CN104830949A

CN104830949A - 一种筛选产微生物塑料菌株的方法

Info

Publication number: CN104830949A
Application number: CN201510243247.0A
Authority: CN
Inventors: 王桂文; 彭立新; 王忠文; 冯旻; 陶站华
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种筛选产微生物塑料菌株的方法，属于微生物菌株筛选技术领域。本发明方法主要采用激光镊子和单细胞拉曼光谱技术的结合来判断微生物细胞合成微生物塑料的能力，进一步对高产微生物塑料菌株进行分离和纯化。本发明方法操作简便，无需染色，直接在无菌水中进行检测即可，且能够快速直观地筛选出产微生物塑料菌株，对检测的样品细胞不造成伤害，是一种值得推广的简便、高效、可靠的微生物塑料高产菌株筛选方法。

Description

一种筛选产微生物塑料菌株的方法

技术领域

本发明属于微生物菌株筛选技术领域，具体涉及一种基于单细胞拉曼光谱筛选产微生物塑料菌株的方法。

背景技术

塑料制品在人类的日常生活和工农业生产中占据着重要的地位，以合成树脂为主的普通塑料由于难以降解已经造成了严重的环境问题，研究和开发新的可降解生物塑料迫在眉睫。在众多的生物可降解材料中，采用微生物发酵法生产的微生物塑料——多聚β-羟基烷酸酯(PHA)不仅具有普通高分子材料的力学性能和加工性能，还具有可生物降解性、生物相容性、压电性、光学活性等普通高分子材料无法比拟的特性。PHA在医学、农业和食品工业具有广阔的应用前景，因而成为研究热点，其中聚β-羟基丁酸(PHB)是研究和应用最广泛的一种多聚体。PHA作为细胞内同化作用的初级产物，是微生物遇到不适环境时在胞内累积合成的一种脂类储藏物质，可以作为胞内营养和能量的储存物质参加细胞代谢。

当前PHA的合成途径主要通过微生物发酵法获得，而影响PHA进一步商业化和广泛推广的阻力是其发酵底物价格较高，发酵、提取过程能耗大，生产成本高。而优良菌株是影响发酵效率、降低生产成本的关键环节，通过创新的技术，快速筛选能利用廉价的底物进行发酵的高产PHA菌株，是加快生物塑料产业化的有效途径之一。尽管目前已经发现有超过300 多种菌种能够合成生物塑料，人们仍然在寻找更为理想的合成生物塑料的菌种。

染色法是目前最常用的筛选产PHA微生物的方法，主要包括苏丹黑玻片染色法、尼罗蓝玻片染色法和尼罗蓝菌落染色法等。这些方法均需要通过染色来确认细胞所含聚酯物质为PHA，操作过程复杂，且耗时较多。更具体的，苏丹黑玻片染色法对PHA的专一性差、操作方法繁琐，不是理想的筛选方法；尼罗蓝染色法专一性强，操作相对比苏丹黑玻片染色法简便快速，但是尼罗蓝玻片染色法需要细胞固定、染色；尼罗蓝菌落染色法是染色法中操作最为简便的一种方法，但是需要针对不同的微生物选用适当的染色液浓度，这对大量未知微生物的筛选来说是难以确定的，而且添加到培养基的尼罗蓝染料和其它试剂给待选菌株带来未知的伤害，不能用于直接筛选。

参考文献：

1、薛林贵, 赵旭, 景春娥, 常思静. 尼罗蓝在筛选PHB高产菌株中的应用研究生物技术通报, 2010, 212(3): 181-184

2、季爱云, 崔志芳, 李春露, 刘娜山. 生物可降解塑料聚β-羟基丁酸酯产生菌的选育. 塑料, 2010, 39(3): 100-102.

3、薛林贵, 常思静, 赵旭, 景春娥. PHB高产菌株选育中初筛方法的比较研究. 应用化工, 2010, 39(5): 633-636

4、Degelau A, Scheper T, Bailey J E, Guske C. Fluorometric measurement of poly-beta hydroxybutyrate in Alcaligenes eutrophus by flow cytometry and spectrofluorometry. Applied Microbiology & Biotechnology, 1995, 42(5): 653-657.

