CN109423508B - 一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法 - Google Patents

一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法，该方法包括以下步骤：S1.将待测果蔬汁进行膜过滤，得到过滤后的果蔬汁；S2.将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理并用低渗液进行低渗溶胀处理，得到低渗溶胀处理后的果蔬汁，所述酶为纤维素酶和/或果胶酶；S3.将低渗溶胀处理后的果蔬汁进行离心并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液；S4.使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的自发荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。该方法适用于各种果蔬汁样品，能检测果蔬汁中的各种细菌，包括各种致病菌、非致病菌和乳酸菌等。

Description

一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法
技术领域
本公开涉及食品卫生领域，具体地，涉及一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法。
背景技术
总菌浓度是食品工业卫生和质量的重要指标，其值的大小跟食品的生产卫生状况、上架时间和储存条件等因素有关。总菌浓度越大暗示着食品中病原菌存在的机会越大、食品的营养流失越大及食品的保质期越短。因此，各个国家地区都把总细菌浓度作为制定各种食品卫生标准的依据。
平板培养计数法是传统的检测食品中细菌的方法。以国标GB 4789.2-2010为例，采用平板计数法检测总菌时，需要在37℃中培养48±2 h，每个样品进行多个梯度稀释，并且需要大量的操作，因此使用该方法操作繁琐，耗时长，不利于大量样品的同时检测。此外，该方法只能检测能被培养的细菌，而一些生长缓慢的细菌以及那些存活但不可培养的细菌（VBNC）却无法被检测到。
近年，大量文献报道了采用各种手段检测食品中的细菌的方法。这些方法的局限性在于：1）具有特异性，但不具有广谱性，只能检测一种或特定几种细菌，例如PCR和ELISA；2）具有广谱性，但不能对实际样品中的总菌进行精确定量检测，例如超声波检测、ATP生物发光检测和二氧化碳检测。目前这些方法主要采用的是间接的多细胞分析方法：即把细菌群体看作是一群可以进行信号转换的分子，通过信号转换（比如酶催化底物显色）来间接反映样品中的细菌含量。由于不同种细菌或同种细菌在不同的生理条件下的代谢水平、酶含量和酶活等信号都有很大区别且基于多细胞的分析方法需要借助某种模式菌的标准曲线来实现定量检测，采用这些方法检测实际样品时往往不准确（例如，以菌种A做细菌浓度标准曲线，而实际样品中却没有细菌A而是由细菌B、Ｃ和D等组成，导致检测值和实际值相差非常大）。
流式细胞检测技术（FCM）是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行单颗粒水平快速定量检测分析和分选的技术。其基本原理是：通过流体聚焦使待测颗粒呈单行排列，依次通过FCM 的检测区域。FCM能够通过对食品颗粒和细菌颗粒的逐一分析获得颗粒散射和荧光信号的散点图和各参数的统计直方图，不受限于食品颗粒微弱荧光信号的影响。特别需要指出的是，采用FCM对细菌进行检测计数不受细菌荧光强度差异的影响，不需要绘制标准曲线，能实现无标样精确定量检测，适用于真实样品的检测
目前采用FCM检测食品或环境样本中的细菌主要是基于细菌基因组核酸的荧光染色方法。例如，采用核酸染料对样本进行染色，细菌染上荧光，背景颗粒由于缺少核酸而不被着色；通过散射和荧光信号的同时检测区分细菌颗粒和背景颗粒。但是该方法对于检测像果蔬汁这样具有复杂成分的食品却显得无能为力。这是因为果蔬汁中的果肉颗粒(由植物组织、植物细胞和细胞碎片组成)往往带有核酸分子，通过核酸染色的方法并不能将果肉颗粒与细菌区分。此外，由于食品中可能存在会吸附、猝灭荧光染料的化学成分，基于使用荧光分子标记的检测方法不仅增加了实验的复杂性，且实验结果存在一定的不可预见性。
