CN107505306A - 基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，其包括：向含重水的培养基中加入可能含有沙门氏菌的待测牛奶进行培养，之后收集培养后的菌体细胞进行拉曼光谱扫描，对获得的原始拉曼光谱进行分析处理，实现对待测牛奶中沙门氏菌的检测。本发明采用D2O标记并利用拉曼光谱对牛奶中的沙门氏菌进行快速检测，具有检测时间短(4‑8h)，灵敏度高、成本低、易于操作、方便快捷等优点，检出限为104‑108cfu/mL，受牛奶样品中基质的干扰小，是一种理想的沙门氏菌快速检测方法，具有很好的实际应用前景，适于在食品安全、环境监测等领域广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测牛奶中沙门氏菌的方法，具体涉及一种基于重水(D2O)标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，属于致病菌检测技术领域。
背景技术
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，是需氧兼性厌氧的无芽孢菌，属革兰氏阴性肠杆菌科，已发现的近一千种(或菌株)。其可在温度范围(10-42℃)很广的条件下生长，最适温度为37℃，最佳pH值为6.8-7.8。沙门氏菌分布广，有些可引起人类、家畜以及野生禽兽动物的疾病，是引起人类食物中毒的重要病原菌。据统计近年来在世界各国细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒经常列榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位，对人们造成了很大的健康危害和经济损失。当前食品安全问题突出，由食源性致病菌引起的食品安全问题，更是引起了各国政府和学术研究机构的重视。
在国内沙门氏菌检测的常规方法，多采用微生物培养的传统方法，其主要步骤包括前增菌(8-18h)、增菌(18-24h)、平板培养分离(18-24h)、生化试验和血清学鉴定等步骤。该方法结果准确可靠，但操作繁琐，耗时长，且需要多种试剂，已不能满足当代食源性致病菌的检测需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，其具有操作简便、快速便捷等特点，从而克服了现有技术中的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明实施例提供了一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，其包括：
将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基进行培养，之后收集培养后的菌体细胞进行拉曼光谱扫描，并对获得的原始拉曼光谱进行分析处理，实现对待测牛奶中沙门氏菌的检测。
在一些较为具体的实施方案中，若所述待测牛奶中存在氏菌，则在相应原始拉曼光谱中于2040cm-1-2300cm-1有CD峰出现。
在一些较为具体的实施方案中，所述的方法包括：
(1)将一系列不同浓度的沙门氏菌种子液分别加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，获得CD/(CD+CH)％-原始沙门氏菌浓度的Log值标准曲线，其中，CD/(CD+CH)％为拉曼光谱中CD峰峰高与CD峰和CH峰峰高之和的比值；
(2)将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，并与所述标准曲线对照，从而测得待测牛奶中的沙门氏菌浓度。
在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)还包括设置激光拉曼光谱仪的工作参数，所述的工作参数包括激发光的波长、激光功率和扫描时间。
优选的，所述激发光的波长被设置为532nm，激光功率被设置为8mw，扫描时间被设置为10s。
较之现有技术，本发明基于D2O标记、利用拉曼光谱对牛奶中的沙门氏菌进行快速检测，具有检测时间短(4-8h)，灵敏度高、成本低、易于操作、方便快捷等优点，检出限为104-108cfu/mL，受牛奶样品中基质的干扰小，是一种理想的沙门氏菌快速检测方法，具有很好的实际应用前景，适于在食品安全、环境监测等领域广泛应用。
附图说明
图1a-1f分别示出了本发明一典型实施例中沙门氏菌在不同培养基中的生长曲线，及对应的拉曼光谱。
图2a-图2c分别示出了本发明一典型实施例中沙门氏菌在50％D2O制得的培养基中，分别培养4h、6h、8h时，CD/(CD+CH)％与添加菌体浓度的Log值的线性关系曲线图。
