JPH02503747A - 微生物の定性および／または定量試験方法およびその方法を実施するための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物の定性および／または定量試験方法およびその方法を実施するための装置 この発明は、液体、半液体、ゲル、ペースト、固体などの状態の媒体中の微生物 を、極めて少量存在する場合でも、定性的および／または定惜的に試験する方法 と、その方法を実施するための装置に関する。

この発明に用いる”極めて少量°という用語は、１に等しい微生物の数を意味す ると解すべきである。

食料製品、健康食品もしくは健康飲料中の細菌、酵母、かび、寄生虫およびウィ ルスのような微生物の存在の迅速な定性・、定態分析や醗酵工程を実施する過程 で監視することが、種々の関連産業で非常に宵用かつ重要であることは明らかで ある。

通常用いられる検出法は、被検製品の試料を培養する方法である。この検出法は 実施するのに時間がかかるという欠点がある。すなわち存在している可能性があ る微生物を２〜３０日間増殖させる。さらに、この方法による微生物の計数は全 く不正確であり、当初に存在する微生物の数の近似値が得られるだけであり、こ の方法による微生物の同定は不完全なものである。

影像分析法による他の検出法が同様に知られているが、この方法は、現在まで実 施されている形態では高価なので実施が困難であり、実際に、試料中に存在する 微生物の正確な計数もしくは高感度の検出を達成するには、試料の全視野を分析 する必要があり、このことが原因でこの試験には著しく時間がかかる。

生きている細胞を標識しないが、死んだ細胞を標識することが非常に多い化学染 料もしくは生物学的染料の特に核酸の染料か、または抗体とカップリングさせる ことによって永年にわたって使用されてきたフルオレセインとフィコエリトリン の誘導体のような蛍光色素によって、細胞特に微生物に標識をつけることが同様 に知られている。

蛍光性を付与されたポリスペシフィック抗体（ａｎＬｉｃｏｒｐｐｌｏｙｓｐｅ ｃｉｒｉｑｕｅｓ）もしくはモノスペシフィック抗体は従来技術の特に本願出願 人のフランス特許願＾１−８６１０１６２０号に記載されており、これにはポリ スペシフィック抗体である抗酵母抗体および抗カビ抗体が記載されている。

しかしこれらの蛍光抗体は、細胞が生きているか死んでいるかにかかわらず、す べての細胞に蛍光を発生させるが、このことは食料製品もしくは健康食品中の生 物の汚染物の存在を選択的に測定するとか、または醗酵工程の促進状況と適確な 進行を判定する場合には重大な欠点になる。

特にカルボキシフルオレセインジアセタート（ＣＦＤＡ）とフルオレセインジア セタート（ＦＤＡ）のような他の染料が同様に前記文献に記載されているが、後 者は、細菌の検出に用いられ、イ＜ツかの文献に記載されている［　Ｔ、Ｒ，Ｃ ｈｒｚａｎｏｗｓｈｉ　ｅＬａｌ、　−Ａｐｐｌｉｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　ｒｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ　５ｅｔｈｏｄｏｆ　ｄｅ ｔｅｃｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｆｒｅｓｈ　ｗａｔ ｅｒ−、ＭｉｃｉｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ、　１０！、１７９〜１８５頁、１ ９８４年；　Ｂ、Ｌｕｎｄｇｒｅｎ。

”Ｆｉｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａＬｅ　ａｓ　ａ　５ｔａｉｎ　ｏｒ 　ｍｅＬａｂｏｌｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　５ｏｉ ｌ°、　０ＩＥＯ３，３６巻、１７−２２頁、１９８１年；Ｊａｒｎａｇｉｎ　 ｅｔ　　ａｔ　　−Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａ ｃｅＬａＬｅ　ａｎｄｅｔｈｉｄｉｕ＋ｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　ａｓ　ａ　５ｔａ ｉｎ　　ｆｏｒ　ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｏｒｍｙｅｏｂ ａｃｔｅｒｉａ”、　５ｔａｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５５（４）巻、２５３ 〜２５８頁、１９８０年：および５ｃｈｎｕｒｅｒ　Ｊ、　ｅＬ　ａｌ、　”Ｆ ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅＬａＬｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　　ａｓ　　 ｓ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｏｒ　　ｔｏｔａｌ　　５ｉｃｒｏｂｉａｌ　　ａｃｔｉ ｖｉｔｙ　　１ｎｓｏｉｌ　ａｎｄ　１ｉｔｔｅｒ”、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖ ｉｒｏｎｓ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４３（６）巻、１２５６〜１２６１頁、 １９８２年； Ｓｏｎｔａｇには、上記の染料とその作用機構が記載されている］。