5、孙燕飞, 王翀, 程模香, 雷勇辉, 熊杰. 一种快速筛选产聚羟基烷酸细菌方法的建立. 河南农业科学, 2011, 40(4): 87-89。

发明内容

目前，筛选微生物塑料高产菌株所采用的染色法灵敏度较差，操作过程繁琐，很大程度上限制了PHA高产菌株的筛选。针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种无需染色、操作简便、可靠，且能够快速直观筛选出产PHA菌株的方法。

具体的，本发明的技术方案是：

一种筛选产微生物塑料菌株的方法，包括以下步骤：

（1）将含菌样品与无菌水混匀，进行10^-1～10^-5梯度稀释，吸取少量含菌水涂布在筛选培养基上培养至长成菌落；

（2）选择生长迅速、特征典型的菌落，挑取少量待检样品悬浮于无菌水中；

（3）采用激光镊子将单个待检样品细胞固定，并通过拉曼光谱仪采集拉曼光谱；

（4）通过拉曼光谱特征峰强度实现待检样品细胞产PHA的判别。

激光镊子，又称光学镊子（英文：Optical tweezer），就是用激光形成的镊子，是一种利用光压原理制造的能够移动或固定单个细胞和其他微小物体的仪器。拉曼光谱仪由激光源、收集系统、分光系统和检测系统构成, 激光源一般采用能量集中、功率密度高的激光, 收集系统由透镜组构成, 分光系统采用光栅或陷波滤光片结合光栅以滤除瑞利散射和杂散光以及分光检测系统采用光电倍增管检测器、半导体阵检测器或多通道的电荷藕合器件。通过拉曼光谱技术能够提供快速、简单、可重复、无损伤的定性定量分析。

本发明方法中，通过激光镊子将单个待检样品细胞移动并固定在光束的聚集中心，采集到的拉曼光谱是整个细胞的完整信号，比常规的共焦显微方法得到更强的信号，更好的信噪比。而且，经相关性分析显示，PHA的拉曼光谱特征峰强度直接反映了细胞内PHA的含量，间接反应了细胞的产PHA能力。因此，通过对待检样品细胞产PHA的拉曼光谱的采集与分析，便能快速直观地判断出待检样品细胞是否具备产PHA的能力，以及产PHA能力的大小，从中确定高产PHA的菌株，进一步进行分离、纯化。

作为本发明方法的进一步说明，所述筛选培养基至少含有以下组分：Na₂HPO₄·12 H₂O 9.0 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02 g/L，NaHCO₃ 0.5 g/L，FeCl₃ 0.08 g/L，(NH4)₂SO₄ 4.0 g/L，微量元素溶液1 mL，葡萄糖 50 g/L。

作为本发明方法的进一步说明，所述微量元素溶液至少含有以下组分：CoCl_2·6H₂O 0.2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，MnCl₂·4H₂O 30 mg/L，NaMoO₄·2H₂O 30 mg/L，NiCl₂·6H₂O 20 mg/L，CuSO₄·5H₂O 10 mg/L，FeSO₄·7H₂O 20 mg/L，H₃BO₃ 0.3 g/L。

本发明的有益效果是：

（1）本发明方法操作简便，无需染色，直接在无菌水中进行检测即可。

（2）本发明方法能够快速直观地筛选出产PHA菌株，每个样品细胞进行光谱采集、数据处理等工序仅需要10～20 s，每个样品5 min即可。

（3）本发明方法对检测细胞不造成伤害，而且适用于所有单细胞微生物，检测后的样品不影响进一步的分离和纯化。

附图说明

附图1是菌落细胞拉曼光谱与摇瓶发酵PHB产量相关性分析图。

附图2是不同菌株间单个细胞PHB特征峰平均强度对比图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，本实施例仅是对本发明作更清楚的说明，而不是对本发明的限制。

一、菌落细胞拉曼光谱与摇瓶发酵PHB产量相关性分析

1、实验材料

菌株：Cupriavidus necator H16菌株。

斜面培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，pH 值为7.0。

种子培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 值为7.0。

摇瓶发酵培养基：Na₂HPO₄·12 H₂O 9.0 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02 g/L，NaHCO₃ 0.5 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L，(NH4)₂SO₄ 2.0 g/L，微量元素溶液1 mL。pH 值为7.0，115 ℃ 灭菌20min。

微量元素：CoCl_2·6H₂O 0.2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，MnCl₂·4H₂O 30 mg/L，NaMoO₄·2H₂O 30 mg/L，NiCl₂·6H₂O 20 mg/L，CuSO₄·5H₂O 10 mg/L，FeSO₄·7H₂O 20 mg/L，H₃BO₃ 0.3 g/L。所用试剂均为分析纯试剂。

2、实验方法

2.1 培养方法

从平板上挑取单菌落，接入含有50 mL 种子培养基的150 mL锥形瓶中，在30℃、200 r/min条件下培养36 h作为种子液。以5%的接种量，转接到含有80 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃、200 r/min条件下培养72h。从0 h起每6 h取样一次，每次取样2 mL，其中1.0 mL用于测量细胞的PHB产量，0.5 mL用于收集拉曼光谱。