图3a和图3b分别示出了本发明一典型实施例待测牛奶中沙门氏菌在50％D2O制得的培养基中的拉曼光谱图及CD/(CD+CH)％与添加菌体浓度的Log值的线性关系曲线图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法。概括的讲，所述的方法包括：向含重水的培养基中加入待测牛奶进行培养，之后收集培养后的菌体细胞进行拉曼光谱扫描，根据2040cm-1-2300cm-1处是否有明显的C-D峰出现，来定性判断沙门氏菌的存在。本发明方法检测时间短(4-8h)，具有灵敏度高、成本低、易于操作、方便快捷等优点，检出限为104-108cfu/mL，能够快速地对牛奶中的沙门氏菌进行检测。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的系一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，其包括：
将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基进行培养，之后收集培养后的菌体细胞进行拉曼光谱扫描，并对获得的原始拉曼光谱进行分析处理，实现对待测牛奶中沙门氏菌的检测。
在一些较为具体的实施方案中，若所述待测牛奶中存在氏菌，则在相应原始拉曼光谱中于2040cm-1-2300cm-1有CD峰出现。
在一些较为具体的实施方案中，所述的方法包括：
(1)将一系列不同浓度的沙门氏菌种子液分别加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，获得CD/(CD+CH)％-原始沙门氏菌浓度的Log值标准曲线，其中，CD/(CD+CH)％为拉曼光谱中CD峰峰高与CD峰和CH峰峰高之和的比值；
(2)将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，并与所述标准曲线对照，从而测得待测牛奶中的沙门氏菌浓度。
在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)还包括设置激光拉曼光谱仪的工作参数，所述的工作参数包括激发光的波长、激光功率和扫描时间。
优选的，所述激发光的波长被设置为532nm，激光功率被设置为8mw，扫描时间被设置为10s。
所述培养的温度为37℃，时间为4-8h。
优选的，所述方法对于沙门氏菌的检出限为104-108cfu/mL。
进一步的，所述沙门氏菌种子液的浓度分别为104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL、5×107CFU/mL、108CFU/mL。
在一些较为具体的实施方案中，在含重水的培养基中培养过的沙门氏菌在拉曼位移为2040cm-1～2300cm-1处存在C-D峰。
在一些较为具体的实施方案中，在所述标准曲线中CD/(CD+CH)％与原始沙门氏菌浓度的Log值呈线性关系。
具体的，培养4h时，所述线性关系为：y＝2.7753x-14.377,R2＝0.9894，其中，x为原始沙门氏菌浓度的Log值，y为CD/(CD+CH)％。
培养6h时，所述线性关系为：y＝1.8209x-5.1865,R2＝0.963，其中，x为原始沙门氏菌浓度的Log值，y为CD/(CD+CH)％。
培养8h时，所述线性关系为：y＝0.9491x+2.6985,R2＝0.9889，其中，x为原始沙门氏菌浓度的Log值，y为CD/(CD+CH)％。
在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)包括：对获得的拉曼光谱进行分析处理，将所获CD/(CD+CH)％代入步骤(1)所获标准曲线，从而计算添加回收率。
优选的，所述含重水的培养基中重水的含量为0～100wt％，优选为50wt％。
优选的，所述沙门氏菌种子液的制备方法包括：将沙门氏菌置于灭菌过的超纯水培养基中进行活化，培养至对数期后期，获得所述沙门氏菌种子液。
在一些较为具体的实施方案中，所述基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法可以包括如下步骤：
(1)培养基的配置
称取营养肉汤固体培养基，置于重水中，摇匀溶解后，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min，待用。
(2)沙门氏菌的活化及标记培养
a、无菌操作取沙门氏菌，置于灭菌过的超纯水营养肉汤培养基中进行活化，培养至对数期后期得沙门氏菌种子液待用；