しかしこれらの文献に関連している方法は、一般に測定法であるか、または、そ の方法が定量法の場合、核酸を染色する化学薬品を使用する。これらの方法は連 続した分析に適していない。

従来技術の検出法では、生きた微生物、特にごく少量存在する生きた微生物を、 選択的に検出できない。

したがって、この発明の目的は、迅速かつ容易に実施することができ、鋭敏かつ 特異的で低価格であり、微生物を１の精度で計数することができる、微生物を試 験、検出および計数する方法を提供することである。

この発明の課題は、液体、半液体、ゲル、ペースト、固体などの状態の媒体、特 に食料製品、健康食品または生体液を、最初にポジティブバイアビリティ染料に 接触させて、これら製品または液体中に存在する生きた微生物のみに選択的に標 識をつけて、これら媒体中に通常存在しているか、または汚染物として含有され ている可能性のある微生物を定性分析および／または定量分析する方法であって ： 前記ポジティブパイアビリティ染料による微生物への標識付けを、前記パイアビ リティ染料単独か、または他のパイアビリティ染料、生体染料、発蛍光化抗体お よび発蛍光化された核酸プローブからなる群から選択された他の物質との混合物 を用いて行い、次いで、フロー・サイトメーター（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏ給ｅｔｅ ｒ）もしくは画像分析機のような適切な手段を用いて、１の精度で正確な計数す るとともに、標識をっけた各微生物の代謝状態を測定することを特徴とする方法 である。

この発明において用いられる“微生物゛という用語は、特に細菌、酵母、かび、 寄生生物およびウィルスを意味する。

この発明に用いる゛ポジティブバイアビリティ染料（ｃｏｌｏｒａｎＬｄｅ　ｖ ｉａｂｉｌｉｔｉｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）’という用語は、生細胞のみを染色し て、死んだ細胞を染色せず、その細胞を染色した場合の染色強度が細胞の代謝活 性に比例する物質を意味する。

この発明で用いる生体染料（ｃｏｌｏｒａｎｔ　ｖｉＬａｕｘ）は、核酸染料で あり、生細胞と死んだ細胞の両者の遺伝物質と結合する。

生体染料について限定はないが、臭化エチジウム、ヨウ化プロビジウム、マイト ラマイシンＡ　（ｍｙＬｈｒａｍｙｃｉｎｅ　Ａ）　、ＤＡＰＩが挙げられ、ヘ キスト３３２５Ｂ、およびヘキスト３３３４２として市販されている。

フロー・サイトメーターは、それ自体公知であるが、多くの文献に記載されてお り、特に欧州特許願第＾−１７７，７１８号に記載されている。

この発明による、手段の組合わせは、連続的に検出を行えるという長所を有し、 迅速に実施できて信頼性があり、ｌの精度で計数できる。この発明の方法は、標 準の集団に対する濃度の測定法ではないので、分析前に、微生物の種もしくは型 を知る必要はない。

この発明の方法の有利なりＩＮ！によれば、抗体としては、以下のものから選択 される。すなわちポリクローナルおよび／またはモノクローナル、モノスペシフ ィックまたはポリスペシフィックの、抗酵母抗体および／または抗細菌抗体およ び／または抗カビ抗体および／または抗寄生生物抗体お上び／または抗ウイルス 抗体、ならびにポリクローナルおよび／またはモノクローナル１モノシネリツク （ｍｏｎｏｇｅｎｅｒｉｃ）またはポリシネリックの、抗酵母抗体および／また は抗細菌抗体および／または抗カビ抗体および／または抗寄生生物抗体および／ または抗ウイルス抗体から選択される。

この発明によれば、使用される抗体は、適切な蛍光色素によって発蛍光化される 。

パイアビリティ染料の機能は、生きた微生物に選択的に標識を付けることである 。

抗体の機能は、微生物の生死にかかわらず、その種もしくは属に特異的に標識を つけることである。

この発明の他の有利な態様によれば、被検試料は、標識をつける前に、生物学的 、化学的もしくは物理的な処理を受けるが、この処理は、微生物のポジティブパ イアビリティ染料の摂取を促進することができる最適の代謝状態に微生物を置く ことを目的とするものである。

