CN114216837A - 联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法 - Google Patents
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Abstract
联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法，属于污水生物处理技术领域。本发明将流式细胞分选和拉曼技术结合起来，利用流式细胞分选测定样品的敏捷性与高精确性将Tetrasphaera属聚磷菌各亚群较为准确的分选出来再通过拉曼光谱仪对其胞内代谢物进行测定。该发明提供了一种污水处理系统复杂环境中特定功能菌群在周期内不同阶段的胞内代谢物的测定方法，为新型发酵型聚磷菌Tetrasphaera在实际污水厂的生物除磷提供理论依据，同时为其它在复杂环境中特异功能菌群的胞内代谢产物测定提供一种新的见解。
Description
技术领域
本发明涉及一种联合流式细胞分选和拉曼技术对发酵型聚磷菌Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法，属于污水生物处理技术领域，用于对污水生物处理系统中Tetrasphaera属聚磷菌的胞内代谢物的研究。
背景技术
水体富营养化己经成为制约我国可持续发展的重要环境问题之一，磷、氮等营养元素过量进入受纳水体会引起藻类生长，从而导致水体富营养化，因此，废水在排入环境前需要对氮、磷进行去除以降低富营养化的发生。目前相对高效、廉价和可持续发展的除磷方法便是强化生物除磷(EBPR)方法。该方法主要依靠聚磷菌的厌氧释磷，好氧超量吸磷特点将污水中的磷储存为在聚磷菌内，并通过排泥的方式将其排出系统外，达到除磷的目的。目前研究较多的聚磷菌为Candidatus Accumulibacter，其可在厌氧和好氧条件下交替运行，利用污水中存在的挥发性脂肪酸(VFAs)作为碳源在厌氧环境下充分释磷，以实现好氧/缺氧吸磷，最终以富磷污泥形式排出系统，从而达到除磷之目的。研究表明，为获得可靠的生物除磷效果，进水COD/TP应大于40，同时，厌氧区VFAs(COD)浓度应大于25mg/L，而我国生活污水中VFA含量较低(低于20mg/L)，利用EBPR工艺不能满足出水要求。与此同时，另一种具有除磷能力的菌群：Tetrasphaera属聚磷菌被发现，研究发现Tetrasphaera可以广泛利用污水中的糖类、蛋白质、氨基酸作为碳源，只有分支2的部分亚系利用VFAs,同时Tetrasphaera还具有发酵功能，将大分子物质发酵为VFAs供Candidatus Accumulibacter等异养微生物利用。因此，Tetrasphaera对于含有较低VFAs的污水具有一定的生物除磷优势。所以我们要对Tetrasphaera菌属代谢进行深入研究，以期为实际污水处理厂生物除磷提供理论依据。流式细胞分选技术发展，为污水处理系统中特定细菌分离提供了方便。同时，拉曼单细胞显微技术的发展，为细胞内部代谢产物的定性提供了可能，两者相结合，为特定细菌亚群的代谢研究提供了新的见解。
流式细胞分选是一种根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能对复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离的技术。当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。实验结果以单参数的柱状图或双参数的散点图来表示。流式细胞分选能够灵敏的、高通量以及自动化的对水样中细菌亚群进行分离。其大多用在医学领域，对细胞基因的表达、致病基因、蛋白和信号传导进行研究；在海洋领域，对不同藻类、浮游微生物进行分离研究；在污水处理领域，对聚磷菌亚群分离进行后续研究较少。
拉曼是一种入射光子与分子发生非弹性散射，分子发生能级跃迁而发散射光，散射光中与入射光频率相同的谱线，称为瑞利线，而与入射光频率不同的谱线，称为拉曼线。每种物质都有其特征拉曼谱线，我们可以根据特征峰确定细胞内包含的物质。其多应用于在材料领域，毒品以及金刚石，薄膜等各种材料的研究，在污水生物处理领域，多应用与于复杂泥样中随机选取细胞的胞内聚合物的研究，对特定细菌亚群在不同时期代谢的研究较少，将流式细胞分选与拉曼技术结合起来，可以为特定细菌亚群的代谢研究提供了新的见解
本发明利用Tetrasphaera菌属不同亚群探针标记的染料情况对复杂泥样中的Tetrasphaera菌属进行细胞分选，分选后的细胞放在拉曼显微光谱仪上进行拉曼测定，从而在细胞水平上对Tetrasphaera菌属亚群的代谢进行研究。