b、生长曲线：将沙门氏菌种子液加入由重水制得的营养肉汤培养基中进行培养，分别测得上述培养过程中，0-24h不同时间菌体的吸光度值OD600，与时间绘制生长曲线，同时离心收集不同时间点的菌体细胞并置于锡箔纸上。
c、将沙门氏菌种子液稀释至不同的浓度104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL、5×107CFU/mL和108CFU/mL，分别加入由重水制得的营养肉汤培养基中进行培养。不同浓度的沙门氏菌培养至对数期，于对数期期间的不同时间点进行离心收集菌体细胞，并置于锡箔纸上。
(3)拉曼光谱检测：将步骤(2)b、c中锡箔纸上的菌体细胞，进行拉曼光谱测试。每个样品进行十次平行点测试。
其中，步骤(3)中拉曼光谱仪的测定条件设为：He-Ne激光器的检测波长为532nm，激光功率约为8mW，扫描时间为10s。
其中，CD/(CD+CH)％是代表拉曼光谱中CD峰峰高与CD峰和CH峰峰高和的比值。
(4)数据处理
将拉曼光谱检测结果进行分析，记录CD与CH峰峰高。建立CD/(CD+CH)％与原始沙门氏菌浓度的Log值的线性关系，获得标准曲线，从而应用拉曼信号对沙门氏菌进行定量检测。
(5)将本发明的方法实际应用于巴氏杀菌乳中沙门氏菌的检测，其步骤具体如下：
将沙门氏菌种子液加入巴氏杀菌乳(经菌落计数法未检出菌落)中，牛奶中沙门氏菌最终浓度分别为104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL、5×107CFU/mL和108CFU/mL，分别加入50％D2O中进行培养。于对数期期间的不同时间点进行离心收集菌体细胞，并置于锡箔纸上，进行拉曼光谱测试。每个样品进行十次平行点测试，记录CD与CH峰峰高。将CD/(CD+CH)％分别带入前述获得的标准曲线，计算添加回收率。
(6)将本发明的方法实际应用于待测牛奶中沙门氏菌的检测，其步骤具体如下：
将含有沙门氏菌的待测牛奶加入含50％D2O的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，并与所述标准曲线对照，从而测得待测牛奶中的沙门氏菌浓度。
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
在如下实施例中，采用如下检测条件：
激光拉曼光谱仪的参数设置：He-Ne激发器的检测波长532nm，激光功率约为8mw，扫描时间10s。
当然，本领域技术人员也可根据习知材料制定其它的激光拉曼光谱仪参数；
在确定检测条件之后，可参照如下方法进行牛奶中沙门氏菌的检测：
(1)培养基的配置
称取0.9g营养肉汤固体培养基，分别置于50mL超纯水、50％D2O和100％D2O中，摇匀溶解后，于121℃高压灭菌锅中灭菌20min，待用。
(2)沙门氏菌的活化及标记培养
a、无菌操作取沙门氏菌，置于灭菌过的超纯水营养肉汤培养基中进行活化，培养至对数期后期得沙门氏菌种子液待用；
b、生长曲线：将沙门氏菌种子液分别加入由超纯水(作为对照组)、50％D2O和100％D2O制得的营养肉汤培养基中进行培养。将同上的沙门氏菌种子液在121℃，20min灭菌后置于50％D2O制得的营养肉汤中进行同样的培养(亦作为对照组)。分别测得上述培养过程中，0-24h内不同时间菌体的吸光度值OD600，与时间绘制生长曲线，结果如图1a-图1f所示，结果显示在50％D2O培养的沙门氏菌，菌体状态未受明显影响，同时离心收集不同时间点的菌体细胞并置于锡箔纸上。
本方法通过超纯水、重水标记分别培养沙门氏菌，获得的菌体细胞在532nm的波长下，进行拉曼光谱的测试。重水培养过的沙门氏菌在2040cm-1-2300cm-1有明显的C-D峰出现，而经超纯水培养获得的沙门氏菌未有C-D峰出现。当以50％D2O制得的培养基进行沙门氏菌的培养时，1h即可出现明显的C-D峰，以此可定性沙门氏菌的存在。
c、将沙门氏菌种子液稀释至不同的浓度104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL、5×107CFU/mL和108CFU/mL，分别加入50％D2O制得的营养肉汤培养基中进行培养。不同浓度的沙门氏菌培养至对数期，于对数期期间的不同时间点进行离心收集菌体细胞，并置于锡箔纸上。
(3)拉曼光谱检测：将步骤(2)b、c中锡箔纸上的菌体细胞，进行拉曼光谱测试。每个样品进行十次平行点测试。将拉曼光谱检测结果进行分析，记录CD与CH峰峰高。结果显示在1h时，50％D2O与100％D2O制得的培养基培养沙门氏菌都有明显的C-D峰出现，而在超纯水中培养的沙门氏菌的拉曼光谱未有C-D出现。且经高温杀菌过的沙门氏菌在50％的培养基中培养，亦未有C-D出现。将(2)c中测试结果分析，发现在对数生长期，CD/(CD+CH)％与原始沙门氏菌浓度的Log值，呈现良好的线性关系，绘制标准曲线，从而来应用拉曼信号实现对沙门氏菌的定量检测，结果如图2a至图2c所示。
