CN109900536A - 光镜-透射电镜联用样品处理试剂及clem检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种光镜‐透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂、包埋剂：亲水性碱性树脂GMA、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料，并利用提供的光镜‐透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过样品固定、去除背景荧光、样品脱水、渗透、包埋、聚合、超薄切片、激光共聚焦显微镜成像、透射电镜图像获取以及后期图像处理完成。本发明解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息，采用图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜‐电镜联用图像，本发明结合了目标分子的定位信息及超微结构信息，非常实用。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂及利用该试剂进行CLEM检测的方法。
背景技术
了解目标细胞、细胞器的精确结构信息、以及目标蛋白在细胞内的定位及对结构的影响，可以为研究生长、发育、生殖、学习记忆、信号转导、免疫反应、新陈代谢等生命活动提供必要的信息。单独应用荧光显微技术无法获得样品的结构信息，而研究蛋白质的精确定位的免疫胶体金标记电镜技术受限于抗原决定簇难以保存、抗体难以进入树脂而标记成功率低，非特异性背景高等问题，难以被广泛使用而日渐被可同时展现目标细胞、蛋白的荧光信号与细胞内丰富的结构信息光镜-电镜联用(Correlative Light-and ElectronMicroscopy，CLEM)技术所取代。光镜-电镜联用技术方案是先在荧光显微观察体系下获取荧光信号定位信息，之后对样本进行电子着色，转移至电子显微镜体系观察，再根据荧光-电镜定位参照体系提供的位置信息，使用图像处理软件将荧光与图像与电子显微镜图像对应重合，同时获得目标细胞、细胞器或蛋白的定位和超微结构信息。
光镜-电镜联用技术方案中，包埋后荧光观察的方法先对样品进行固定、脱水、渗透、包埋处理，再对完全一致的样品观察荧光信号、电镜图像，具有更高的一致性，可获得较精确的结果，但一方面样品制备技术难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存，包埋后样品信号获得时的超薄片层荧光信号非常弱，结构信息亦不理想；另一方面整合的光镜-电镜设备尚未普及。怎样在包埋后的样品上同时保留良好的荧光信号并维持好的超微结构，并建立便捷稳定的图像归一方法以利用已有荧光显微镜及电子显微镜成为急需解决的问题。
发明内容
本发明目的是提供一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂：戊二醛、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。
进一步地，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂，其中优选为2.5％戊二醛。2.5％戊二醛作为固定剂，样品细胞超微结构保留效果最好。
所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；
进一步地，所述细胞核荧光染料为吖啶橙(Acridine Orange，AO)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)、Diaminophenylindole(DAPI)、Hoechst染料、EthD III、7-AAD或RedDot2中的一种。
进一步地，所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。
本发明的另一个目的是提供利用所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，通过以下步骤实现：
(1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；
(2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液(PBS)处理不少于5分钟，以去除背景荧光；
(3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂(亲水性碱性树脂GMA)渗透、包埋、聚合；
(4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品，便于初步定位目标荧光信号所在区域；
(5)：细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片样品进行细胞核染色，便于精确定位目标荧光信号在细胞中的位置；
(6)激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置；
(7)电子着色：经步骤(5)观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品用透射电镜染料；
(8)透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构；