本发明在技术上不同于现有技术，主要体现在以下方面：
现有技术对所有聚磷菌代谢分析主要有：
(1)利用DAPI染色相对定量胞内聚磷含量，通过气相色谱进行PHA定量，采用气相色谱-质谱联用仪对胞内氨基酸进行测定，而糖原则采用蒽酮比色法分析，然而由于泥样的复杂性，通过化学分析法只能够对所有菌群的胞内聚合物进行测定，无法准确确定特定菌群的代谢，而利用DAPI染色确定的胞内聚磷也可能因为DAPI浓度的选取造成误差；
(2)单独采用拉曼技术可以对所有聚磷菌胞内聚合物如聚磷、糖原、PHA等进行监测，但无法分辨这些细胞属于Candidatus Accumulibacter、Tetrasphaera、Dechloromonas型聚磷菌或者聚糖菌，另外，研究者通过荧光原位杂交和拉曼技术相结合确定了部分污水处理厂中Candidatus Accumulibacter和Tetrasphaera对生物除磷的贡献相当，但是并没有对Tetrasphaera亚群进行代谢分析，此外，传统的荧光原位杂交所需探针一般都有很强的淬灭性，需要严格避光，并且探针的荧光染料会干扰拉曼光谱的测定；
本技术对聚磷菌代谢分析为：
(3)本发明联合使用流式细胞分选和拉曼技术，细胞分选可以较为准确的分离Tetrasphaera菌属的特异性探针Tet1-266、Tet2-174、Tet2-892和Tet3-654所标记的细胞，同时经过分选后的探针荧光强度会减弱，且分选后的细胞无需避光处理，进行拉曼光谱测定时荧光干扰较小，通过分选不同时期(进水、厌氧末和好氧末)的Tetrasphaera亚群，并在拉曼光谱仪上进行拉曼光谱测定，为复杂环境中特定菌群的代谢测定提供了新的见解。
故本发明取污水处理系统活性污泥中的微生物，联合采用流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera型聚磷菌亚群的胞内代谢进行测定，未见相关研究报道。
发明内容
本发明目的是提供了一种在复杂环境中对特定菌群胞内代谢物的检测方法。采用Cy5染料标记的特异性探针Tet1-266、Tet2-174、Tet2-892和Tet3-654对Tetrasphaera菌各亚群进行染色，全菌则通过SYBR GreenⅠ染料染色。标记后的菌液通过PBS稀释后，进入流式细胞分选仪，首先对被检测的主要的菌群进行圈门，利用圈门圈出图中被特异探针标记的Tetrasphaera菌亚群以用于后续分选纯度的确定，接下来在上样架上放上上述经PBS稀释后的菌液，调整好分选装置的角度后，打开分选装置前的门，放入收集管，设定合适的收集速率后进行分选，收集后的细胞进行纯度分析，将收集后的细菌亚群进行浓缩后放在拉曼光谱仪上进行拉曼分析，用于确定Tetrasphaera菌各亚群在周期变化时的代谢产物的变化，为其在实际污水处理厂中生物除磷提供理论依据，具有很好的应用前景。
一种联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法，其特征如下：
(1)取处理生活污水反应器中的泥样400～600μL，在10000r/min转速下离心3min，弃掉上清液，加入1mL PBS缓冲液涡旋、离心3次，去除上清液，完成泥样的清洗；清洗后加入所取泥样三倍体积的质量百分比浓度为4％的多聚甲醛固定液，在4℃温度下固定2h；将固定好的样品取出，在10000r/min转速下离心3min,去除上清液，再加入1～1.5mL PBS缓冲液清洗两次，离心去除上清液，加入与原泥样相同体积的PBS缓冲液在冰浴下超声，超声强度为75～85w，超声59s，间隔1s，总时长4～5min,将超声好的样品分装多份，每份依次添加体积浓度为50％、80％和99％的乙醇溶液1mL进行脱水，每次脱水3min，晾干；
(2)分装晾干后的每个离心管中添加300μL杂交缓冲液作为单阳对照，267μL杂交缓冲液+33μL探针的杂交混合液作为双阳样本，超声重悬1min,放在46℃恒温培养箱中杂交2h30min～3h，杂交完成后，离心去除上清液，加入1mL杂交清洗液清洗1次，离心去除上清液，加入1mLPBS，冰浴中超声重悬1min，过10μm滤膜后于新的离心管中加入10μL SYBRGreenⅠ染料染全菌15min，稀释500～1000倍后上机检测；
