发明内容
为了解决以上技术问题,本发明提供一种细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法,降低了细胞载体芯片的拉曼光谱背景;提高了弹射系统的精确度及易操作性;保证了被弹射的目标细胞的活性。
本发明通过以下技术方案实现:
一种细胞载体芯片,包括基底层和镀层,所述基底层材料为不影响光线透射的材料,所述基底材料上覆盖对细胞无损伤的所述镀层,待测样品最低拉曼信噪比和所述镀层最高拉曼信噪比<3,所述镀层可吸收激光并被局部剥离或局部融化。
在上述技术方案中,所述基底材料包括硅酸盐玻璃、石英玻璃或氟化钙玻璃中的任一种。
在上述技术方案中,所述镀层材料包括金属、金属氧化物或非金属氧化物中的任一种。
在上述技术方案中,所述镀层材料包括Ti、TiO2、SiO2、Si、Al、Al2O3、Au或Ag中的任一种。
在上述技术方案中,所述镀层厚度为0-1000nm。
在上述技术方案中,所述局部剥离或局部融化深度<1000nm。
一种单细胞拉曼图谱的快速测量方法,将细胞涂于上述技术方案中任一所述的细胞载体芯片上,风干,进行拉曼光谱采集,拉曼光谱采集时的表面激光功率小于等于500mW,0.01s≤采样时间≤600s。
一种基于拉曼图谱的单细胞快速鉴定方法,将细胞涂于上述技术方案中任一所述的细胞载体芯片上,风干,进行拉曼光谱采集,通过采集结果区分单细胞。
一种快速分选/分离单细胞的方法,将细胞样品涂于上述技术方案中任一所述的细胞载体芯片表面,锁定目标单细胞,使用脉冲激光对锁定的目标单细胞所处位置处镀层施加能量,将锁定的目标单细胞弹射并收集到收集容器内。
在上述技术方案中,所述锁定目标单细胞通过拉曼光谱仪或拉曼显微设备进行拉曼光谱激发后检测单细胞的拉曼光谱进行判别和锁定。
在上述技术方案中,对细胞进行拉曼光谱激发的激光与弹射的脉冲激光具有同一波长。
在上述技术方案中,所述锁定的目标单细胞经弹射后为活体单细胞。
本发明通过选择合适的镀层材料降低了细胞载体芯片的拉曼光谱背景;提高弹射系统的精确度及易操作性;通过镀膜材料的改造使其对激光较敏感,降低激光强度以保证细胞活性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1:细胞载体芯片的材料选择与制作
其基底材料为不影响光线透射的材料,包括但不限于硅酸盐玻璃、石英玻璃、氟化钙玻璃;可使用的特殊镀层材料包括Ti、TiO2、SiO2、Si、Al、Al2O3、Au和Ag等。使用SEM/TEM溅射镀膜机(型号Q150T,购自QuorumTechnologies公司)将上述材料涂覆于基底表面形成镀层;镀层厚度与镀膜时间及电流相关,在电压为2.5KV,目标与材料的距离为50mm时,镀层厚度计算的具体公式为Th=7.5It(Th,镀层厚度,埃;I,电流,mA;t,时间,min)。根据需要,制作镀层的厚度为10-1000nm。
实施例2:单细胞拉曼图谱的快速测量方法
用于测试的Escherichia coli DH5α(购自Promega(Beijing)Biotech Co.,Ltd.)在含有5g/l葡萄糖的基础培养基中进行37°C,150rpm过夜培养至稳定期。1升基础培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.1g MgSO4·7H2O、10μl饱和CaCl2溶液、10μl饱和FeSO4溶液和1ml Bauchop&Elsden溶液。其中,1升的Bauchop&Elsden溶液含有10.75g MgSO4、4.5g FeSO4·7H2O、2.0g CaCO3、1.44g ZnSO4·7H2O、1.12g MnSO4·4H2O、0.25g CuSO4·5H2O、0.28g CoSO4·7H2O、0.06g H3BO3和51.3ml饱和HCl溶液。
拉曼图谱测定时,将稳定期的细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中,并利用高纯水将细胞稀释至106-108个/ml浓度,以保证单细胞水平的分散。取2μl稀释后细胞涂于镀有25nm TiO2的细胞载体芯片(基底层材料透明,厚度<10mm)上,室温风干。
所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使用了高灵敏度EMCCD(型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国),可缩短图谱采集时间;使用发射波长为532nm激光的激光器,激光强度最高为500mW;使用纳米-微米尺度显微镜,采用63倍物镜。将带有样品的细胞载体芯片置于改进的拉曼光谱仪的载物台,样品表面激光强度60mW,采集时间0.1s,获得如图1所示的单细胞拉曼图谱。