细菌自身带有多种具有不同激发波长和发射波长的荧光分子，这些荧光分子主要由含芳香氨基酸的蛋白质及一些代谢辅酶组成。尽管无需标记的自发荧光分析在食品的细菌检测中具有很好的应用前景，但其实际发展却遇到了很大的阻碍。这些障碍主要体现在以下两方面：1）以细菌中的蛋白质(荧光发射波长200-400 nm)作为天然的自发荧光分子标记容易受到食品中蛋白质的干扰；2）虽然以代谢相关的小分子辅酶（例如flavins、NADH，荧光发射波长400-600 nm）作为自发荧光分子标记可以在一定程度上排除食品中非生命物质的干扰，但是这些辅酶的丰度很低，因此对应的荧光信号很弱。此外，果蔬汁溶液中的荧光背景比较高且存在颗粒浓度高和粒径分布广的果肉颗粒，这些因素干扰了果蔬汁中细菌的检测。目前缺少有效的方法使果蔬汁中的背景荧光信号与细菌的自发荧光信号得以区分。
发明内容
本公开的目的是提供一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法，该方法适用于各种果蔬汁样品，能检测果蔬汁中的各种细菌，包括各种致病菌、非致病菌和乳酸菌等。
为了实现上述目的，本公开提供对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法，该方法包括以下步骤：
S1. 将待测果蔬汁进行膜过滤，得到过滤后的果蔬汁，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5-10 μm；
S2. 将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理并用低渗液进行低渗溶胀处理，得到低渗溶胀处理后的果蔬汁，所述酶为纤维素酶和/或果胶酶，所述低渗液的摩尔浓度为0.1mmol/L以下；
S3. 将低渗溶胀处理后的果蔬汁进行离心并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液，所述离心的速度为500-10000 rpm；
S4. 使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的自发荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。
可选地，步骤S4中，使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的400-600 nm的荧光和散射光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光和散射光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。
可选地，以1 mL的所述过滤后的果蔬汁为基准，所述纤维素酶的用量为1-1000IU。
可选地，以1 mL的所述过滤后的果蔬汁为基准，所述果胶酶的用量为1-1000 IU。
可选地，所述过滤后的果蔬汁与所述低渗液的体积比为1：（10-1000）。
可选地，所述低渗液为纯水。
可选地，所述悬浮介质为纯水。
可选地，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：
a．使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b．向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；
c．将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由接受测量光照射的探测区发出的光信号；
d．将通过透镜系统收集得到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e．根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
可选地，所述探测区的体积为1-5000 fL，优选为50-500 fL；所述样品液流的直径为0.1-20 μm，优选为1-5 μm；所述样品液流的流量为1-500 nL/min，优选为1-100 nL/min；所述鞘液的流速为1-100 cm/sec，优选为1-10 cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1-150倍，优选为2-50倍。
