CN104126123A - 用于检测乳中的细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测乳中细菌的存在的方法，其中使乳与包含有效量的至少一种类型之抗体的制备物相接触，所述抗体能够特异性地结合待检测的细菌；在所述接触之前或之后，用染色用制备物对所述抗体进行染色，所述染色用制备物选择成使得以其染色的抗体在与所述细菌接触时表现出颜色变化或颜色浓度变化；并且通过所述乳与所述经染色抗体接触所导致的颜色变化的存在和/或相对强度来确定与所述乳中的细菌结合的经染色抗体的浓度。

Description

用于检测乳中的细菌的方法
背景技术
一些细菌在奶牛中导致疾病(尤其是乳腺炎)，该疾病可对牛奶的品质产生不利影响。例如，乳腺炎是奶牛个体的乳房或乳头中的一种感染性疾病，并且这样的奶牛所产的奶中通常存在乳腺炎细菌。许多不同类型的细菌可涉及导致乳腺炎，即，不止存在乳腺炎细菌的一个类型或一个菌株株，而是存在许多。乳腺炎中所涉及的细菌类型一般在不同情况下是不一样的。
因为一般(尤其是在工业规模的乳品操作中)通过混合来自多头奶牛的牛奶来生产乳制品，所以当一些奶牛被感染时，即使大多数产奶的奶牛是健康的，所述乳制品也将含有一定量的不期望的微生物(例如，乳腺炎致病细菌)。然而，对受感染的牛奶中包含的细菌细胞的类型与浓度没有先验的可预测性，这些受感染的牛奶最终被混合入最终收集的牛奶中。
政府通过对牛奶样品的付费控制来控制乳腺炎。在所运送的牛奶中过高的细菌浓度是乳腺炎的指示，这使牛奶生产商仅得到较低的单位运送牛奶量价格。在进行了数次具有高细菌细胞数的运送之后，牛奶的运送甚至可能事实上被禁止。
当发生乳腺炎时，兽医(或牛奶生产商)常常使用抗生素混合物以杀死和/或消除细菌，希望该混合物覆盖实际存在的细菌谱系，而不事先确定确实涉及哪些类型的细菌。在最糟糕的情况下，先后或同时使用错误的抗生素或并不是特别适合于该特定的一种或更多种细菌类型的抗生素。
这样的抗生素滥用正导致越来越多的细菌突变，显示出对抗生素之免疫力的提高。这对公共健康也是危险的情况。
发明概述
本发明的一个重要目的是开发一种改进的用于尤其是在(完全地或至少部分地)自动检测系统中检测乳中的细菌或不同细菌类型的方法。在一些优选实施方案中，本发明允许对细菌或细菌的类型进行选择性和特异性的检测，并且在其中主要是乳腺炎致病细菌。本发明还使得能够在乳中存在多于一种细菌类型的情况下进行这种特异性检测，因为本发明使得能够对数种不同的细菌类型进行并行或同时检测。本发明的方法还使得可以确定导致感染(例如乳腺炎)的一种或更多种细菌类型，从而能够为奶牛选择和施用合适的抗生素。
通过所附权利要求书中限定的主题达到了这些目的以及其他目的。
更特别地，用于检测乳中的细菌的改进方法包括以下步骤：使乳与包含有效量的至少一种类型之抗体的制备物相接触，所述抗体能够特异性地结合待检测的一种或更多种细菌类型；
在所述接触之前或之后，用染色用制备物对所述抗体进行染色，所述染色用制备物选择成使得被其染色的抗体在与所述细菌接触时表现出颜色浓度差和/或颜色变化；以及
通过所述牛奶与所述经染色的抗体接触所导致的颜色的存在和(在一些情况下)相对强度来确定与所述乳中的细菌相结合的经染色抗体的浓度。这些步骤可以以任意合适的顺序来使用，然而，其中一般地，利用将经染色抗体与细菌相组合而产生之颜色浓度的步骤将必要地接在使所述抗体与所述细菌相接触的步骤之后。
在一些优选实施方案中，本发明的方法涉及：
所述方法，其中所述抗体能够特异性地结合乳腺炎中所涉及的细菌；
所述方法，其中所述制备物包含多于一种类型的抗体，并且优选包含多于两种、更优选多于三种、甚至更优选多于四种、并且最优选五种或更多不同类型的抗体，每种特异性地与一种不同类型的细菌或多种这样的类型相结合。
在本发明的一些方面，定性和/或定量地检测颜色变化和/或颜色浓度变化而不将细菌从乳中分离，优选通过使用荧光抗体染色和检测器例如流式细胞仪来进行。
一般地，优选在将细菌从牛奶中分离(优选通过(微)过滤或离心)后定性和/或定量地检测颜色变化和/或颜色浓度变化。
可使用该颜色变化和/或浓度变化来确定牛奶中的细胞(尤其是细菌)的类型，并且优选地还确定所述细胞的相对量。
在一些优选实施方案中，在颜色检测步骤之前使乳基本澄清，尤其是通过部分地或完全地去除(和/或溶解)其蛋白质和/或脂肪组分。
通过在身体组织和流体中使用特异性抗体来检测细菌在医学领域是公知的。然而，这些已知的用途需要特定的条件，使这样的已知方法与本发明方法区分开来。
发明详述
乳腺炎导致单位重量或单位体积的乳中的细菌量提高。可通过流式细胞仪原理采用荧光技术来对细菌进行计数。
在该情况下，荧光技术是指使细菌与经适当染色的抗体组合(并从而反应)，并且使该组合通过流动池，其中在荧光的影响下，与抗体组合的单个细胞发出光脉冲。检测光脉冲数，其与细菌细胞数相关联。
有多组细菌导致乳腺炎。本发明基于这样的事实，特定的抗体只与特定类型的细菌相结合。根据该数据，可以通过使用不同的抗体来鉴定不同的细菌。
可使用单一类型的抗体来检测和测量基本单一类型的细菌的浓度。然而，因为一般将涉及多于一种细菌类型，并且常常没有关于将遇到哪些细菌种类的先验信息，所以优选将多至5(或甚至更多)种不同类别的抗体添加到牛奶样品中。优选地，将选择这些抗体以涵盖在实际中遇到的最常见的细菌类型。
每个抗体群都预先用相应数目(多至5种，或更多)的特定的不同染色用溶液进行染色。例如，使用5种不同的染色剂使得可以存在5种不同的颜色，并且它们可单独地通过特定的方法1A来检测。
方法1A
当经染色的抗体围绕(附着于或结合)牛奶样品中的细菌时，牛奶(或经澄清的牛奶)的颜色在细菌的影响下发生变化。该颜色的变化可通过特定的颜色检测器来检测。
当细菌通过设置有一个或更多个不同颜色检测器(荧光)的流动池时，可基于由经染色抗体引起的颜色变化来对细菌数进行计数。
该颜色变化取决于经染色抗体的类型。如果细菌的类型是已知的，则可针对该特定细菌类型具体地选择使用的抗体。导致乳腺炎的细菌类型一般是已知的，并且经染色抗体的选择将一般地基于该常识。通过这种方法，可检测和测量哪些类型的细菌正在奶牛中导致疾病，例如乳腺炎。
方法1B
与牛奶样品中特定的未染色细菌结合的经染色抗体将在流式细胞仪中荧光的影响下产生光脉冲。由于一个细菌将结合数个抗体这一事实，在通过流式细胞仪时，游离在牛奶样品中的单个抗体与细菌周围的多个抗体的光输出脉冲是不同的，因此，可通过所产生的不同光脉冲强度来检测细菌。
方法1C
利用如方法1A和方法1B所示抗体与细菌相结合的原理，还可通过过滤牛奶样品来进行检测。
为了检测牛奶样品中被抗体围绕(附着或结合)的细菌，可将牛奶样品以这样的方法进行微滤，以使被抗体围绕或未被抗体围绕的所有细菌都将留在滤器的表面上。在该滤器表面，可使用荧光或非荧光的显微镜或任何其他检测系统来鉴定或识别被抗体围绕的细菌。
流式细胞仪优选地具有5个或更多个不同的颜色检测器。这些检测器对5种不同颜色作出反应。当经染色的细菌流经过显微镜的物镜时，将有与经过的细菌数相应的大量脉冲。
当在经染色的细菌间也检测到具有不同颜色的脉冲(约相同大小)时，这是对由不同细菌导致的乳腺炎的抗体反应的指示，并且可据此来选择抗生素。

