌的分布情况（菌体为白色箭头所指）；C为B的局部放大图（菌体为白色箭头所指）；D为注射接种2天后冰糖橙叶片叶肉间隙溃疡病菌数量少，叶肉细胞保持正常均匀排列；E为注射接种4天后冰糖橙叶片叶肉间隙溃疡病菌扩散至栅栏组织，叶肉细胞开始出现不规则；F为注射接种14天后冰糖橙叶片叶肉间隙全被溃疡病菌占据，叶肉细胞全部瓦解。
从图2可见，观察EGFP标记的溃疡病菌与感病冰糖橙互作的时空关系，接种前期24小时冰糖橙叶片表面的溃疡病菌数量少，接种6天以后叶片表面聚集大量溃疡病菌，细菌分布于气孔及气孔以外的区域；对于叶肉间隙，接种2天内，溃疡病菌数目少，主要分布在海绵组织，此时海绵组织细胞规则排列；接种4天时，细菌已经扩散至栅栏组织，且数量极显著增加，海绵组织叶绿体分布出现不规则形状；接种14天时，细菌占据了整个叶肉间隙，海绵组织叶绿体细胞全部瓦解。
Claims (1)
1.一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用三亲本杂交法将广泛寄主载体pMP2463上的增强型绿色荧光蛋白基因egfp基因导入野生型的柑橘溃疡病菌，获得增强型绿色荧光蛋白EGFP标记的溃疡病菌；
（2）将步骤（1）所得EGFP标记的溃疡病菌通过喷雾方式接种到柑橘叶片表面及通过注射方式接种到柑橘叶肉间隙；
（3）撕取叶表皮或者利用冷冻切片方法制样，在激光共聚焦显微镜下观察柑橘溃疡病菌在叶片表面及叶肉间隙的数量和分布情况。
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