可选地，所述果蔬汁为选自苹果汁、橙汁、柚子汁、芭乐汁、葡萄汁、芒果汁、哈密瓜汁、柠檬汁、番茄汁、胡萝卜汁、菠菜汁、莲藕汁和黄瓜汁中的至少一种；所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和李斯特菌中的至少一种。通过上述技术方案，本公开首先对待测果蔬汁样品进行膜过滤、酶处理和低渗溶胀等预处理，以去除待测果蔬汁中的果肉大颗粒同时降低样品的荧光信号背景，然后利用细菌自发荧光的特性，使用超高灵敏流式细胞术检测微弱的细菌荧光信号从而对果蔬汁中的细菌进行识别，无需对样品进行染色，排除由荧光染色对检测造成的干扰，能够进行无标样精确定量检测。本公开提供的方法适用于各种果蔬汁样品，能检测果蔬汁中的各种细菌，包括各种致病菌、非致病菌和乳酸菌等。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本公开提供的对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法的流程示意图，其中，(a)为未经任何处理的果蔬汁样品，(b)为将(a)进行膜过滤后的果蔬汁样品，(c)为将(b)进行离心洗涤后的果蔬汁样品，(d)为将(c)弃上清液后的果蔬汁样品，(e)为将(d)进行酶处理并用低渗液进行低渗溶胀后的果蔬汁样品，(f)为将(e)离心洗涤并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到的检测上样悬浮液，(g)为采用超高灵敏流式细胞术对(e)的检测上样悬浮液检测后得到的荧光和散射二维散点图结果；
图2是本公开使用的超高灵敏流式细胞术中的光路示意图；
图3是实施例1中对实验室制备橙汁和实验室培养细菌的检测结果，a为实验室制备橙汁经膜过滤后的检测结果，b为实验室制备橙汁经膜过滤和离心洗涤取沉淀重悬后对悬浮液的检测结果，c为实验室制备橙汁经膜过滤、酶处理和离心洗涤取沉淀重悬后对悬浮液的检测结果，d为实验室培养细菌经酶处理和离心洗涤取沉淀重悬后对悬浮液的检测结果；
图4是实施例2对掺入实验室培养细菌的实验室制备果蔬汁的检测结果，a为采用本公开的方法的检测结果，b为传统平板培养法的检测结果，c为本公开的方法与传统平板培养法所得检测结果的线性关系；
图5是实施例3中对掺入实验室培养细菌的实验室制备果蔬汁的检测结果，A-D分别为掺入大肠杆菌ER2738、大肠杆菌HB101、大肠杆菌K12和大肠杆菌O157的橙汁样品的检测结果；E-H分别为掺入铜绿假单胞菌、沙门氏菌、溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌的橙汁样品的检测结果；I-L分别为掺入嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌和酸土脂环酸芽孢杆菌的橙汁样品的检测结果；
图6是实施例4和实施例5中对实际果蔬汁样品的细菌定量检测结果，a为市售鲜榨苹果汁（实施例4）的检测结果，b为市售鲜榨橙汁（实施例5）的检测结果，图中右下象限代表细菌颗粒；
图3a1-d1是样品的散射信号图，图中，横坐标代表时间，纵坐标代表散射光信号强度；图3a2-d2是样品的荧光信号图，图中，横坐标代表时间，纵坐标代表荧光信号强度；
图3a3-d3、图4a、图5和图6为样品的侧向散射信号与荧光信号的双变量散点图，图中，横坐标代表荧光信号，纵坐标代表散射光信号，深色区域代表果蔬汁中食品颗粒，浅色区域或图中右下象限代表细菌颗粒。
附图标记说明
1 激光器 2 半波片
3 偏振分束器 4 镜子
5 消色差双透镜 6 流通池
7 物镜 8 二向色滤光片
9 第一光电倍增管 10 边缘滤波器
11 带通滤波器 12 第二光电倍增管
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法，图1是本公开提供的对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法的流程示意图。该方法包括以下步骤：
S1. 将待测果蔬汁进行膜过滤，得到过滤后的果蔬汁，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5-10 μm；
S2. 将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理并用低渗液进行低渗溶胀处理，得到低渗溶胀处理后的果蔬汁，所述酶为纤维素酶和/或果胶酶，所述低渗液的摩尔浓度为0.1mmol/L以下；
S3. 将低渗溶胀处理后的果蔬汁进行离心并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液，所述离心的速度为500-10000 rpm；
S4. 使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的自发荧光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。