2.2 PHB 总量测定

用浓硫酸降解法测定PHB 总量：经干燥的细胞样品中加入浓硫酸1mL，在80 ～90 ℃的水中水浴1h，适当稀释后用TU-1901紫外-可见光分光光度计测定208nm处的光密度值，对照PHB标准曲线计算PHB含量。

2.3 光谱收集

将发酵液用无菌水稀释3000倍，吸取200 μL置于用石英片密封而成的样品槽中，外加盖玻片密封。100倍油浸物镜寻找目标细胞，光镊随机俘获单个细胞，将目标细胞提升至石英片上方5 μm左右，激光强度调整为45 mW，信号累积时间为20 s，收集目标细胞的拉曼光谱，此时收集到的是带有背景的细胞的拉曼光谱，于细胞附近以相同条件收集背景拉曼光谱，每个样品收集30～45个细胞的拉曼光谱，3个背景拉曼光谱。上述光谱的收集于室温24℃的环境下进行。

2.4 数据处理方法

光谱数据先进行背景扣除和响应曲线的校正，其算法为S _act(v)=[S _acq(v)- S _bg(v)]/R(v) [其中S _act(v)为样品的实际光谱，S _acq(v)为带背景的光谱，S _bg(v)为背景光谱，R(v)为实验系统的响应曲线]；采用vb 编程对数据进行平滑去噪，其算法是9 点Savitzky-Golay 卷积平滑法，最后用线性拟合结合积分法求特征峰的峰面积。数据统计与绘图均在软件Origin 8.1中进行。

3、结果分析

以拉曼光谱强度为纵坐标，PHB含量为横坐标，构建成如图1所示的菌落细胞拉曼光谱与摇瓶发酵PHB产量相关性分析图。从图1可知，细胞拉曼光谱强度与其产PHB含量成正比关系，因此，细胞拉曼光谱强度在一定程度上反应了其摇瓶发酵能力，可以通过收集并分析待检样品细胞的拉曼光谱来判断该菌株是否具备产PHB能力，以及产PHB能力的大小。

二、应用实施例

从蔗田采集土壤1～3号和糖厂蔗渣干屑，共4种含菌样品。分别称取含菌样品1g，放入99ml无菌水中，振荡10min后放到60℃的恒温水浴锅中保温1h，再进行10^-1～10^-5梯度稀释，吸取0.1ml涂布在筛选培养基上，30℃培养40h。

从筛选培养基上选择生长迅速、特征典型的芽孢杆菌菌落，挑取少量待检样品悬浮于无菌水中。接着激光镊子将单个待检样品细胞固定，并通过拉曼光谱仪采集拉曼光谱。最后通过待检样品细胞拉曼光谱特征峰强度的高低判别菌株产PHB的能力。

通过本实施例方法对约100个菌株进行检测，45%的菌株显示胞内有PHB积累。图2是部分菌株的PHB特征峰信号强度对比图，其中带星号的两个菌株（Bacillus sp. C7；Bacillus sp. D4）强度很高，表明胞内累积有较多的PHB，进一步证明这两个菌株具有较好的产PHB能力。

利用本实施例方法初步筛选的产PHB能力较强的芽孢杆菌菌株，做进一步的摇瓶发酵，发酵时间36h。在3%葡萄糖摇瓶发酵培养基下，发酵效果最好的菌株其PHB含量最大值为3.95 g/L（占细胞干重68%）。在3%蔗糖摇瓶发酵培养基下，发酵效果最好的菌株，PHB最高含量达到5.27g/L，占细胞干重的70%。

Claims

1.一种筛选产微生物塑料菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（4）通过拉曼光谱特征峰强度实现待检样品细胞产微生物塑料的判别。

2.根据权利要求1所述筛选产微生物塑料菌株的方法，其特征在于，所述筛选培养基至少含有以下组分：Na₂HPO₄·12 H₂O 9.0 g/L，KH₂PO₄ 1.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.02 g/L，NaHCO₃ 0.5 g/L，FeCl₃ 0.08 g/L，(NH4)₂SO₄ 4.0 g/L，微量元素溶液1 mL，葡萄糖 50 g/L。

3.根据权利要求2所述筛选产微生物塑料菌株的方法，其特征在于，所述微量元素溶液至少含有以下组分：CoCl_2·6H₂O 0.2 g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L，MnCl₂·4H₂O 30 mg/L，NaMoO₄·2H₂O 30 mg/L，NiCl₂·6H₂O 20 mg/L，CuSO₄·5H₂O 10 mg/L，FeSO₄·7H₂O 20 mg/L，H₃BO₃ 0.3 g/L。