(4)将前述基于重水标记拉曼光谱快速检测沙门氏菌的方法，实际应用于巴氏杀菌乳中沙门氏菌的检测，其步骤具体如下：
将沙门氏菌种子液加入巴氏杀菌乳(经菌落计数法未检出菌落，即不含有沙门氏菌)中，牛奶中沙门氏菌最终浓度分别为104CFU/mL、5×104CFU/mL、105CFU/mL、5×105CFU/mL、106CFU/mL、5×106CFU/mL、107CFU/mL、5×107CFU/mL和108CFU/mL，分别加入50％D2O中进行培养。
将含有沙门氏菌的待测牛奶加入含50％D2O的培养基中进行培养至对数期。
于对数期期间的不同时间点进行离心收集菌体细胞，并置于锡箔纸上，进行拉曼光谱测试。每个样品进行十次平行点测试，记录CD与CH峰峰高，结果如图3a和图3b所示。结果显示牛奶中，CD/(CD+CH)％与原始沙门氏菌浓度的Log值，也呈现良好的线性关系。将不同添加浓度的沙门氏菌培养不同的时间，通过公式添加回收率＝LogN2/Log N1％，计算得到添加回收率为89.7％-104.61％，结果如表1所示。
表1不同添加浓度的沙门氏菌培养不同时间的添加回收率
综上所述，本发明中所建立的基于重水标记拉曼光谱快速检测沙门氏菌的方法，检测时间短，灵敏度和准确度高，在牛奶样品中的基质干扰小，可作为一种新型的食品中沙门氏菌的快速检测方法。
应当理解，以上较佳实施例仅用于说明本发明的内容，除此之外，本发明还有其他实施方式，但凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于重水标记的拉曼光谱快速检测牛奶中沙门氏菌的方法，其特征在于包括：将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基进行培养，之后收集培养后的菌体细胞进行拉曼光谱扫描，并对获得的原始拉曼光谱进行分析处理，实现对待测牛奶中沙门氏菌的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：若所述待测牛奶中存在沙门氏菌，则在相应原始拉曼光谱中于2040cm-1-2300cm-1有CD峰出现。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括：
(1)将一系列不同浓度的沙门氏菌种子液分别加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，获得CD/(CD+CH)％-原始沙门氏菌浓度的Log值标准曲线，其中，CD/(CD+CH)％为拉曼光谱中CD峰峰高与CD峰和CH峰峰高之和的比值；
(2)将可能含有沙门氏菌的待测牛奶加入含重水的培养基中进行培养至对数期，之后于不同时间点分别收集菌体细胞，进行拉曼光谱扫描，对获得的拉曼光谱进行分析处理，并与所述标准曲线对照，从而测得待测牛奶中的沙门氏菌浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)还包括设置激光拉曼光谱仪的工作参数，所述的工作参数包括激发光的波长、激光功率和扫描时间；优选的，所述激发光的波长被设置为532nm，激光功率被设置为8mw，扫描时间被设置为10s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为37℃，时间为4-8h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法对于沙门氏菌的检出限为104-108cfu/mL。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述标准曲线中CD/(CD+CH)％与原始沙门氏菌浓度的Log值呈线性关系。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：对获得的拉曼光谱进行分析处理，将所获CD/(CD+CH)％代入步骤(1)所获标准曲线，从而计算添加回收率。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含重水的培养基中重水的含量为0～100wt％，优选为50wt％。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述沙门氏菌种子液的制备方法包括：将沙门氏菌置于灭菌过的超纯水培养基中进行活化，培养至对数期后期，获得所述沙门氏菌种子液。
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