(3)打开流式细胞分选仪，流式细胞分选仪配备488nm和633nm激光器,采用488nm发射谱线用于微生物细胞前角光散射FALS和绿色荧光FITC的测定,633nm发射谱线用于红色荧APC的测定。设置FITC阈值为400～500,进样收集50000个颗粒，圈出发红色荧光的Cy5染料标记的探针所在区域；调试好细胞分选的各参数：鞘压力：31.5～31.9psi，使用70μm尖端，下降频率：88～92kHz；振幅：45.7～46.1V；手动液滴延迟：44～46；和中断点：178～182，分选装置的角度设为60～70°，使液流直接进入到收集管底部；将样品放在上样架上，设定收集速率1500～2000events.s-1，进行100000个颗粒的细胞分选；
(4)分选完毕后分别取出样品管和分选管，将分选管放在上样架上，进样速率调至最高后按照步骤(3)进行分选纯度的测定；
(5)分选管中样品转移到新的离心管中在6000r/min下离心15min用于所获Tetrasphaera各亚群的浓缩，取离心浓缩的样品10μL放在CaF2窗片上；打开WiRE 2.0软件，将硅片放置在载物台上，选取532nm半导体激光器，使其在321cm-1出现唯一特征峰完成仪器的校准；对校准后的仪器进行参数设置：所有测量均选择785nm半导体激光器，使用的光栅为600mm/槽，光谱范围选择从300到3000cm-1；每个细胞照射时间为10s，强度为0.5～5％，测试次数为3次；
(6)参数设置完成后，将含有浓缩样品的CaF2窗片放在50X长焦显微镜下观察，通过微调看到清晰的细胞后运行拉曼光谱仪获得该细胞的拉曼光谱图，通过与已有标准品的拉曼特征峰对比即可确定胞内存在的物质。
磷是维持生物体正常生理活动重要元素，其过度排放会导致水体富营养化，防止磷元素进入水体，是解决富营养化问题的根本手段之一。强化生物除磷工艺通过富集聚磷菌进行除磷，是一种经济高效的除磷方法，但EBPR系统的除磷效果又经常受到进水COD(尤其是VFAs)的影响，而Tetrasphaera型聚磷菌可以广泛利用蛋白质、葡萄糖、氨基酸等大分子物质，并利用其发酵功能产生VFAs供Candidatus Accumulibacter型聚磷菌利用，达到协同除磷的目的。本发明提供一种在复杂环境中对特定菌群胞内代谢物的检测方法，可以确定Tetrasphaera菌各亚群在周期变化时的代谢产物的变化，从而为其在实际污水处理厂中的应用提供理论依据。
本发明的创新点
(1)本发明严格控制了超声功率和时间，减少了超声功率较弱与超声时间过短使细菌不能完全分散或者超声功率过强与超声时间过长使细菌破碎的情况，保证了细菌完整性的同时污泥能够分散均匀；
(2)本发明通过流式细胞分选仪将污水处理复杂的微生物环境中的特定Tetrasphaera聚磷菌的各亚群较为准确提取纯化出来，分选后的菌群可以进行培养研究；解决了污水处理系统微生物种类繁多，功能菌种提取较难的问题。
(3)分选纯化后的样品无需避光，可明显降低荧光强度，减少了荧光强度对拉曼测定的干扰，使得拉曼分析能够准确的发现Tetrasphaera菌的各亚群细胞的胞内代谢产物的变化。
附图说明
图1两种探针标记亚群分选纯化圈门图。
图1是Tet1-266和Tet2-174两种探针标记并分选纯化后的Tetrasphaera菌亚群的丰度图，图1a、c分别是在活性污泥中Tet1-266和Tet2-174探针标记的Tetrasphaera菌分支1和分支2的丰度，分别为17.1％和9.71％，图1b、d则分别为Tet1-266和Tet2-174探针标记的Tetrasphaera菌分支1和分支2经过流式细胞分选后的丰度情况，可以看到分选后的两个分支的丰度分别达到了84.7％和75.3％，都得到了纯化富集。
图2两种特异探针标记细胞的FACS-Raman对比图
图2是Tet1-266和Tet2-174两种探针标记并分选纯化后的Tetrasphaera菌亚群的拉曼光谱图；图2a、b和c分别是Tet1-266探针标记分选并用拉曼仪器测定的Tetrasphaera菌亚群1的开始、厌氧末和好氧末的拉曼光谱图；亚群1在厌氧阶段的胞内储存物包含甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、丝氨酸等氨基酸，在随后的好氧阶段利用厌氧段的胞内储存物摄取磷，并将其储存为poly-P(拉曼特征峰位置690和1170cm-1)。图2d、e和f分别代表Tet2-174探针标记分选纯化的Tetrasphaera菌亚群2的原始、厌氧末和好氧末的拉曼光谱图；亚群2在厌氧阶段的胞内储存物除了上述氨基酸之外，还有PHA(拉曼特征峰位置1732cm-1)，随后的好氧阶段利用上述内储物进行磷的摄取。
具体实施方式
1污泥中微生物菌群的固定及杂交染色
1.1污泥微生物固定、超声破碎和乙醇脱水
(1)取污泥600μL于2mL离心管中，在10000r/min转速下离心3min，弃掉上清液，加入1mLPBS缓冲液涡旋、离心和清洗3次，去除上清液，加入1.8mL多聚甲醛固定液(质量百分比浓度为4％)，在4℃温度下固定2h；