上記態様の有利な点によれば、上記の予め行う処理には、媒体のｐ）−１を調節 する緩衝剤の作用が含まれる。

上記態様の有利な点によれば、ｐＨを調節する緩衝剤は、同様に可溶化媒体とし て用いられる。

上記態様の他の有利な点によれば、上記の予め行う処理には超音波作用が含まれ る。

上記態様の他の有利な点によれば、上記の予め行う処理には適切な酵素の作用が 含まれる。

上記の予め行う処理によって元来コロニーを形成する個々の細胞の識別が可能に なり、その結果、検出感度が増大する。

上記の態様の他の有利な点によれば、被検試料は、特に遠心分離もしくは濾過に よって相分離がなされる。

ポジティブパイアビリティ染料は、微生物に浸透する、非蛍光の物質かまたはわ ずかに蛍光を発する物質が選定され、そのときこれらの物質は、分解（ｓｐｌｉ ｔ）もしくは修飾されて蛍光産生物を供給し、この産生物は大部分もしく全部が 面記微生物内に捕そくされる。

この発明のパイアビリティ染料は、ＦＤＡ、６−ＣＦＤＡ、　５−ＣＦＤＡ、フ ルオレセインジラウレート、５．６−ＣＦＤＡ　　Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイ ミドのエステル、フルオレセインジプロビオナート、ジーβ〜Ｄ−ガラクトシド フルオレセイン、３−０−メチルフルオレセインホスファート、２°、７゛−ビ ス−（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセインのペンタアセ トキシエステル（ＢＣＥＣＦ／ＡＭ）　、アジドフルオレセインノアセタート、 ４−メチルウンベリフェリルアセタート、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ− ガラクトンド、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド、４−メ チルウンベリフェリルアセタ−ト、４−メチルウンベリフェリルアセタ−ト、ア ラニン−７−アミノ−４−メチルクマリン、グリシン−７−アミノ−４−メチル クマリン、プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリン、バリン−７−アミノ− ４−メチルクマリン、グリシル−し−プロリン−７−アミノ−４−メチルクマリ ン、１．４−ジアセトキシ−２，３−ジシアノベンゼン（八ＢＤ）、ヒドロエチ ジンおよびレゾルフィンアセタートからなる群から選択される。

利用する染色条件下でフルオレセインジラウレート（ＦＤＡ）は、排他的に生き た酵母に標識をつける。このことは、ＦＤＡが細菌：こ標識をつけるのに用いら れ、カルボキシフルオレセインジアセタートが生細菌に排他的に標識をつけると いう従来技術において知られていることとは逆のことである。

これらの条件下で、各微生物の蛍光強度は、そのバイタリティの関数である。こ の発明の課題は、同様に、被検製品もしくは被検流体の試料が通過する流れ測定 室を備えた測定セルと、微生物が発する蛍光信号を記録する装置とを備えたフロ ー・サイトメータからなり、該測定セルが、該測定室を洗浄する装置を備え、こ の洗浄装置が、試料キャリヤーから試料を除去する場合かＪたは適当な外部の電 子指令によって作動することを特徴とする、微生物の試験のための定性および／ または定量を行う装置である。

従来技術のフローサイトメータの、特に欧州特許願第Ａ−０，１７７，７１８号 に記載されているものは、この発明の方法を実施することかもきる。これらのフ ローサイトメータは、産業に用いられる限り、複雑でこわれやすい。

対照的に、この発明の装置は、この発明の方法を産業規模で実施するために改良 された利点を有する。

この発明の有利な態様によれば、前記洗浄装置は、少なくとも２台の吸引ポンプ と送液ポンプを備え、各々、いずれかもしくは両者が機能し、これらのポンプは 、被検試料を提供する場合には、測定セルに一方が被検試料を送り、他方が被覆 液を送り、また試料を試料キャリヤーから除去する場合には、一方のポンプを停 止し他方のポンプを作動させて洗浄を行う。