以前报道系统采用Jobin Yvon系统,表面激光强度15mW,采集时间30s,由结果可见,在保证谱图相同信息量的前提下可将单细胞拉曼图谱的最低采集时间缩短到0.1s,为已报道的系统的采集时间(30s)的1/300。
实施例3:基于拉曼图谱的单细胞快速鉴定
五株口腔微生物Enterococcus faecalis ATCC29212,Actinomycesviscosus ATCC27045,Streptococcus mutans UA159(ATCC700610),Streptococcus sanguinis ATCC49295以及Porphyromonas gingivalis W83(ATCC:BAA-308)(所述五株口腔微生物购买自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心(Microbial Culture Collection Center of GuangdongInstitute of Microbiology,GIMCC))均在BHI培养基中37°C静置培养至稳定期(所述BHI培养基购买自Qingdao Hopebio-Technology Co.,Ltd,中国),其中P.gingivalis W83的培养在严格厌氧条件下实行。拉曼图谱测定时,将稳定期的细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中,并利用高纯水将细胞稀释至106-108个/ml浓度,以保证单细胞水平的分散。取2μl稀释后细胞涂于镀有50nm Au镀层的细胞载体芯片(基底层材料透明,厚度<10mm)上,室温风干。
所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使用了高灵敏度EMCCD(型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国),可缩短图谱采集时间;使用发射波长为532nm激光的激光器,激光强度最高为500mW;使用纳米-微米尺度显微镜,采用63倍物镜。将带有样品的细胞载体芯片置于改进的光谱仪的载物台,样品表面激光强度60mW,采集时间0.5s,对每种菌株测定20个单细胞拉曼图谱(图2是测定的具有代表性的单细胞拉曼图谱),并对采集所得图谱通过MatLab软件进行主成分分析(PCA)和典型变量分析(CVA)。PC-CVA分析结果可将细胞分成五组,如图3所示,且除Enterococcus faecalis ATCC29212(b)和Streptococcussanguinis ATCC49295(e)间有微弱的重叠外,其它菌株均可被较好分开(这些细胞属于不同种属,图中不同符号代表不同种的细胞。若不同种的细胞有混合交叉,证明其未被分开;若其分隔较远,如所有的a聚集到一起,所有的b聚集到一起,且a和b无任何交叉,则证明a和b可被分开)。所有独立的测试样本都分布在置信区间内,且分类中具有较高权重的拉曼峰位与图2的结果吻合度较高,证明该分类结果的有效性。因此,快速扫描所获得的单细胞拉曼图谱可作为细胞分类的依据。
实施例4:基于细胞载体芯片的细胞分选/分离方法
用于测试的Escherichia coli DH5α分别在含有5g/l12C或13C标记葡萄糖的基础培养基中进行37°C,150rpm过夜培养至稳定期。1升基础培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.1g MgSO4·7H2O、10μl饱和CaCl2溶液、10μl饱和FeSO4溶液和1ml Bauchop&Elsden溶液。其中,1升的Bauchop&Elsden溶液含有10.75g MgSO4、4.5gFeSO4·7H2O、2.0g CaCO3、1.44g ZnSO4·7H2O、1.12g MnSO4·4H2O、0.25gCuSO4·5H2O、0.28g CoSO4·7H2O、0.06g H3BO3和51.3ml饱和HCl溶液。
在两种培养基中培养的细胞长至稳定期后,将菌液按体积等量混合,将细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中,并利用高纯水将细胞稀释至106-108/ml浓度,以保证单细胞水平的分散。取2-3μl稀释后细胞涂于不具备镀膜的细胞载体芯片上。所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使用了高灵敏度EMCCD(型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国),可缩短图谱采集时间;使用发射波长为532nm激光的激光器,激光强度最高为500mW;使用纳米-微米尺度显微镜,采用63倍物镜。将带有样品的细胞载体芯片置于改进的光谱仪的载物台,样品表面激光强度60mW,采集时间0.1s。经13C标记的细胞与未被标记的细胞的拉曼图谱有显著区别,据此可定位目标E.coli单细胞。随后开启高强度(能量约为270μJ)的337nm紫外氮分子激光将目标单细胞弹射并收集到离心管管盖中。经弹射分离后目标单细胞位置呈现空白,而其周围其它细胞未受影响(图4)。将分离所得单细胞进行基因组扩增,结果见图5,随后的16s-rRNA测序结果(与实施例5测序结果相同)证明管内细胞确实为E.coli而非其它物种,证明该基于细胞载体芯片的弹射方法分离单细胞的可靠性。