根据本公开，待测果蔬汁溶液中的荧光背景比较高且存在颗粒浓度高和粒径分布广的颗粒成分，这些因素干扰了超高灵敏流式细胞术对果蔬汁中细菌的检测。步骤S1中，将待测果蔬汁样品进行膜过滤可以去除果蔬汁中的果肉团大颗粒物质，过滤后的果蔬汁中的颗粒主要由高浓度的细胞碎片颗粒组成，其中有少量完整的植物细胞颗粒，颗粒和溶液中均存在由植物细胞内含物组成的荧光分子或团簇，因此膜过滤后的果蔬汁样品的荧光信号背景仍然较高。
为了降低所述过滤后的果蔬汁样品的荧光信号背景，可以在步骤S1后，对所述过滤后的果蔬汁进行离心洗涤，以将所述过滤后的果蔬汁样品颗粒中裹挟的荧光分子释放到溶液中并和溶液中的荧光分子一起被洗去，从而使其荧光背景明显降低，然后再进行步骤S2的操作。所述离心洗涤包括：将所述过滤后的果蔬汁样品进行离心并去除上清，并将所得沉淀用10-1000倍体积的纯水悬浮，所述离心的速度为500-10000 rpm，离心的时间可以为1-30 min。经过离心洗涤后，仍有一小部分植物细胞颗粒保留了较大量的荧光分子。
由于植物细胞碎片颗粒的支架主要是纤维素和果胶物质，步骤S2中，将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理可以降解果蔬汁中的植物细胞及植物细胞碎片颗粒中的细胞壁成分，使果蔬汁样品中的植物细胞碎片颗粒浓度降低。
由于植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶类物质，步骤S2中，将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理降解果蔬汁中的植物细胞及植物细胞碎片颗粒中的细胞壁成分，并用低渗液进行低渗溶胀处理使果蔬汁中的植物细胞破碎从而释放细胞内含物，而细菌具有致密的不含纤维素和果胶的细胞壁，因此不受酶处理和低渗溶胀处理的影响，保持着原有的荧光信号。所述酶处理中，以1 mL的所述过滤后的果蔬汁为基准，所述纤维素酶的用量可以为1-1000 IU，所述果胶酶的用量可以为1-1000 IU，优选地，以1 mL的所述过滤后的果蔬汁为基准，所述纤维素酶的用量为10-500 IU且所述果胶酶的用量为10-500 IU。所述低渗溶胀处理中，所述过滤后的果蔬汁与所述低渗液的体积比可以为1：（10-1000），所述低渗液优选为纯水。步骤S3中，将低渗溶胀处理后的果蔬汁进行离心并去除上清，可以去除植物细胞破碎后释放的荧光分子，从而进一步降低样品的荧光信号背景。所述离心的时间可以为1-30min。然后将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液，所述悬浮介质优选为纯水。
根据本公开，果蔬汁中的颗粒具有散射信号，且颗粒越大散射信号越高，为了进一步使果蔬汁中的细菌颗粒和果蔬汁颗粒被明确分辨，该方法还可以包括：步骤S4中，使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的400-600 nm的自发荧光和散射光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光和散射光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。通过对所述检测上样悬浮液中颗粒的400-600 nm的自发荧光和散射光同时进行检测，可以更准确的判断细菌颗粒，从而提高检测结果的准确性。
根据本公开，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：
a．使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b．向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.01-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；
c．将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由探测区发出的光信号；
d．将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e．根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
其中，所述鞘液可以为流式细胞术中常规使用的各种鞘液，例如为水、生理盐水和磷酸盐缓冲液中的至少一种，优选使用水作为鞘液，更优选用作鞘液的水为去离子水。所述流体动力学聚焦具有流式细胞术中常规的定义，具体是指所述鞘液包绕着样品液体流动，样品液体在所述鞘液的作用下形成液流，即样品液流。可以通过流式细胞术领域常规的调节方法，调节所述细菌在所述检测上样悬浮液中的浓度，使得所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动。