(9)后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进行重合，同时获得目标荧光信号的定位以及超微结构信息。
进一步地，所述的荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、mVenus荧光蛋白中的一种。
其中步骤(1)所述的样品固定是将带荧光蛋白标记的样品以2.5％戊二醛于4-8℃固定不少于4小时。
进一步地，所述步骤(3)中样品脱水步骤为分别以50％、70％、95％乙醇于4-8℃脱水处理样品。
进一步地，所述步骤(3)中选用亲水性碱性树脂GMA作为包埋剂渗透、包埋、聚合，步骤为以70％、85％、100％GMA依次处理样品；换新的100％GMA后，于-20℃再处理60分钟；换新的100％GMA后，-20℃渗透过夜，再将样品转移至100％GMA中，以低温紫外聚合仪于-20℃聚合不少于72小时。
进一步地，所述步骤(4)为以坐标铜网捞取超薄切片样品。
进一步地，所述步骤(5)中的细胞核荧光染色为以DAPI水溶液对超薄切片样品的细胞核进行荧光染色。
进一步地，所述步骤(7)中电子着色为将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，室温以4％醋酸铀染色、Reynolds’柠檬酸铅染色。
进一步地，所述步骤(9)的后期图像处理为在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120％，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，同时得到EYFP所标示的荧光信号的定位以及超微结构信息。
利用本发明提供的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，解决了现有方法难以兼容荧光信号和样品细胞结构的保存的问题，样品具有较强的荧光信号并能同时保留完好的超微结构信息。图像归一方法简单有效，可方便的将已有的荧光显微镜与透射电镜联用，以获得高一致性的光镜-电镜联用图像，结合了目标分子的定位信息及超微结构信息。
附图说明
图1是以坐标铜网格在激光共聚焦下获得目标的位置信息；其中a.绿色为EYFP通道，蓝色为DAPI通道，明场下可见目标区域所处坐标铜网格位置；b.白色方框所选的a区域的放大；c.白色方框所选的b区域的放大。
图2是透射电镜检测荧光所选定的目标区域的细胞超微结构；其中a.透射电镜下寻找到的与图1同一铜网格；b.白色方框所选的a区域的放大；c.白色方框所选的b区域的放大。
图3是光-电联用揭示目标分子的荧光定位及所在区域的超微结构信息。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。但是，这些实施例并不限制本发明的范围。本文提及的所有公开物中的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用并入本发明，达到明文记载所有这些公开物的程度。
实施例所用的材料与方法
1.实验试剂
人宫颈癌细胞Hela；
大肠杆菌菌株DH5α；
质粒pAcGFP1-Mito(Clontech Cat.No.632432PT 3730-5)；
质粒pEYFP–N1(Clontech Cat.No.6006-1,PT 3192-5)；
胎牛血清蛋白(Fetal Bovine Serum，FBS)(HyClone)；
培养基RPMI 1640(Invitrogen)；
Tag酶(生工)；
高保真DNA聚合酶pfu(Promega)；
T4DNA连接酶(Takara)；
限制性内切酶(Takara)；
质粒DNA分离纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒(QIAgene)；
LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)；
戊二醛(sigma)；
多聚甲醛(sigma)；
硼氢化钠(国药)；
GMAkit(SPI)；
LR White(SPI)；
DAPI(sigma)；
坐标铜网(中镜科仪)
2.实验仪器
PCR仪(Peltier Thermal Cycler)；
高速台式低温离心机(Eppendorf)；
37摄氏度CO2细胞培养箱(Heraus)；
紫外低温聚合仪(中镜科仪)；
超薄切片机(Leica UC7)；
激光共聚焦显微镜(Zeiss)；
透射电子显微镜(FEI TECNAI 10)
实施例1一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂
一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，包括固定剂：2.5％戊二醛、包埋剂：亲水性碱性树脂GMA、0.5％的硼氢化钠、细胞核荧光染料DAPI、透射电镜染料醋酸铀和柠檬酸铅。
所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂，其中优选为2.5％戊二醛。2.5％戊二醛作为固定剂，样品细胞超微结构保留效果最好。
所述细胞核荧光染料为吖啶橙(Acridine Orange，AO)、溴化乙锭(EthidiumBromide，EB)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)、Diaminophenylindole(DAPI)、Hoechst染料、EthD III、7-AAD或RedDot2中的一种。