上記の態様以外に、この発明はさらに他の要素を含んでＬ）てもよく、このこと は、この発明の方法を実施する実施例を参照した詳細な説明と、この発明の装置 の態様を例示する添付図面を参照したこの発明の装置の詳細な説明とから明らか になるであろう。

第１図はこの発明の方法を実施する装置の一懸樟を示す概略図であり、その装置 の洗浄装置は２台のポンプを備えている。

第２図は、第１図の態様の測定室の斜視図である。

第３〜１４図はグラフ図である。

実施例、図面および対応する説明部分はいずれも、この発明の！１ｌｌｉを例示 するためのものであり、この発明を限定するものではないことは充分理解されな ければならない。

第１図〜３図に示す装置は標識をつけた微生物を検出するための装置である。

第１図はこの発明の微生物検出装置を示す。

この装置は光源ｌＯを備えているが、これには、水銀ランプが用いられる。光源 から発した光線１１はレンズ１２によって焦点に集められ、二色性ｆａ、＋３に よって測定室２１に導入される。この同じ測定室に、この発明の方法によって処 理された試料３０が到達し、試験中、微生物の検出と係数が実施される。

試料が、発蛍光化された微生物を含有する場合、微生物は可視範囲の蛍光を再発 光し、その蛍光は顕微鏡対物レンズ１４によって流動室内の流路に送られ、光電 子増倍管４０によって電気信号に変換され、次いで適当な手段に、特にヒストグ ラムの形態で記録される。

同時に試料は、対眼レンズ６０によって目視可能に表示される。

光電子増倍管４０と記録装置との間にある弁別器５０によって、ヒストグラムに 良好な解像度が得られる。

第２図は、流れ測定セル２０の斜視図であり、このセルには測定室２１が設けら れ、これを被検微生物が通過する。この測定室は、セル２０の上に顕微鏡のスラ イドガラス２５を置くことによって不浸透性になされている。試料中に入ってＬ ）る可能性がある微生物は、試料３０に直接開口している約１００μｍのノズル によって測定室２１に注入され、その微生物を輸送する液体ジェットは、ノズル ２２によって送られる液体２３によって包まれる。

測定セル２０に連結される流体装置は、２方向に回転する２台のポンプ３６゛。

３７を備え、ポンプ３６は圧力ポンプであり、ポンプ３７は吸引ポンプである。

この流体装置によって、第１段階では、被検試料と被覆液とを両ポンプの回転速 度の関数である流速で送って試料３０を送りこみ、次に第２段階では、ポンプ３ ７を停止しポンプ３６で送って流体装置の洗浄を実施して、試料を試料キャリヤ ーから除去することができる。

実施例１：ヨーグルトを汚染する酵母の竺ｕ被検酵母のタイプによるが、その酵 母に最も適したパイアビリティ染料および／または抗酵母抗体を選択することが できる。

ヨーグルトは、ｐＨ９，０のＥＤＴ＾カーボネート緩衝液のような適切な試薬で 可溶化される。生成物を１．５００９で５分間遠心分離する。沈降物を９９／ｇ の塩化ナトリウム中に入れる。適当な抗酵母蛍光抗体と会合させたフルオレセイ ンジアセタートを添加する。３７℃で５〜１０分保温すると化学反応が起こる。

生成した懸濁液に１０秒間超音波を加える。次に得られた懸濁液を、連続的に流 れを分析するために、体積を０．２〜２−に変化させながら直接通過させる。発 蛍光化させた１０〜！、０００．０００の微生物を１の精度で有意に計数するこ とができる（第３．４および５図）。

第３．４および５図は、ヨーグルト中で培養された酵母の集団のヒストグラムを 示す。

ヒストグラムの横軸は光度を示す蛍光チャネルを示し、縦軸は、！チャネル当た りの細胞の数を示す。

第３図の場合はサツカロミセス（Ｓａｃｅｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）属の酵母が含 まれており、第４図の場合はロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属の酵母が 含まれ、第５図の場合はデバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏ＋ｍｙｃ ｅｓ　ｈａｎｓｅｎｉｉ）属のものが含まれている。

１例２：果物ヨーグルト全ＳＳ−する酵母の試験試料が果物ヨーグルトの場合は 、試料を可溶化するために酵素を添加する。

可溶化するために、染料および／または抗体を添加する前にペクチナーゼを加え ること以外は実施例１と同様にして試料を処理する。前記ヨーグルト試料を、前 記酵素の存在下で３７℃で５分間保温して酵素反応を起こさせる。