(2)将固定好的样品的离心管取出，在10000r/min转速下离心3min,去除上清液，再加入1.2mLPBS缓冲液清洗两次，离心去除上清液，加入600μLPBS缓冲液在冰浴下超声，超声强度为75～85w，超声59s，间隔1s，总时长4min,将超声好的样品分装六份，依次添加50％、80％和99％的乙醇溶液1mL进行脱水，每次脱水3min，晾干即可。
1.2探针和染料染色
分装晾干后的每个离心管中添加300μL杂交缓冲液(用于单阳对照)和300μL杂交混合液(267μL杂交缓冲液+33μL探针)，超声重悬1min,放在46℃恒温培养箱中杂交3h，杂交完成后，离心去除上清液，加入1mL杂交清洗液清洗1次，离心去除上清液，加入1mLPBS，冰浴中超声重悬1min，过10μm滤膜后于新的离心管中加入10μL SYBR GreenⅠ染料染全菌15min，稀释500～1000倍后上机检测。
按下表配制杂交缓冲液和杂交清洗液。
配制杂交缓冲液
加药顺序：向2mL离心管中依次加入甲酰胺、NaCl、Tris/HCl、SDS、无菌双蒸水，加药完毕盖盖摇匀。
配制杂交清洗液
2上机检测和细胞分选
2.1细胞亚群检测获取与分析
打开流式细胞分选仪，流式细胞分选仪配备488nm和633nm激光器,采用488nm发射谱线用于微生物细胞前角光散射(FALS)和绿色荧光(FITC)的测定,633nm发射谱线用于红色荧光(APC)的测定。设置FITC阈值为400,进样收集50000个颗粒，圈出Cy5染料(红色荧光)标记的探针所在区域；
2.2细胞分选
(1)在样品架上放置CS&T微球，在软件中进行基线设置，上样运行完成流式细胞分选仪的质控操作,保证不同时间实验数据的一致性；
(2)调试好细胞分选的各参数：鞘压力：31.7psi，使用70μm尖端，下降频率：90kHz；振幅：45.7～46.1V；应用Accutrop确定液滴延迟：44～46；中断点：178～182，分选装置的角度设为60～70°，使液流直接进入到收集管底部；将样品放在上样架上，设定收集速率2000events.s-1，进行100000个颗粒的细胞分选；
(3)分选完毕后分别取出样品管和分选管，将分选管放在上样架上进样速率调至最高后按照步骤(2)进行分选纯度的测定；
图1a、c即是活性污泥中Tet1-266和Tet2-174探针标记的Tetrasphaera菌的原始亚群丰度，图1b、d则分别为Tet1-266和Tet2-174探针标记的Tetrasphaera菌分支1和分支2经过流式细胞分选后的丰度，可以看到Tetrasphaera菌的两个分支都得到了纯化富集。
3细胞拉曼光谱的测定
(1)收集管中样品转移到新的离心管中在14000r/min下离心15min用于所获Tetrasphaera各亚群的浓缩，取离心浓缩的样品10μL放在CaF2窗片上准备拉曼光谱的测定；
(2)分选管中样品转移到新的离心管中在6000r/min下离心15min用于所获Tetrasphaera各亚群的浓缩，取离心浓缩的样品10μL放在CaF2窗片上；打开激光共聚焦拉曼光谱仪及WiRE 2.0软件，将硅片放置在载物台上，选取532nm半导体激光器，使其在321cm-1出现唯一特征峰完成仪器的校准；对校准后的仪器进行参数设置：所有测量均选择785nm半导体激光器，使用的光栅为600mm/槽，光谱范围选择从300到3000cm-1；每个细胞照射时间为10s,强度为0.5～5％，测试次数为3次；
(3)参数设置完成后，将含有浓缩样品的CaF2窗片放在50X长焦显微镜下观察，通过微调看到清晰的细胞后运行拉曼光谱仪获得该细胞的拉曼光谱图，通过与已有标准品的拉曼特征峰对比即可确定胞内存在的氨基酸、PHA和poly-P。
Claims (1)
1.联合流式细胞分选和拉曼技术对Tetrasphaera亚群胞内代谢物测定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取处理生活污水反应器中的泥样400～600μL，在10000r/min转速下离心3min，弃掉上清液，加入1mL PBS缓冲液涡旋、离心3次，去除上清液，完成污泥的清洗；清洗后加入所取泥样三倍体积的质量百分比浓度为4％的多聚甲醛固定液，在4℃温度下固定2h；将固定好的样品取出，在10000r/min转速下离心3min,去除上清液，再加入1～1.5mL PBS缓冲液清洗两次，离心去除上清液，加入与原泥样相同体积的PBS缓冲液在冰浴下超声，超声功率为75～85w，超声59s，间隔1s，总时长4～5min；将超声好的样品分装多份，每份依次添加体积浓度为50％、80％和99％的乙醇溶液1mL进行脱水，每次脱水3min，晾干；