其中，为了进一步提高所述超高灵敏流式细胞术的检测灵敏度和精确度，所述探测区的体积为1-5000 fL，优选为50-500 fL；所述样品液流的直径为0.1-20 μm，优选为1-5μm；所述样品液流的流量为1-500 nL/min，优选为1-100 nL/min；所述鞘液的流速为1-100cm/sec，优选为1-10 cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1-150倍，优选为2-50倍。
其中，在获得所述电信号后，根据所述电信号对所述细菌进行定量分析的方法可以为常规的方法，例如将空白样品和/或标准样品（包括内标和外标）与待测样品的电信号进行比较。
根据本公开的方法，其中，所述上样悬浮液中颗粒的400-600 nm的自发荧光基本上是由待测果蔬汁中的细菌颗粒所带来的。因此，所述上样悬浮液中单个细菌颗粒的400-600 nm的自发荧光所转换得到的电信号明显高于单个果蔬汁颗粒的400-600 nm的自发荧光所转换得到的电信号，由此可以根据所述上样悬浮液中单颗粒的400-600 nm的自发荧光所转换得到的电信号强度对待测果蔬汁中的颗粒进行定性检测；通过对检测到的细菌颗粒进行计数可获得待测果蔬汁中的细菌浓度。
本公开使用的超高灵敏流式细胞术能够通过对食品颗粒和细菌颗粒的逐一分析获得颗粒散射和荧光信号的散点图和各参数的统计直方图，不受限于食品颗粒微弱荧光信号的影响。特别需要指出的是，采用流式细胞术对细菌进行检测计数不受细菌荧光强度差异的影响，不需要绘制标准曲线，能实现无标样精确定量检测，适用于真实样品的检测。
本公开提供的方法适用于检测各种果蔬汁样品，例如，所述果蔬汁可以包括但不限于苹果汁、橙汁、柚子汁、芭乐汁、葡萄汁、芒果汁、哈密瓜汁、柠檬汁、番茄汁、胡萝卜汁、菠菜汁、莲藕汁和黄瓜汁等。本公开提供的方法能够检测果蔬汁的各种细菌，包括各种致病菌、非致病菌和乳酸菌等，例如，所述细菌可以包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和李斯特菌中的至少一种。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
以下实施例中，对果蔬汁样品的检测方法为：参考图2所示的光路系统，用压力为150 kPa的氮气将待测的样品液体压入密闭的样品管，调节氮气的压力，使得样品液流的流量为5 nL/min。其中，所述样品管为内径为40 μm外径为240 μm的石英毛细管，毛细管末端被处理成约12度的锥形喷嘴。所述样品管轴向平行自上而下地插入鞘液室，所述鞘液室为由石英玻璃形成的截面为250 μm×250 μm且轴向长度为20 mm的长方体腔体，所述样品管的末端位于所述鞘液室轴向且距离上端8 mm处的位置。所述鞘液室中自上而下流动着流速为5 cm/sec的鞘液。所述样品管的末端以上的样品液流的截面的半径大约为1 μm。波长为488 nm的激光经Thorlabs公司的型号为AC050-010-A1的消色差双合透镜，聚焦成束腰直径为10 μm的激光光束。探测区的体积为0.8 pL，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.8毫秒。
由激光器1（购自Newport Corp., Irvine, CA型号488）发出的488 nm的激光经半波片2、偏振分束器3、镜子4、消色差双透镜5后照射至位于流通池6的样品管内，果蔬汁样品由激光照射后发出光信号，物镜7（购自Thorlabs，型号40×，NA=0.68）收集，被二向色滤光片8（购自Semrock Inc., Rochester, NY，型号DicF-500）分成两束，波长小于500 nm的光信号（散射光）被90°反射入第一光电倍增管9（购自Hamamatsu, Japan，型号R928）中检测，大于500 nm的光信号经过边缘滤波器10（购自Semrock，型号LP03-488RS）后，经过带通滤波器（购自Semrock，型号BP520/35）滤除杂散光进入第二光电倍增管12（购自Hamamatsu,Japan，型号R928）检测（该通道检测的荧光信号为细菌的自发荧光信号）。
实施例1
本实施例用于说明使用超高灵敏流式细胞术对实验室制备的果蔬汁和实验室培养细菌的检测。
本实施例采用的实验室制备橙汁的制备方法为：把一颗橙子在桌子上拍软；先用自来水清洗橙子表面，再用超纯水清洗橙子表面，然后用医用酒精消毒橙子表面；在超净工作台中用镊子在橙子表面开一个直径约0.5 cm的口，最后把橙汁挤到50 mL的无菌试管里。采用上述方法制备的橙汁不含细菌。
