CN102401792A - 一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，该方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测，能够快速、准确、灵敏的区分大豆北方茎溃疡病菌孢子的死活，可以替代传统的孢子活性检测方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

Description

一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法

技术领域

本发明涉及一种微生物活性检测方法，特别是涉及一种大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell)Sacc.var.caulivora Athow & Caldwell，DPC)的活性检测方法。

背景技术

大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum(Cooke et Ell)Sacc.var.caulivora Athow & Caldwell，DPC)是严重危害大豆生产的一种种传病原真菌，属子囊菌门、子囊菌纲、间座壳目、黑腐皮壳科、间座壳属，无性阶段为拟茎点霉属。

大豆北方茎溃疡病菌能侵染大豆植株的各个生长阶段，植株受侵染的茎组织部位易碎，表皮剥落，形成环形带的环状损伤，严重时导致植株死亡。受侵染的种子皱缩，变轻，外表白垩状。发病严重的田块有80％的植株受到侵染，产量损失高达50％，造成严重的经济损失。该菌主要以带病植物残体及种子进行远距离传播，种子带菌率达10％-20％。近年来该病害发展迅速，在美国、加拿大、阿根廷(Pioli et al.，2003)、厄瓜多尔、巴西(Costamilan et al.，2008)、保加利亚、克罗地亚、塞尔维亚、黑山、法国、意大利、俄罗斯、西班牙、韩国等国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上的重要真菌病害。

病原菌活性检测是检验检疫的一项重要任务，对正确的评价有害生物的入侵风险具有重要意义。为了研究准确、灵敏、快速的检测方法，对大豆北方茎溃疡病菌的检测研究主要集中于分子生物学方面，这类方法如PCR等，能够提高检测效率，但是不能反映病原菌的活性情况。目前，大豆北方茎溃疡病菌活性检测依赖于传统的形态学鉴定方法，该方法因为需要通过10天左右的保湿培养，然后对培养物进行形态学鉴定，所以在进行病原菌形态学鉴定的同时也确定了其活性，因此，真正意义上的单独对大豆北方茎溃疡病菌的活性研究尚未有报道。虽然，通过形态学鉴定能够准确、可靠的检测出大豆北方茎溃疡病菌的活性，但是该方法耗时长，不能很好的满足实际检验检疫工作的需要。

发明内容

本发明的目的是针对上述大豆北方茎溃疡病菌活性检测时间长的问题，提供一种新的简便、快速的大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，该方法采用激光扫描共聚焦显微镜观察经过荧光染料染色的大豆北方茎溃疡病菌孢子，优选的染料为碘化丙啶。

所述活性检测方法中碘化丙啶的染色终浓度为0.05μmol/L-2μmol/L，优选染色浓度为0.05μmol/L-0.06μmol/L。

所述碘化丙啶染料的染色时间为15min-30min，优选为15min，且染色过程于室温避光条件下进行。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的活性检测方法能够有效的区分大豆北方茎溃疡病菌孢子的死活，从制样到检测完成仅需要30分钟，可以直接对单个孢子的染色情况进行死活判断。本发明具有快速、准确、灵敏、重复性好等特点，有望替代传统的通过形态学检测活性的方法，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。

附图说明

图1为本发明一种实施例的大豆北方茎溃疡病菌单个孢子活性检测图，图中A和B为活孢子的扫描结果图，A为激光扫描通道下的扫描结果，孢子内部没有荧光，B为明场通道下的扫描结果，C和D为死孢子的扫描结果图，C为激光扫描通道下的扫描结果，孢子内部显示红色荧光，D为明场通道下的扫描结果。

具体实施方式

本发明公开了一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，包括如下步骤：

(1)孢子悬浮液配制；用灭菌去离子水配置大豆北方茎溃疡病菌孢子悬浮液，收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，10000rpm离心1min，弃上清收集孢子；再加入1mL灭菌去离子水洗涤孢子，10000rpm离心1min，弃上清，最后加入1mL灭菌去离子水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为105-106个/mL。

(3)孢子染色处理；采用染料对孢子悬浮液进行染色，优选的染料为碘化丙啶，染色条件为，室温下避光染色15min-30min，优选15min；离心移弃含有染料的上清液，终止染色，灭菌蒸馏水洗涤两次，重悬孢子，制片。所用染料碘化丙啶与孢子悬浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的适合染色终浓度应在0.05μmol/L-2μmol/L，优选染色浓度为0.05μmol/L-0.06μmol/L。

(4)激光扫描共聚焦显微镜观察；采用激光扫描共聚焦显微镜观察对染色制片的孢子进行观察，为确保扫描的准确性，观察明场通道下所得孢子图像是否清晰。显微镜参数设置如下：

物镜Objective为63倍油镜，激光管为氩离子激光器，荧光信号激发波长为480-500nm，荧光信号发射波长为555-565nm，设置一个明场通道作为对照，探测针孔Pinhole为1AU即1Airy Units＝0.8μm，光电倍增管增益Gain为560，激光扫描强度Scan Str为5％，扫描模式为line，重复扫描次数Average为2，扫描速度Scan speed为6，精确扫描方式xy为2048×2048。

(5)结果判定；根据激光扫描共聚焦显微镜对单个孢子的染色情况扫描结果进行判断，活孢子染色后孢子内部没有荧光，而死孢子内部有荧光(图1)。为确保检测的准确性，每个样品随机观察30个孢子。