(2)分装晾干后的第一个离心管中添加300μL杂交缓冲液作为单阳对照，其他离心管中添加267μL杂交缓冲液+33μL探针的杂交混合液作为双阳样本，超声重悬1min，放在46℃恒温培养箱中杂交2h30min～3h；杂交完成后，离心去除上清液，加入1mL杂交清洗液清洗1次，离心去除上清液，加入1mL PBS缓冲液，冰浴中超声重悬1min，过10μm滤膜后于新的离心管中加入10μL SYBR GreenⅠ染料染全菌15min，稀释500～1000倍后上机检测；
(3)打开流式细胞分选仪，流式细胞分选仪配备488nm和633nm激光器,采用488nm发射谱线用于微生物细胞前角光散射FALS和FITC绿色荧光的测定，633nm发射谱线用于红色荧光APC的测定；设置FITC阈值为400～500，进样收集50000个颗粒，圈出发红色荧光的Cy5染料标记的探针所在区域；调试好细胞分选的各参数：鞘压力：31.5～31.9psi，使用70μm尖端；下降频率：88～92kHz；振幅：45.7～46.1V；手动液滴延迟：44～46；中断点：178～182；分选装置的角度设为60～70°，使液流直接进入到收集管底部；将样品放在上样架上，设定收集速率1500～2000events·s-1，进行100000个颗粒的细胞分选；
(4)分选完毕后分别取出样品管和分选管，将分选管放在上样架上，进样速率调至最高后按照步骤(3)进行分选纯度的测定；
(5)分选管中样品转移到新的离心管中在6000r/min下离心15min用于所获Tetrasphaera各亚群的浓缩，取离心浓缩的样品10μL放在CaF2窗片上；打开激光共聚焦拉曼光谱仪和WiRE 2.0软件，将硅片放置在载物台上，选取532nm激光器，使其在321cm-1出现唯一强特征峰完成仪器的校准；对校准后的仪器进行参数设置：所有测量均选择785nm半导体激光器，使用的光栅为600mm/槽，光谱范围选择从300到3000cm-1；每个细胞照射时间为10s，强度为0.5～5％，测试次数为3次；
(6)参数设置完成后，将含有浓缩样品的CaF2窗片放在50X长焦显微镜下观察，通过微调看到清晰的细胞后运行拉曼光谱仪获得该细胞的拉曼光谱图，通过与已有标准品的拉曼特征峰对比确定胞内存在的氨基酸、PHA和poly-P。
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|---|---|
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2741036A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-06-03 | Biomerieux, Inc. | Methods for separation, characterization, and/or identification of microorganisms using raman spectroscopy |
| CN102019277A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 北京惟馨雨生物科技有限公司 | 一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法 |
| CN102661941A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-09-12 | 湖南大学 | 基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强sers高通量生物传感方法 |
| CN103353452A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-10-16 | 北京惟馨雨生物科技有限公司 | 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法 |
| CN107430588A (zh) * | 2015-01-22 | 2017-12-01 | 斯坦福大学托管董事会 | 用于确定不同细胞亚群的比例的方法和系统 |
| CN107727633A (zh) * | 2017-09-20 | 2018-02-23 | 复旦大学 | 一种表面增强拉曼光谱检测平台及其制备方法与应用 |
| CN110687089A (zh) * | 2018-07-06 | 2020-01-14 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 基于单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪 |
