CN103674906A - 一种检测植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测方法，该方法采用一种Hochest33342/PI双染法，利用荧光荧光显微镜检测，能够快速、准确、灵敏的区分植物病原真菌及芸薹根肿菌孢子的死活，孢子萌发法也可以用来进行植物病原真菌及芸薹根肿菌孢子的活性鉴定，但采用孢子萌发法费时、费力，本方法可以替代传统的孢子萌发法，适合于农业生产、植物保护等部门使用。

Description

一种检测植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物活性检测方法，特别是涉及植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测的方法。

背景技术

真菌的引起的植物病害已达3万种，占有植物病害的70-80％，危害严重又具有毁灭性的病害如马铃薯晚疫病，麦类锈病、甘薯黑斑病等。要对病情进行准确的预测及制定切实有效的防治策略，必须快速地检测植物病原真菌的存在，除检测到病原菌存在外，还应对病原菌的活性进行检测，病原菌进行早期快速检测及活性检测是制定病害防治策略的有力依据。

芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起十字花科蔬菜的根肿病，主要寄生于芸薹属多种植物的根部。在全世界均有分布，近年来其危害范围从十字花科蔬菜扩展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100个种(变种)以上。根肿病每年造成的世界范围内的损失达到10-15％。带菌土壤是其主要初侵染源，芸薹根肿菌的休眠孢子可以在土壤中存活多年，对土壤中芸薹根肿菌孢子活性进行检测，防治带菌土壤交叉污染是控制该病害的有效途径之一(Wallenhammar，1996)。

对植物病原真菌和芸薹根肿菌的检测，国内外已经建立了分子生物学方法，如PCR、巢式PCR以及荧光定量PCR等能够准确、灵敏、快速的定性及定量检测出病菌。该方法虽能快速检测该病菌的有无，但不能检测其活性，(Buhariwalla，1995；Faggian，1999；Ito，1999；Wallenhammar，2001；Cao，2007)。因此，无法判断该有害生物的死活，也难于提出科学合理的检疫与防治管理措施，况且活性检测本身对病菌生物学特性和病害发生流行规律等领域的研究也具重要价值，要做出准确的病情预测预报还要对病原菌的生活力进行鉴定。

对于植物病原真菌及芸薹根肿菌孢子的活性检测，国内外采用的方法有孢子萌发CFU(colony forming units)计数法、MTT法(周肇蕙和严进1996；赵云等2006)和流式细胞仪检测法(Bergervoet et al.2007)。前者为经典检测法，比较实用，但检测时间偏长；MTT比色法简便和经济，但重复性和准确性较差，而流式细胞仪检测法则需要大量的病菌才能进行，不适用于一些难于培养和比较珍贵的病原菌。本研究应用荧光双染法与荧光显微镜相结合，旨在建立快速、准确、灵敏的活性检测方法，为植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测建立新的方法和技术。

发明内容

本发明的目的是针对目前植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测时间长、检测结果不稳定、检测过程中染料毒性大，对人体有害等问题，提供一种新的检测时间短、检测过程毒性小、经济的植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测方法。为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明公开了一种植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测方法，所述方法采用Hoechst33342和碘化丙啶为染料对植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子进行染色检测。

1、所述方法中染色孢子采用荧光显微镜观察，活孢子发蓝色荧光，而死孢子发红色荧光。

2、所述荧光显微镜参数设置包括：紫外激发光块，荧光信号激发光波长为352nm，荧光信号发射光波长为400-500nm。

3、所述Hoechst33342染色的浓度为1μg/ml-10μg/ml，优选为染色的工作浓度为1μg/ml，碘化丙啶染色浓度为1μg/ml-15μg/ml，优选为染色工作浓度为5μg/ml。

4、所述Hoechst33342染色时，37℃孵育10min，4℃1000r/min离心去染液，碘化丙啶4℃避光染色15min。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：