激光扫描共聚焦显微镜技术是在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，以激光为光源对不同的荧光染料进行激发，使其产生不同的荧光信号，并利用计算机对荧光信号进行数字图象采集、分析最后输出系统，形成可以直接观察的图像信息，因此激光扫描共聚焦显微镜技术比传统的形态学鉴定所用的显微镜具有更准确和灵敏的观察效果，对不同的荧光染料均有较好的适用性，本发明优选采用染料为碘化丙啶。碘化丙啶染色法通常应用于植物和动物的细胞染色，由于真菌的孢子外壁及膜成分组成与动植物的细胞不同，研究对象的不同，会造成结果的差异，适合植物或动物细胞活性染色的染料不一定适合真菌孢子染色，甚至在不同的真菌检测对象之间也会有不同的适用性差异，因此需要进行详细的实验论证才能获得适合大豆北方茎溃疡病菌活性染色检测的染料和染色条件。

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例：大豆北方茎溃疡病菌活性检测

一、仪器和材料

(1)供试菌株

来源于美国大豆上分离的单孢菌株(Diaporthe phaseolorum var.caulivora)。

(2)荧光染料

本实验采用的染料为Molecular Probes公司的碘化丙啶(PI)，该染料激发波长为536nm，发射波长为617nm。

(3)培养基

PDA：200g马铃薯于1,000mL水中煮沸约20min后，用双层纱布过滤，滤液定容到1L后加入20g琼脂粉并加热溶解，再加入20g葡萄糖，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

WA：1,000mL去离子水煮沸，加入18～20g琼脂粉并加热溶解，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

美国大豆豆杆流水冲洗表面灰尘，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

(4)主要仪器设备

LSM 5EXCITER激光扫描共聚焦显微镜    ZEISS

ZEISS STANDARD20显微镜              ZEISS

HICLAVE HV-50高压灭菌锅             HIAYAMA

SC-R型生物安全柜                    Labcaire

spectrafuge 24D型台式离心机         Labnet International inc

DK-S28型电热恒温水浴锅              上海精宏实验设备有限公司

SANYO MLR-350HT生化培养箱           SANYO

SIEMENS KK2421II冰箱                SIEMENS

二、实验方法

(1)菌株培养

挑取大豆北方茎溃疡病菌培养物接种于PDA培养基平板上，用Parafilm膜密封培养皿，于24℃条件下光照培养7天。

将上述培养的菌株沿着菌落边缘切取3-5mm见方的菌丝块至于灭过菌的豆杆上，保湿培养30天左右，产生子囊及子囊孢子备用。

(2)孢子悬浮液配制

挑取大豆茎溃疡病菌的子囊及子囊孢子收集于1.5mL离心管中，振荡混匀，获得孢子悬浮液，浓度约为10⁴个孢子/mL。

(3)激光扫描共聚焦显微镜扫描

对大豆北方茎溃疡病菌孢子激光扫描共聚焦显微镜扫描设置如下：将样品制备玻片，封片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到孢子，转到100倍油镜(Objective)下观察，微调至视野内图像清晰。根据所用染料，选择相应的激光管(氩离子激光器)激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长(488nm)，收集荧光信号的发射波长(560nm)，并设置一个明场通道作为对照。选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描(xy：512×512)，依据扫描成像效果中荧光信号强弱可调整探测针孔(Pinhole：1AU即1Airy Units＝0.8μm)、光电倍增管增益(Gain：560)、激光扫描强度(Scan Str：5％)，根据图像信噪比调整扫描模式(line)、重复扫描次数(Average：2)和扫描速度(Scan speed：6)等，调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式(xy：2048×2048)获取最终图像。本实验中，首先确保是同一组扫描参数对所有样品进行扫描，然后要保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，则需观察明场通道下所得孢子图像是否清晰。

(4)孢子萌发实验

将大豆北方茎溃疡病菌新鲜配制的孢子悬浮液1.5mL，分装为两组：一组未经水浴处理，表示为unkilled(UK)——活孢子，另一组经50℃水浴处理5min，表示为killed(K)——死孢子，混匀，分别取约含200个孢子的孢子悬浮液于PDA平板上均匀涂布，用Parafilm封口，24℃下光照培养24小时，显微镜下观察孢子萌发情况，每个样品统计200个孢子，计数萌发率。

(5)碘化丙啶染料处理病菌孢子

将大豆北方茎溃疡病菌新鲜配制的孢子悬浮液1.5mL，分装为两组：一组未经水浴处理，另一组经50℃水浴处理5min，取12μmol/L碘化丙啶染料1μL加到200μL孢子悬浮液(染料在混合液中的终浓度为0.06μmol/L)，混匀，室温下避光染色15min，13,000rpm离心3min去上清液终止染色，灭菌去离子水洗涤三次，重悬，避光放置。制备玻片，LSCM扫描取图，观察染色结果。

三、结果与分析

(1)孢子萌发实验结果

新鲜配制的孢子悬浮液萌发实验表明孢子的萌发率为95％，50℃水浴处理5min孢子全部不萌发。

(2)碘化丙啶对病菌活孢子和死孢子染色结果

根据激光扫描共聚焦显微镜扫描结果，经碘化丙啶染色后，活孢子和子囊染色后没有荧光，死孢子和死子囊染色后呈红色荧光，碘化丙啶染色能够明显区分大豆北方茎溃疡病菌活孢子、子囊与死孢子、子囊。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种大豆北方茎溃疡病菌活性检测方法，其特征在于：采用激光扫描共聚焦显微镜观察经过荧光染料染色的大豆北方茎溃疡病菌孢子。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：所述荧光染料为碘化丙啶。

3.如权利要求2所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色浓度为0.05μmol/L-2μmol/L。

4.如权利要求3所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色浓度为0.05μmol/L-0.06μmol/L。

5.如权利要求2-4所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色时间为15min-30min，且染色过程于室温避光条件下进行。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于：碘化丙啶的染色时间为15min。