本实施例采用的实验室培养细菌为大肠杆菌ER2738，其培养方法为：把细菌接种于2 mL 液体培养基中培养至OD值等于1.5左右。取培养好的菌悬液1 mL，离心后用PBS重悬，调节OD值为0.25（3×108 cfu/mL）左右。
将10 mL上述实验室制备橙汁采用5 μm微孔膜进行膜过滤，使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对0.1 mL上述经膜过滤的实验室制备橙汁中颗粒的自发荧光（FB520/35, Semorock）和散射光进行检测，检测结果见图3a(1-3)所示。可见，仅仅经过膜处理的橙汁含有很高浓度的植物细胞碎片颗粒。在果汁压榨时，植物细胞中来源于维生素、辅酶等的荧光分子会释放到果汁溶液中及囊裹在植物细胞碎片中或吸附在植物细胞碎片的表面，因此从图中我们可以看到：这些细胞碎片不仅有散射信号（图3a1），还有荧光信号(图3a2)，样品的荧光背景也比较高（图3a2右上角）。
将10 mL上述实验室制备橙汁采用5 μm微孔膜进行膜过滤，并取其中0.1 mL进行离心洗涤，离心的速度为1000 rpm，离心的时间为1 min以上，使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对所得检测上样悬浮液中颗粒的自发荧光（FB520/35）和散射光进行检测，检测结果如图3b(1-3)所示。可见，离心洗涤后，橙汁颗粒中或橙汁颗粒表面吸附的荧光分子释放到溶液中并和溶液中的荧光分子一起被洗去，荧光背景明显降低（图3b2右上角），但是仍然有少量散射和荧光都很强的植物细胞颗粒滞留（图3b3右上象限）。
将10 mL上述实验室制备橙汁采用5 μm微孔膜进行膜过滤，并取其中0.1 mL进行离心洗涤，离心的速度为1000 rpm，离心的时间为1 min以上，然后采用纤维素酶（购自索莱宝）和果胶酶（购自索莱宝）对过滤后的橙汁进行酶处理，以1 mL的过滤后的橙汁为基准，纤维素酶的用量为10 IU，果胶酶的用量为10 IU，并用10倍体积的纯水进行低渗溶胀处理，将低渗溶胀处理后的橙汁在5000 rpm下离心5 min并去除上清，将离心所得沉淀用纯水悬浮，得到检测上样悬浮液。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对其进行自发荧光（FB520/35）和散射光检测。检测结果如图3c(1-3)所示。可见，酶处理可以降解植物的细胞壁，低渗溶胀处理可以使细胞壁缺失的植物细胞吸水胀破，进而使破碎的植物细胞释放其内含物包括一些荧光分子，并经过离心去除植物细胞破碎后释放的荧光分子，所制的检测上样悬浮液中具有荧光信号的颗粒大幅度下降。
取制备好的大肠杆菌ER2738悬浮液1 mL，采用纤维素酶（购自索莱宝）和果胶酶（购自索莱宝）进行酶处理，纤维素酶的用量为10 IU，果胶酶的用量为10 IU，并用10倍体积的纯水进行低渗溶胀处理，然后在5000 rpm下离心5 min并去除上清，将离心所得沉淀用纯水悬浮，得到检测上样悬浮液。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对其进行自发荧光（FB520/35）和散射光检测。检测结果如图3d(1-3)所示。
由于细菌具有致密的不含纤维素和果胶的细胞壁，因此不受酶处理和洗涤的影响，保持着原有的自发荧光信号（图3d3中右下象限）；而果蔬汁中能够干扰细菌检测的植物细胞碎片以及完整的植物细胞颗粒在酶消化和低渗溶胀处理中已经得到了去除。因此，采用本公开提供的方法制得的上样悬浮液能够排除植物细胞碎片和植物细胞颗粒的干扰而用于细菌浓度的计数。
实施例2
本实施例用于说明本公开提供的方法对实验室制备的果蔬汁和实验室培养细菌的检测与传统平板培养法的检测结果的对比。
实验室制备橙汁的方法与实施例1一致。采用与实施例1一致的细菌培养方法培养大肠杆菌ER2738。
取制备好的大肠杆菌ER2738悬浮液1 mL离心，弃上清液后分别加入1 mL实验室制备的无菌橙汁，得到橙汁样品，该样品中的大肠杆菌ER2738数量为3×107 cfu/mL左右。将橙汁样品采用5 μm微孔膜进行膜过滤，并取其中0.1 mL进行离心洗涤，离心的速度为1000rpm，离心的时间为1 min以上，然后采用纤维素酶（购自索莱宝）和果胶酶（购自索莱宝）对过滤后的橙汁进行酶处理，以1 mL的过滤后的橙汁为基准，纤维素酶的用量为10 IU，果胶酶的用量为10 IU，并用10倍体积的纯水进行低渗溶胀处理，将低渗溶胀处理后的橙汁在5000 rpm下离心5 min并去除上清，将离心所得沉淀用纯水悬浮，得到检测上样悬浮液。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对上述实验室制备橙汁上中颗粒的自发荧光（FB520/35）和散射光进行检测，检测结果如图4a所示。检测得到本实施例的橙汁样品中的大肠杆菌ER2738的数量为2.7±0.1×107 cells/mL。