本发明的活性检测方法用于植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子的活性检测，能够有效区分孢子的死活，从制样到完成检测仅需40分钟，可以直接对单个孢子的染色情况进行死活判断。建立了适合于植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子的活性检测的工作环境，包括：染色浓度、显微参数、染色时间、孵育环境等国内外均无报道。本发明具有快速、准确、灵敏、重复性好等特点，有望代替传统的孢子萌发法及一些结果不稳定或毒性较大的染色方法，适合于农业生产、植物保护等部门使用。

具体实施方式

本发明公开了一种植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性检测方法，包括如下步骤：

1、孢子悬浮液配制：用灭菌的无菌水配置孢子悬浮液，收集与1.5ml的离心管中，振荡混匀，5000rpm离心3min，弃上清收集孢子；再加入1ml灭菌的蒸馏水洗涤孢子，5000rpm离心3min，弃上清，最后加入1ml灭菌的蒸馏水重悬，获得孢子悬浮液，浓度约为10⁵-10⁶个孢子/ml。

2、孢子染色处理：采用Hoechst33342和碘化丙啶对孢子悬浮液进行染色，Hoechst33342染色时，37℃孵育10min，4℃1000r/min离心去染液，加入1ml的碘化丙啶4℃避光染色15min，终止染色，用灭菌的蒸馏水洗涤两次，重悬孢子，制片。所用Hoechst33342染液与孢子悬浮液混合后，Hoechst33342染色的浓度为1μg/ml-10μg/ml，优选为染色的工作浓度为1μg/ml，加入的碘化丙啶染液浓度为1μg/ml-15μg/ml，优选为染色工作浓度为5μg/ml。

3、荧光显微镜观察：采用荧光显微镜对染色制片的孢子进行观察，为确保观察结果的准确性，显微镜参数设置如下：物镜为100倍油镜，紫外激发光块，荧光信号激发光波长为352nm，荧光信号发射光波长为400-500nm。

4、结果判定：根据荧光显微镜对孢子染色情况观察结果进行判定，活孢子染色后孢子发蓝色荧光，而死孢子发红色荧光。为确保检测的准确性，每个样本随机观察观察20个视野。其中，Hoechst33342和碘化丙啶通常应用于植物和动物细胞染色，由于病原菌孢子的外壁及膜组成成分与动植物细胞不同，研究对象的不同，会造成结果的差异，适合植物和动物细胞活性染色的染料不一定适合病原菌孢子染色，因此需要进行详细的实验论证才能筛选出适合病原菌活性染色检测的染料和染色条件。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。

实施例1：植物病原真菌及芸薹根肿菌孢子活性检测

1、材料与仪器

Hoechst33342(SIGMA)，碘化丙啶(SIGMA)，奥林巴斯荧光显微镜(DP72)。

2、实验方法

以部分植物病原真菌孢子为材料(表1)采用Hoechst33342/碘化丙啶双染的方法鉴定植物病原真菌孢子死活。最初浓度为100μg/ml的Hoechst33342(溶解于PBS)1μl加入99μl孢子悬浮液，混匀，终浓度为1μg/ml，37℃孵育10min，4℃1000r/min离心去染液，加入100μl灭菌的蒸馏水洗涤一次，离心去上清，加100μl的灭菌的蒸馏水重悬，然后加入500μg/ml的碘化丙啶染液(PBS溶解)与孢子悬浮液混匀，终浓度为5μg/ml，4℃避光染色15min，终止染色，采用荧光显微镜对染色制片的孢子进行观察，显微镜参数设置如下：物镜为100倍油镜，紫外激发光块，荧光信号激发光波长为352nm，荧光信号发射光波长为400-500nm。

3、实验结果

根据荧光显微镜观察结果，活孢子经过染色后发蓝色荧光，而死孢子则发红色荧光(表1)。

表1Hoechst33342/碘化丙啶双染鉴定植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子死活

实施例2：Hoechst33342/碘化丙啶染色浓度和时间筛选

1、材料和仪器

尖孢镰刀菌菌株HG504281，芸薹根肿菌菌株DBC11071501，Hoechst33342(SIGMA)，碘化丙啶(SIGMA)，奥林巴斯荧光显微镜(DP72)，电热恒温水浴锅(XMTD-700)。