-
2021
- 2021-11-16 CN CN202111358562.XA patent/CN114216837B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2741036A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-06-03 | Biomerieux, Inc. | Methods for separation, characterization, and/or identification of microorganisms using raman spectroscopy |
| CN102019277A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-04-20 | 北京惟馨雨生物科技有限公司 | 一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法 |
| WO2012055304A1 (zh) * | 2010-10-29 | 2012-05-03 | 北京惟馨雨生物科技有限公司 | 一种用于细胞和颗粒分离的分选仪及分选方法 |
| CN102661941A (zh) * | 2012-04-19 | 2012-09-12 | 湖南大学 | 基于拉曼活性纳米颗粒混合组装的循环肿瘤细胞的耦合增强sers高通量生物传感方法 |
| CN103353452A (zh) * | 2013-07-12 | 2013-10-16 | 北京惟馨雨生物科技有限公司 | 细胞载体芯片及利用其进行单细胞快速鉴定或分选的方法 |
| CN107430588A (zh) * | 2015-01-22 | 2017-12-01 | 斯坦福大学托管董事会 | 用于确定不同细胞亚群的比例的方法和系统 |
| CN107727633A (zh) * | 2017-09-20 | 2018-02-23 | 复旦大学 | 一种表面增强拉曼光谱检测平台及其制备方法与应用 |
| CN110687089A (zh) * | 2018-07-06 | 2020-01-14 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 基于单细胞检测的高通量并行拉曼光谱仪 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BAOGUI WANG等: ""Investigation of the polyphosphate-accumulating organism population in the full-scale simultaneous chemical phosphorus removal system"", 《ENVIRONMENTAL SCIENCE AND POLLUTION RESEARCH》 * |
| HONGJUN LIU等: ""Phosphorus removal performance, intracellular metabolites and clade-level community structure of Tetrasphaera-dominated polyphosphate accumulating organisms at different temperatures"", 《SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT》 * |
| ZHIWEI FAN等: ""Achieving enhanced biological phosphorus removal utilizing waste activated sludge as sole carbon source and simultaneous sludge reduction in sequencing batch reactor"", 《SCIENCE OF THE TOTAL ENVIRONMENT》 * |
| 刘聪;谢伟;何林;张传伦;: "单细胞拉曼光谱在微生物研究中的应用", 微生物学报, no. 06 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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