取同样的掺入大肠杆菌的橙汁样品，按照文献“Campbell G A, Uknalis J, Tu SI, et al. Detect of Escherichia coli O157:H7 in ground beef samples usingpiezoelectric excited millimeter-sized cantilever (PEMC) sensors. Biosensors& Bioelectronics, 2007, 22(7):1296-1302.”中的传统平板培养法培养检测，如图4b所示。采用平板培养法培养检测得到大肠杆菌ER2738的数量为 2.3±0.2×107 cfu/mL。
分别制备大肠杆菌ER2738数量为2.6×108 cfu/mL、2.2×107 cfu/mL、2.8×106cfu/mL、2.7×105 cfu/mL、2.6×104 cfu/mL左右的橙汁样品，分别采用本公开的方法和传统平板培养法对其进行检测，得到的线性关系如图4c所示，横坐标代表传统平板培养法的检测结果，纵坐标代表采用本公开的方法得到的检测结果，可见，二者的计数结果具有很好的线性关系，相关系数R2等于0.9735。
本实施例可以证明，本公开的方法和传统方法的检测结果基本一致。
实施例3
本实施例用于说明本公开提供的方法对实验室制备的果蔬汁和实验室培养细菌的检测。
实验室制备橙汁的方法与实施例1一致。采用与实施例1一致的细菌培养方法培养大肠杆菌ER2738、大肠杆菌HB101、大肠杆菌K12、大肠杆菌O157、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌。培养嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌采用MRS培养基静置培养，其他条件与实施例1一致。酸土脂环酸芽孢杆菌按照文献“Huang X C, Yuan YH, Wang X Y, et al. Application of Electronic Nose in Tandem with ChemometricAnalysis for Detection of Alicyclobacillus acidoterrestris -Spawned Spoilagein Apple Juice Beverage. Food and Bioprocess Technology, 2015, 8 (6): 1295-1304.”中的方法进行培养。
取制备好的不同细菌悬浮液各1 mL离心，弃上清液后分别加入1 mL实验室制备的无菌橙汁，得到本实施例的橙汁样品A-L，样品A-L中的细菌数量分别为3×108 cfu/mL左右。将橙汁样品A-L分别采用5 μm微孔膜进行膜过滤，并取其中0.1 mL进行离心洗涤，离心的速度为1000 rpm，离心的时间为1 min以上，然后采用纤维素酶（购自索莱宝）和果胶酶（购自索莱宝）对过滤后的橙汁进行酶处理，以1 mL的过滤后的橙汁为基准，纤维素酶的用量为10 IU，果胶酶的用量为10 IU，并用10倍体积的纯水进行低渗溶胀处理，将低渗溶胀处理后的橙汁在5000 rpm下离心5 min并去除上清，将离心所得沉淀用纯水悬浮，得到检测上样悬浮液。使用超高灵敏流式细胞术在488 nm激光激发下对上述实验室制备橙汁上中颗粒的自发荧光（FB520/35）和散射光进行检测，检测结果见图5。检测得到本实施例中的橙汁样品A中的大肠杆菌ER2738的数量为2.3×108 cells/mL，橙汁样品B中的大肠杆菌HB101的数量为3.2×108 cells/mL，橙汁样品C中的大肠杆菌K12的数量为2.0×108 cells/mL，橙汁样品D中的大肠杆菌O157的数量为3.7×108 cells/mL，橙汁样品E中的铜绿假单胞菌的数量为2.5×108 cells/mL，橙汁样品F中的沙门氏菌的数量为2.9×108 cells/mL，橙汁样品G中的溶藻弧菌的数量为4.3×108 cells/mL，橙汁样品H中的金黄色葡萄球菌的数量为2.8×108 cells/mL，橙汁样品I中的嗜热链球菌的数量为3.3×108 cells/mL，橙汁样品J中的保加利亚杆菌的数量为2.7×108 cells/mL，橙汁样品K中的干酪乳杆菌的数量为2.0×108cells/mL，橙汁样品L中的酸土脂环酸芽孢杆菌的数量为3.0×108 cells/mL。