Claims (7)

1.一种检测乳中细菌的存在的方法，其中使乳与包含有效量的至少一种类型之抗体的制备物相接触，所述抗体能够特异性结合待检测的细菌；
在所述接触之前或之后，用染色用制备物对所述抗体进行染色，所述染色用制备物选择成使得经其染色的抗体在与所述细菌相接触时表现出颜色变化或颜色浓度变化；并且
通过所述乳与所述经染色抗体接触所导致的颜色变化的存在和/或相对强度来确定与所述乳中的细菌结合的经染色抗体的浓度。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗体能够与乳腺炎中所涉及的细菌特异性结合。
3.权利要求2所述的方法，其中所述制备物包含多于一种类型的抗体，并且优选包含多于两种，更优选多于三种，甚至更优选多于四种，并且最优选五种或更多不同类型的抗体，每种类型与一种不同类型的细菌或多种这样的类型特异性结合。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中定性和/或定量地检测所述颜色变化而不将所述细菌从所述乳中分离，优选通过采用荧光抗体染色和检测器例如流式细胞仪来进行。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在将所述细菌从所述乳中分离后定性和/或定量地检测所述颜色变化，优选通过(微)过滤或离心来进行。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用所述颜色变化来确定所述乳中的一种或更多种细菌类型，并且优选地还确定所述细菌的相对量(浓度)。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述颜色变化检测步骤之前，使所述乳基本澄清，尤其通过部分或完全地去除其蛋白质和/或脂肪组分来进行。
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