所述透射电镜染料为醋酸铀或柠檬酸铅。
实施例2：表达了EYFP-Mito分子的细胞的培养
(1)EYFP-Mito融合基因的质粒构建：
以限制性内切酶BamH I/Not I双酶切pAcGFP1-Mito,电泳后回收4.1kb片段；以BamH I/Not I双酶切pEYFP–N1，电泳，以DNA胶回收试剂盒回收0.7kb大小PCR产物，T4DNA连接酶，连接回收的两个片段，转化大肠杆菌DH5α，挑选单克隆小量扩增，所得克隆测序确定序列正确,选取序列正确克隆大量扩增，以质粒DNA分离纯化试剂盒抽提质粒紫外分光光度计测定其浓度；
(2)细胞培养和转染：
37摄氏度CO2细胞培养箱中，以含10％胎牛血清蛋白(fetal bovine serum，FBS)的RPMI 1640培养基培养人宫颈癌Hela细胞，转染前，将细胞均匀传代到10cm的细胞培养皿中，24小时待细胞长至70-80％密度，将分别含12ug EYFP-Mito质粒、30ullipofectmine2000(Invitrogen)的无血清RPMI1640混合，均匀加入培养细胞中，转染Hela细胞；8小时后换液，再过24小时收集细胞。
实施例3：表达了EYFP-Mito分子的细胞的样品处理
(1)样品处理：
确定EYFP-Mito蛋白表达后，弃去培养基上清，以胰蛋白酶将细胞消化下来，培养基中和消化液后2000rpm离心收集，弃上清，以PBS轻洗细胞，分为3等份，去除PBS后分别加以PBS配制的2.5％戊二醛、或以PBS配制的4％多聚甲醛、或混合固定剂(PBS配制的4％多聚甲醛+0.5％戊二醛)，于4℃固定过夜，以0.5％的硼氢化钠的PBS溶液于4℃处理样品5分钟，后续脱水渗透。
于4℃分别以50％,70％，95％乙醇脱水处理样品10分钟，而后将样品于-20℃以70％、85％、100％GMA各处理10分钟；换新的100％GMA后，-20℃再处理60分钟；换新的100％GMA后，-20℃渗透过夜，第二天将样品转移至预装有100％GMA的PCR管中，填满GMA，盖紧盖子，以低温紫外聚合仪于-20℃聚合72小时；
将聚合好的样品以超薄切片机(Leica UC7)切成100nm的超薄切片，以200目坐标铜网捞片。
(2)激光共聚焦显微镜图像获取：
室温下以1ug/ml的DAPI水溶液对坐标铜网上的超薄切片样品的细胞核染色5分钟，ddH2O洗涤2次，置于玻片上，加少量PBS，覆以盖玻片，将盖玻片的四周封片。在激光共聚焦显微镜的DAPI(exitation:405nm,emission:410-503nm)\YFP(激发波长：514nm,发射波长为519-621nm)通道下，获得表达目标蛋白的细胞的荧光信号及所处铜网格位置(G3)；(3)透射电镜图像获取：
将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，于室温以4％醋酸铀染色15分钟、Reynolds’柠檬酸铅染色5分钟后，置于透射电子显微镜(FEI TECNAI 10)100KV下，低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构。
(4)后期图像处理：
在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120％，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变(ctrl+T)处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，得到EYFP-Mito所处细胞的光镜-透射电镜联用图像，以精确定位EYFP-Mito荧光信号位置，同时获得EYFP-Mito的定位以及超微结构信息。
结果：
(1)2.5％戊二醛固定后的样品经去背景处理具有较好的荧光信号和结构信息：
荧光及透射电镜检测表明：2.5％戊二醛、4％多聚甲醛、混合固定剂三者对于特异性荧光的保留效果几乎一致；使用4％多聚甲醛的样品不存在背景荧光问题，但其结构保存最差；使用2.5％戊二醛作为固定剂的样品背景荧光最强，但细胞超微结构保留效果最好；混合固定剂的背景荧光及结构保留状况处于两者之间。戊二醛对细胞超微结构保留的效果最好(表1)，成为优选固定剂。
表1同固定剂配方对样品荧光信号、结构信息的保留状况，以及背景荧光强度
| 固定剂 | 荧光信号强度 | 超微结构 | 背景荧光强度 |
| 戊二醛 | ﹢﹢+ | ﹢﹢ | ﹢﹢ |
| 多聚甲醛 | ﹢﹢+ | ± | ± |
| 混合 | ﹢﹢+ | ﹢ | ﹢ |
(2)后续以硼氢化钠或DTT处理样品，硼氢化钠的去背景荧光效优于DTT，解决了戊二醛固定所产生的背景荧光问题对后续荧光图像的干扰。
表2硼氢化钠、DTT对样品荧光信号、背景荧光的影响
(3)以0.2％的锇酸或0.2％的醋酸铀处理样品，荧光立即消失。
表3.锇酸、醋酸铀对样品荧光信号的影响
(4)样品脱水、渗透、包埋、聚合的实验参数：
我们的研究发现，以GA固定，以pH为酸性的水性树脂LR white为包埋剂，低温紫外聚合，所获得切片荧光强度较弱；而pH为碱性的水性树脂GMA成为更优选择。但之前报道的以PFA固定EYFP标记目标基因产物的样品，经GMA包埋，55℃聚合、100nm超薄切片后,由于PFA固定效果不理想、55℃对荧光基团会造成破坏荧光强度和透射电镜下的超微结构均不理想。因而GA取代PFA为固定优选，进一步，将GMA于-20℃以UV聚合成为更优选择。