本实施例可以证明，采用本公开的方法能够检测果蔬汁中的各种细菌。
实施例4
本实施例用于说明本公开提供的方法对市售果蔬汁的检测。
将10 mL鲜榨果汁店购买的苹果汁采用5 μm微孔膜进行膜过滤，并取其中0.1 mL进行离心洗涤，离心的速度为1000 rpm，离心的时间为1 min以上，然后采用纤维素酶（购自索莱宝）和果胶酶（购自索莱宝）对过滤后的苹果汁进行酶处理，以1 mL的过滤后的苹果汁为基准，纤维素酶的用量为10 IU，果胶酶的用量为10 IU，并用10倍体积的纯水进行低渗溶胀处理，将低渗溶胀处理后的苹果汁在5000 rpm下离心5 min并去除上清，将离心所得沉淀用纯水悬浮，得到检测上样悬浮液。
使用实施例1的超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液进行检测。检测结果见图6a，检测得到本实施例的苹果汁中，总菌数为5.0×104 cells/mL。
实施例5
本实施例用于说明本公开提供的方法对市售果蔬汁的检测。
按照实施例4的方法测定鲜榨果汁店购买的橙汁中的细菌。检测结果见图6b，检测得到本实施例的橙汁中，总菌数为3.1×105 cells/mL。
由实施例1-5可见，本公开的方法能检测果蔬汁中的各种细菌，检测结果精确，适用于真实样品的检测。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (5)

1.一种对果蔬汁中的细菌进行计数检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、将待测果蔬汁进行膜过滤，得到过滤后的果蔬汁，所述膜过滤所采用的过滤膜的孔径为5-10μm；
S2、将所述过滤后的果蔬汁进行酶处理并用低渗液进行低渗溶胀处理，得到低渗溶胀处理后的果蔬汁，所述酶为纤维素酶和果胶酶，所述低渗液为纯水；以1mL的所述过滤后的果蔬汁为基准，所述纤维素酶的用量为10-500IU且所述果胶酶的用量为10-500IU；
S3、将低渗溶胀处理后的果蔬汁进行离心并去除上清，将离心所得沉淀用悬浮介质悬浮，得到检测上样悬浮液，所述离心的速度为500-10000rpm；所述悬浮介质为纯水；
S4、使用超高灵敏流式细胞术对所述检测上样悬浮液中颗粒的400-600nm的自发荧光和散射光进行检测；并且根据所述检测上样悬浮液中颗粒的荧光和散射光所转换得到的电信号计算所述待测果蔬汁中的细菌数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述过滤后的果蔬汁与所述低渗液的体积比为1：10。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述超高灵敏流式细胞术的操作包括：
a、使用鞘液通过流体动力学聚焦将所述检测上样悬浮液压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的细菌，且所述细菌在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；
b、向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个细菌接受测量光照射的时间为0.2-2毫秒；
c、将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜系统收集由探测区发出的光信号；
d、将通过透镜系统收集到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个细菌所发出的光的电信号；
e、根据所述电信号对所述细菌进行定量分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述探测区的体积为50-500fL；所述样品液流的直径为1-5μm；所述样品液流的流量为1-100nL/min；所述鞘液的流速为1-10cm/sec；所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的2-50倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述果蔬汁为选自苹果汁、橙汁、柚子汁、芭乐汁、葡萄汁、芒果汁、哈密瓜汁、柠檬汁、番茄汁、胡萝卜汁、菠菜汁、莲藕汁和黄瓜汁中的至少一种；所述细菌包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌和李斯特菌中的至少一种。
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