第６図（ナチュラルヨーグルト）および第７図（果物ヨーグルト）は、この発明 の方法を、通常のベトリ皿培養法と比較した結果を示す。

これらの図においては、横軸はこの発明の方法によって得られた結果［１ｏｇ（ パルス／ａ１２）］を示し、縦軸は通常の方法によって得られた結果［ｌｏｇ（ 酵母数／ｍ（り１を示す。両者の方法には非常に良好な相関関係が認められる。

実施例３：ビール中の細菌、または組合わせた微生物の醗酵を行う培地（例えば 医薬生産用の培地）中の細菌の試験一般に、５０ｍ１２の細胞の懸濁液が遠心分 離される。沈降物を実施例工と同様にして再度懸濁液にする。その後の工程は同 様であるが、しかしパイアビリティ染料もしくは抗体力（特異的な問題に適合し ている。しかしパイアビリティ染料は緑色の蛍光を発するので、抗体は赤色光を 発光する発光色素例えばフイコエリトリンによって標識をつける。この場合、２ 重に標識を付けた微生物の計数を実施することができる。このようにして、微生 物の識別と、同時に微生物のパイアビリティ（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）とバイタリ ティ（ｖｉｔａｌｉｔｙ）を測定を行うことができる。

第８図は、自然に汚染されたビールの試料中に検出された。

ＬａｃＬｏｂａｅｉｌｌｕｓ　（ラクトパンラス）＠の細菌の集団のヒストグラ ムを示す。横軸は蛍光チャネルを示し、縦軸はｌチャネル当たりの粒子数を示す 。最も強く蛍光を発する粒子は非常に活性の高い代謝を示す粒子である。

実施例４：製品（例えばトマトペースト、マヨネーズ、ペアルネーズソースなど ）中の細菌および／または酵母の試験これらの製品を水で抽出した後、得られた 懸濁液を、例えば１５μｍフィルターで粗く濾過する。濾過生成物を、前記実施 例１に示すように遠心分離する。得られた沈降物は、同様に、例えば、緑の蛍光 を発する２つのパイアビリティ染料と、異なる波長の赤の蛍光を発する２つのモ ノクローナル抗体とを混合して用いることができる。装置は３つのパラメーター の測定器を備えており、所定の種の生きた酵母、同じ種の死んだ酵母、所定の種 の生きた細菌、同じ種の死んだ細菌、他の種の生きた酵母の合計および他の種の 生きた細菌の合計を同時に、識別し１つの精度の正確さで計数することができる 。

第９図はペアルネーズソースを汚染するカンジダ・７くラブシロラス（Ｃａｎｄ ｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）の集団のヒストグラムを示す。

横軸は蛍光チャネルを示し、縦軸は１チヤネル当たりの微生物の数を示す。

実施例５：未処理牛乳中の全細菌の試験未処理牛乳を、カゼインミセルを破壊す る処理をし、次いで遠心分離する。沈降物を実施例１に記載したのと同ｅ【こし て緩衝液中に取り、ざらにトウィーン２０のような適切な界面活性剤の数滴を添 加する。その後の工程は同様である。（１ず４１１こしろ牛乳の体細胞は染色さ れる。次いで粒子の蛍光と粒径の測定と計数がインピーダンスの測定によって同 時に行われる。これによって、細菌（粒径が１μｍより小さい）と体細胞（粒径 が約１０μｍ以上）とを識別できる。

割１ｕユ１生（すＪ」貝然虹υ件」旦先側県回準崖見閑の試験 髄膜炎の早期検出は、脳を髄液を遠心分離し、沈降物を、市販されている特異的 モノクローナル抗体で染色して、直接行うことができる。特異的微生物の培養は もはや不要であり、装置の感度は満足すべきものである。細菌の代謝状態を確力 １めるために、ポジティブバイアビリティ染料が同時に用Ｌ１られる。同様に、 例えば尿中の細菌（ｂａｃｅｒｉｅｍｉｅ）もしくは寄生物質を試験することが できる。