表4.不同渗透、聚合条件对样品荧光信号、结构信息的保存的影响
(5)在激光共聚焦下，可获得目标分子的位置信息：我们使用带有字符的坐标铜网，在荧光图像采集时通过明场通道获得目标区域的位置信息，以便于透射电子显微镜下能找到相应的位置(图1)；另外，细胞核可以方便地被DAPI等荧光染料标记，细胞核结构也可以在透射电镜中稳定被检测到，因而我们利用坐标铜网-细胞核DAPI染色作为光镜-透射电镜联用系统的定位参照系统，将超薄切片捞在坐标铜网上，经DAPI染色后，以激光共聚焦显微镜检测，选取目标蛋白荧光表达较明显的样品区域(G3)(图1a),后续我们对目标区域放大，检测到目标蛋白定位于细胞质的核周围区域，，并同时获取表达目标蛋白的细胞及邻近细胞的细胞核荧光信息(图1b，1c,)。
(6)具有位置信息的目标分子所在区域G3在透射电镜下容易被识别，其超微结构信息可被检测：将激光共聚焦拍摄完毕的样品经醋酸铀、柠檬酸铅染色后，根据目标区域所处铜网格位置，低倍镜下找到目标区域(图2a)，继而在高倍镜下获取目标细胞超微结构图像(图2b,2c)；
(7)获得归一、整合后的EYFP-Mito的激光共聚焦-透射电镜联用图像(图3a，b)。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (10)
1.一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，包括固定剂、包埋剂、硼氢化钠、细胞核荧光染料和透射电镜染料。
2.根据权利要求1所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂为2.5％戊二醛或4％多聚甲醛与0.5％戊二醛混合的固定剂；所述包埋剂为亲水性碱性树脂GMA；所述细胞核荧光染料为吖啶橙、溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、Hoechst染料、EthDIII、7-AAD或RedDot2中的一种；所述透射电镜染料为醋酸铀和柠檬酸铅。
3.根据权利要求2所述的一种光镜-透射电镜联用样品处理试剂，其特征在于，所述固定剂优选为2.5％戊二醛。
4.利用权利要求1所述的光镜-透射电镜联用样品处理试剂进行CLEM检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)样品固定：带荧光蛋白标记的样品以固定剂于4-8℃固定不少于4小时；
(2)去除背景荧光：4-8℃下，步骤(1)的样品以0.5％的硼氢化钠的磷酸缓冲盐溶液处理不少于5分钟，以去除背景荧光；
(3)样品脱水、渗透、包埋、聚合：4-8℃下，样品脱水、-20℃用包埋剂渗透、包埋、聚合；
(4)超薄切片：样品经超薄切片机切片，以坐标铜网捞取超薄切片样品；
(5)细胞核荧光染色：以细胞核荧光染料对坐标铜网上的超薄切片进行细胞核染色；
(6)激光共聚焦显微镜成像：经荧光观察，在激光共聚焦显微镜下找到目标细胞结构和细胞，记录其所在的坐标铜网格的位置；
(7)电子着色：经步骤(5)观察后的位于坐标铜网上的超薄切片样品以透射电镜染料染色；
(8)透射电镜图像获取：以透射电镜低倍寻找到目标区域所在铜网格，以高倍拍摄其超微结构，获得其超微结构；
(9)后期图像处理，利用细胞核荧光染料所标记细胞核，与透射电子显微镜下细胞核图像进行重合，同时获得目标荧光信号的定位以及超微结构信息。
5.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的样品固定是将带荧光蛋白标记的样品以2.5％戊二醛于4-8℃下固定不少于4小时。
6.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中所述荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、mVenus荧光蛋白中的一种。
7.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(3)中样品以亲水性碱性树脂GMA作为包埋剂渗透、包埋、聚合的步骤为以70％、85％、100％GMA于-20℃依次处理样品；换新的100％GMA后，于-20℃再处理60分钟；换新的100％GMA后，-20℃渗透过夜，再将样品转移至100％GMA中，以低温紫外聚合仪于-20℃聚合不少于72小时；脱水步骤为分别以50％、70％、95％乙醇于4-8℃脱水处理样品。
8.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(5)中以DAPI水溶液对超薄切片的细胞核进行荧光染色。
9.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(7)中电子着色为将激光共聚焦拍摄完毕的带铜网玻片置于清水中，划开封片剂，去除盖玻片，取出铜网，室温以4％醋酸铀染色、Reynolds’柠檬酸铅染色。
10.根据权利要求4所述的CLEM的检测方法，其特征在于，其中步骤(9)的后期图像处理为在Photoshop软件中打开荧光图像和电镜图像，新建图像，其像素高、宽度大于荧光/电镜图像的120％，依次复制粘贴电镜图像、荧光图像，成为不同图层，并进行透明化、形变处理，以细胞核为参照，进行光镜、电镜图像处理归一，同时得到EYFP所标示的荧光信号的定位以及超微结构信息。
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Granted publication date: 20201030 |