实施例5:基于细胞载体芯片的活体细胞分选/分离方法
本鉴定与分选方法原理如图6所示,其具体实现过程如下:
用于测试的Escherichia coli DH5α分别在含有5g/l12C或13C标记葡萄糖的基础培养基中进行37°C,150rpm过夜培养至稳定期。1升基础培养基含有2.5g Na2HPO4、2.5g KH2PO4、1.0g NH4Cl、0.1g MgSO4·7H2O、10μl饱和CaCl2溶液、10μl饱和FeSO4溶液和1ml Bauchop&Elsden溶液。其中,1升的Bauchop&Elsden溶液含有10.75g MgSO4、4.5gFeSO4·7H2O、2.0g CaCO3、1.44g ZnSO4·7H2O、1.12g MnSO4·4H2O、0.25gCuSO4·5H2O、0.28g CoSO4·7H2O、0.06g H3BO3和51.3ml饱和HCl溶液。
在两种培养基中培养的细胞长至稳定期后,将菌液按体积等量混合,将细胞用高纯水清洗三遍后重新悬浮于高纯水中,并利用高纯水将细胞稀释至106-108/ml浓度,以保证单细胞水平的分散。取2μl稀释后细胞分别涂于50nm Au、25nm TiO2、25nm Al2O3的细胞载体芯片上,室温风干。
所使用的共聚焦显微拉曼光谱仪在购买的普通拉曼光谱仪的基础上使用了高灵敏度EMCCD(型号DU970N-BV,购自Andor公司,英国),可缩短图谱采集时间;使用发射波长为532nm激光的激光器,激光强度最高为500mW;使用纳米-微米尺度显微镜,采用63倍物镜。将带有样品的细胞载体芯片置于改进的光谱仪的载物台,样品表面激光强度60mW,采集时间0.1s,获得如图7所得的单细胞拉曼图谱,由图可见,在13C标记葡萄糖的基础培养基中培养的细胞,其拉曼图谱与12C标记葡萄糖的基础培养基中培养的同种细胞具有显著差异。利用该差异,可以迅速识别和锁定所需要的目标细胞。
为了分离得到一个被13C标记的活体单细胞Escherichia coli DH5α,将拉曼共聚焦显微镜焦平面定位于镀膜底部,开启由激光器发出的共享光路的另一束532nm的脉冲激光,脉冲激光的最高输出能量为150mW;此处使用的脉冲激光与拉曼光谱采集所需激光波长相同,并且具有相同的光路系统,以避免频繁的光路系统切换及安装另外的仪器设备,降低设备成本用脉冲激光对锁定目标单细胞所处位置处镀膜施加能量,从而将目标单细胞弹射并收集到一个微量离心管管盖中。在三种镀层上的细胞分别被弹射后的细胞载体芯片,在显微镜下可以明显看到原有锁定的细胞已经不存在与细胞载体芯片上(图8,图9,图10)。将离心管盖上的细胞洗涤并转移到离心管中,并在100μl LB液体培养基
中进行培养,得到细胞生长悬浮液,利用悬浮液中的细胞进行16s rRNA的PCR扩增,对扩增产物测序,结果表明确实为Escherichia coli DH5α而非其他杂菌污染。表明通过细胞载体芯片与拉曼显微系统结合,可以在快速识别目标细胞后,得到活体单细胞。经该方法弹射所得的目标E.coliDH5α细胞可用于单细胞基因组扩增。所述16S-rRNA测序证实分离的细胞是Escherichia coli DH5α(测序结果如下:
CNGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCNACTCCATGAAGTCNGAA)(SEQ ID No.1)。
最后所应说明的是,以上实施例仅用以说明本材料的技术实施方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 北京惟馨雨生物科技有限公司
<120> 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法
<130> XLB-0026
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1235
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1218)..(1218)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1232)..(1232)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
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