第１Ｏ図は尿の試料中の腸球菌の検出と計数を示す。

実施例７：ビール醗酵物（ｂｒａｓｓｉｎ）中の酵母の迅速計数ビール醗酵物を 構成する酵母の懸濁液を９９／Ｑ　ＮａＣ１で希釈して、細胞密度をｓ、ｏｏｏ 〜５０．０００／＋ｎ１２の軸回にする。適切なパイアビリティ染料の溶液を１ ％の濃度で添加する。４５℃で５分間保温して酵母を染色する。その結果、この 発明の装置によって精度が１の正確さで、１分未満の時間で計数することができ る。

実施例８　パン種中の酵母の迅速計数 実施例７の記載したのと同様にして実施した。

実施例９　カビの胞子の発芽の試験と発芽した胞子の迅速計数チーズ産業に対し て、有用なカビは、一般に凍結乾燥されて供給される。その発芽と、発芽する次 期は、胞子をその支壁を膨張させるのに好ましい発芽緩衝液、特にリン酸塩で緩 衝され、グルコース、シリ糖、フルクトースなどのようなエネルギー発生物質ま たは時には栄養培地を添加した食塩溶液中に入れることによって測定することが できる。

４〜６時間保温後、胞子の支壁が膨張して、パイアビリティ染料が浸透可能にな り、次いでこの染料を実施例７と同様に利用する。

この発明の装置で試料を分析することによって、適当に希釈してから約１分間以 内に、発芽した胞子の百分率と、胞子の全数を測定することができる。

実施例１０　　酵母集団の培養状態と培養によってもたらされる醗酵状態の監視 酵母の集団を、ビールのウワート（ｓｏｒｔ）中に、１０＠細胞数／ＭＱの濃度 で接種する。酵母を特異的に染色するパイアビリティ染料の溶液を１％の濃度で 添加する。４５℃で５分間保温して酵母を染色し、その結果、この発明の装置に よって計数可能になる。この場合、一方では生きた細胞の数が減少し、他方では 酵母集団の平均の代謝活性（ヒストグラムの蛍光の平均強度）が増大するのを測 定することができる。すなわち、細胞の敗は増大しなくても（通常の方法で得ら れた図）、該集団の全活性が増大する（醗酵の成功）（第１１図）。

第１１図は、ビールのウワート中の酵母［サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）の集団の１０−１２℃にお けるパイアビリティとバイタリティの経時的変化を示す。

第１１＆図は、細胞数の経時的変化を示す曲線である。サンプリングと計数は、 時間ゼロ（第１１ｂ図）、２０時間後（第１１ｃ図）、６０時間後（第１１ｄ図 ）および１６０時間後（第１１ｅ図）に行う。細胞の数は、時間の経過とともに 減少することが分かる。なおヒストグラムは右方向に移動する。このことは存在 する細胞のバイタリティが成長していることを示す。

実施例１１　ビールのウワート中で増殖している酵母集団に対する熱処理の影響 酵母の集団に、６０℃で５分間熱シヨツクを与える（第１２図）、第１２図の横 軸には、サツカロミセス・セレビシェの各種菌株（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ）と２種類の ビールウワード（１と■）が含まれ、縦軸は細胞濃度／村を示す。

該集団を熱処、理の前後で分析する。すなわち、この発明の方法で測定した、処 理前の結果はカラムｌに、処理後の結果はカラム２（１５分間で応答）に示し： メチレンブルー法で測定した、処理前の結果はカラム３に、処理後の結果はカラ ム４（約３０分間で応答）に示し：ペトリ皿での培養法による結果はカラム５（ ３日間で応答）にそれぞれ示す。この発明の方法とメチレンプルブルー法との一 致は、熱処理前については満足すべきものであるが、処理後の場合は、ベトリ皿 での培養法と比較して一致していない。この結果はかなり短期間に得られる。

細菌と酵母のそれぞれに特異的なパイアビリティ染料を、果肉オレンジジュース ｌ０ｙ１２の遠心分離によって得られた沈降物に同時に添加する。

４０℃で１０分間保温した後、試料をこの発明のサイトメーターを通過させる。

第１３図は分析結果を示し、その左方のピークは細菌の集団を示し、右側のピー クは酵母の集団を示す。

この装置は各ピークの細胞の全数を測定することができる（第１４図）。

実施例１３　化粧品の細菌汚染の試験 処理と染色は、先に記載したのと同様に実施する。第１４図は、汚染された製品 で得られた結果を示す。一方製品が汚染されていない場合、蛍光信号が全くなく 、すなわち負の結果が得られた。