2、实验方法

以芸薹根肿菌(P.brassicae)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)作为实验材料，对Hoechst33342和碘化丙啶染料浓度和染色时间进行筛选。新鲜配制孢子悬浮液，共分两组：一组为不经处理的用于萌发实验的活孢子作为萌发试验对照(K组)；一组为不经处理的用于染色实验的活孢子(UK)。两种染料设计4种不同染料浓度的浓度梯度实验：原液100μg/ml，10倍稀释液10μg/ml，20稀释液5μg/ml，50倍稀释液2μg/ml，100倍稀释液1μg/ml，3个不同的染色时间的时间梯度实验：染色10min、15min、20min。

染色方法为：取Hoechst33342染料分别与孢子悬浮液混匀，使其终浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml和1μg/ml，37℃孵育，4℃1000rpm离心去上清液，灭菌蒸馏水洗涤一次，重悬，加入碘化丙啶染料与重悬子悬浮液混匀，依然终浓度分别为10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml和1μg/ml，在4℃下避光染色，3000rpm离心1min去上清液，灭菌蒸馏水洗涤一次，重悬，制片，然后采用荧光显微镜观察，观察分析结果。其中染色后的UK组样品分两部分，一部分进行显微镜观察分析，一部分用于萌发实验，与未经处理的孢子萌发试验作比对，用以检测染色对孢子活性的影响，从而筛选出对孢子活性影响最小且染色效果最佳的染料浓度和染色和染色时间。

3、实验结果(1)萌发实验结果

染料浓度和染色时间筛选的萌发实验结果表明，空白对照中不经染色处理的芸薹根肿菌和尖孢镰刀菌的孢子萌发率分别为76.8％和89.0％。经梯度稀释液染色后，染料浓度越高，孢子萌发率越低；同一浓度下，染色时间越长，孢子萌发率越低。(2)最佳染色条件

结合染色对孢子活性的影响，以及染色后荧光显微镜观察对死活孢子区分效果，筛选出不影响孢子活性且染色效果最佳的染色条件为：Hoechst33342100倍稀释液，对应染料浓度为1μg/ml，染色时间为37℃孵育10min，4℃离心去染料后，碘化丙啶20倍稀释液，对应的染料浓度为5μg/ml，染色时间为15min。实施例3：物理处理(热处理)的芸薹根肿菌孢子活性检测定量分析1、材料和仪器

芸薹根肿菌菌株DBC11071501，Hoechst33342(SIGMA)，碘化丙啶(SIGMA)，奥林巴斯荧光显微镜(DP72)，电热恒温水浴锅(XMTD-700)。2、实验方法

以芸薹根肿菌作为实验材料。新鲜配制的孢子悬浮液，分别在5种水浴温度55℃、65℃、75℃、85℃、95℃下均进行5种时间处理即10min、15min、20min、25min、30min，将所有样品分成两组，一组进行Hoechst33342/碘化丙啶双染(UK组)，染液分别用100倍稀释液和20倍稀释液(浓度分别为1μg/ml和5μg/ml)，染色后，制片，荧光显微镜观察，分析病菌孢子活性，记录发红色荧光的死亡孢子数B和发蓝色荧光的活孢子数A，另一组进行孢子萌发实验(K组)，对每个样品随机测量，孢子死亡率和萌发率列于表2，然后采用下式计算孢子死亡率r：