以上述べたように、この発明はより明確に記載したその実施法、態様および応用 法に限定するものではなく、当該技術分野の熟練者が考えることができるこの発 明のすべての変形は、この発明の範囲から逸脱することなく、この発明に含まれ る。

ロロローロロ 国際調査報告 ”’ＰＣＴ／ｒＲ８９１０００９６ 国際ｐＪ８査報告 ＦＲεＳ０００９６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．液体、半液体、ゲル、ペースト、固体などの状態の媒体、特に食料製品、健 康食品または生体液を、最初にポジティブパイアビリティ染料に接触させて、こ れら製品または液体中に存在する生きた微生物のみに選択的に標識をつけて、こ れら媒体中に通常存在しているか、または汚標染物として含有されている可能性 のある微生物を試験するための定性分析および／または定量分析する方法があっ て； 前記ポジティブバイアビリティ染料による微生物への標識付けを、前記パイアビ リティ染料単独か、または他のバイアビリティ染料、生体染料、発蛍光化された 抗体および発蛍光化された核酸プローブからなる群から選択された他の物質との 混合物′を用いて行い、次いで、フローサイトメータもしくは画像分析機のよう な適切な手段を用いて、１の精度で計数するとともに、標識をつけた各微生物の 代謝状態を測定することを特徴とする方法。
2. ２．抗体が、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル、モノスペシフィッ クまたはポリスペシフィックの、抗酵母抗体および／または抗細菌抗体および／ または抗カビ抗体および／または抗寄生生物抗体および／または抗ウイルス抗体 ；ならびにポリクローナルおよび／またはモノクローナル、モノジネリックまた はポリジネリックの、抗酵母抗体および／または抗細菌抗体および／または抗カ ビ抗体および／または抗寄生生物抗体および／または抗ウイルス抗体から選択さ れることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. ３．用いる抗体が適当な蛍光色素によって発蛍光化されることを特徴とする請求 項２記載の方法。
4. ４．標識をつける前に、被検試料を生物学的、化学的もしくは物理的処理に付し て、徴生物を、該微生物がポジティブバイアビリティ染料を摂取するのを促進す ることができる最適の代謝状態にすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか １つに記載の方法。
5. ５．標識をつける前の処理が、媒体のｐＨを調節する緩衝液の作用からなること を特徴とする請求項４記載の方法。
6. ６．ｐＨを調節する緩衝液が同様に可溶化媒体として用いられることを特徴とす る請求項４または５に記載の方法。
7. ７．標識をつける前の処理が超音波の作用からなることを特徴とする請求項４記 載の方法。
8. ８．標識をつける前の処理が適当な酵素の作用からなることを特徴とする請求項 ４記載の方法。
9. ９．被検試料が特に遠心分離もしくは濾過によって相分離に付されることを特徴 とする請求項４〜８のいずれかｌつに記載の方法。
10. １０．ポジティブパイアビリティ染料がフルオレセインジアセタート（ＦＤＡ） の場合、ＦＤＡが生きた酵母に排他的に標識をつけることを特徴とする請求項４ 〜９のいずれか１つに記載の方法。
11. １１．ポジティブバイアビリティ染料がカルボキシフルオレセインジアセタート （ＣＦＤＡ）の場合、ＣＦＤＡが生きた細菌に排他的に標識をつけることを特徴 とする請求項４〜９のいずれか１つに記載の方法。
12. １２．被検製品もしくは被検流体の試料３０が通過する流れ測定室２１を備えた 測定セル２０と、微生物が発する蛍光信号を記録する装置４０．５０とを備えた フローサイトメータからなり、該測定セル２０が該測定室を洗浄する装置を備え 、この洗浄装置が試料キャリヤーから試料を除去する場合かまたは適当な外部の 電子指令によって作動することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１つに記 載の方法を実施するための装置。
13. １３．前記洗浄装置が、少なくとも２台の吸引ポンプと送液ポンプ３６．３７か らなり、各々いずれか一方または両方が機能し、被検試料を提供する場合には、 一方が測定セルに被検試料を送り、他方が測定セルに被覆試料を送り、また試料 を試料キャリヤーから除去する場合には、一方のポンプを停止し他方を作動させ て洗浄を行うことを特徴とする請求項１２の装置。