$r=\frac{B}{A+B}\×100\%$

式中：r-细胞死亡率；A—视野中发蓝色荧光的孢子数目；B—视野中发红色荧光的孢子数目。

3、实验结果

从表2中孢子的死亡率和孢子萌发率情况可以看出，随着处理温度的升高和处理时间的延长，芸薹根肿菌孢子死亡率增加，而孢子的萌发率逐渐降低，二者呈负相关。

表2热处理后芸薹根肿菌孢子死亡率-萌发率

实施例4：化学处理的尖孢镰刀菌孢子活性检测定量分析

1、材料和仪器

尖孢镰刀菌菌株HG504281，Hoechst33342(SIGMA)，碘化丙啶(SIGMA)，奥林巴斯荧光显微镜(DP72)。

2、实验方法

以尖孢镰刀菌菌株作为实验材料。新鲜配制的孢子悬浮液，浓度为1.0×10⁵个孢子/m孢子悬浮液，将1mL的孢子悬浮液与9mL的消毒剂液体混合，共有5种消毒剂进行处理，在室温下处理3min，5min和10min，以无菌水和有机溶剂吐温80作为对照。将所有样品分成两组，一组进行Hoechst33342/碘化丙啶双染(UK组)，染液分别用100倍稀释液(浓度分别为1μg/ml和5μg/ml)，染色后，制片，荧光显微镜观察，分析病菌孢子活性，记录发红色荧光的死亡孢子数B和发蓝色荧光的活孢子数A，同时，将UK组显微观察后的孢子进行生测实验，验证该方法的有效性；另一组进行孢子萌发实验(K组)，对每个样品随机测量，孢子死亡率、萌发率和病情指数列于表3，然后采用下式计算孢子死亡率r：

$r=\frac{B}{A+B}\×100\%$

式中：r-细胞死亡率；A-视野中发蓝色荧光的孢子数目；B-视野中发红色荧光的孢子数目。

3、实验结果

根据Hoechst33342/碘化丙啶双染检测化学处理后的尖孢镰刀菌的试验结果(表3)，判定Hoechst33342/碘化丙啶双染的方法可以很好的检测化学处理后的尖孢镰刀菌孢子活性，并且检测结果与芸薹根肿菌的检测结果表现出良好的一致性，5种消毒剂处理后，随着处理时间的延长，尖孢镰刀菌孢子死亡率增加，而孢子的萌发率逐渐降低，二者呈负相关，且以生测实验验证该染色方法的有效性，结果表明病情指数与孢子死亡率呈负相关，与孢子萌发率呈正相关。

表3化学消毒后尖孢镰刀菌孢子死亡率，萌发率，病情指数

Claims (7)

1.一种检测植物病原真菌及芸薹根肿菌孢子活性的方法，其特征在于：采用Hochest33342/PI(碘化丙啶)作为染料对植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子进行染色。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于：孢子染色后采用荧光显微镜观察，活的孢子发蓝色荧光，死的孢子发红色荧光。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于：荧光显微镜参数包括如下设置：紫外激发光块，激发光波长为352nm，发射光波长为400-500nm。

4.如权利要求1-3所述方法，其特征在于：Hochest33342染色的工作浓度为1μg/ml，PI染液的工作浓度为5μg/ml。

5.如权利要求1-3所述方法，其特征在于：Hochest33342染色时，37℃孵育10min，4℃1000r/min离心去染液，PI 4℃避光染色15min。

6.如权利要求1-3所述方法，其特征在于：Hoechst33342/PI双染法检测植物病原真菌和芸薹根肿菌孢子活性时，可以检测到植物病原真菌和芸薹根肿菌的1个孢子的活性，具有很高的灵敏度。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的植物病原真菌包括：白锈属(Albugo)、链格孢属(Alternaria)、壳二胞属(Ascochyta)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、芽枝霉属(Cladosporium)、刺盘孢属(Colletotrichum)、棒孢属(Corynespora)、白粉菌属(Erysiphe)、褐孢霉属(Fulvia)、镰孢属(Fusarium)、壳球孢属(Macrophomina)、菌绒孢属(Mycovellosiella)、漆斑菌属(Myrothecium)、球腔菌属(Mycosphaerella)、霜霉属(Peronospora)、茎点霉属(Phoma)、拟茎点霉属(Phomopsis)、叶点霉属(Phyllosticta)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)、青霉属(Penicillium)、壳针孢属(Septoria)、匍柄霉属(Stemphylium)、单胞锈菌属(Uromyces)、黑粉菌属(Ustilago)、轮枝孢属(Verticillium)、芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)。