RU2810589C1 - Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота - Google Patents
Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2810589C1 RU2810589C1 RU2023107890A RU2023107890A RU2810589C1 RU 2810589 C1 RU2810589 C1 RU 2810589C1 RU 2023107890 A RU2023107890 A RU 2023107890A RU 2023107890 A RU2023107890 A RU 2023107890A RU 2810589 C1 RU2810589 C1 RU 2810589C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reaction
- vlcrs
- diagnostic
- centrifugation
- blood
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical class OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 8
- 244000309466 calf Species 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 5
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 4
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N biuret Chemical compound NC(=O)NC(N)=O OHJMTUPIZMNBFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ включает стадии забора проб крови, приготовление мазков из клеточной взвеси лимфоцитов, выделенных из крови центрифугированием на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества. Для постановки реакции иммунофлуоресценции используют диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины в титре 1:640 - 1:1280 против ВЛКРС, полученные из сыворотки крови больной коровы в клинико-гематологической форме, инактивированной при 56°С в течение 30 мин с последующим выделением глобулиновой фракции методом высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония с отчисткой ценрифугированием и гельфильтрацией на колонке сефадекс G-25, меченные флюоресцеин 5-изотиоционатом в рабочем разведении 1:20. Способ позволяет выявить вирус ВЛКРС на ранних стадиях развития заболевания, способствует сокращению времени проведения исследования. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и биотехнологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) путем исследования клеточной взвеси лимфоцитов с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ).
По данным Россельхознадзора РФ за 2022 год лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующую позицию в рейтинге самых диагностируемых инфекций [Эпизоотическая ситуация в Российской Федерации. Отчеты по эпидситуации в стране: сайт Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор): https: // fsvps.gov.ru/ru/iac/rf/ezhekvartalnyj-otchet]. Многие исследователи считают его эпидемически опасным и ответственным за развитие раковых заболеваний за счет возможности передачи возбудителя от животных человеку [Aida Y., Murakami H., Takahashi M., Takeshima S-N. Mechanisms of pathogenesis induced by bovine leukemia virus as a model for human T-cell leukemia virus // Front Microbiol. - 2013. - Vol. 8 (4). - P. 328.].
Методом, обладающим максимальной чувствительностью и высокой специфичностью, позволяющим с высокой эффективностью выявлять инфицированных ВЛКРС животных, а также дифференцировать инфицированных телят от телят с колостральными антителами является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Высокая стоимость оборудования и реактивов для ПЦР не позволяет ее рассматривать как метод массовой диагностики. Помимо этого, в развитии вирусной инфекции существуют периоды, имеющие очень низкий уровень ДНК провируса. В таких случаях, несмотря на высокую чувствительность ПЦР, более информативными являются серологические методы диагностики [Beier D., Blankenstein P., Fechner H. Possibilities and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. - 1998. - Vol. 105. - P. 408-412.]
Другим методом прямого выявления вируса является реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), обладающая рядом преимуществ: простота, скорость постановки, специфичность и экономичность.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота [Патент RU 2767688 С1 Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патентообладатель ФГБНУ «Омский АНЦ», опубл.18.03.2022, Бюл. №8], включающий забор проб крови, выделение на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества клеточной взвеси лимфоцитов, приготовление из нее мазков и постановку РНИФ.
Основным недостатком данного метода является необходимость применения в качестве компонента реакции стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка, ранее выпускаемой НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва), но прекратившей в настоящее время его производство. Индивидуальный заказ этого компонента увеличивает стоимость диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что экономически не целесообразно. К тому же применение этого реагента усложняет анализ проведения реакции из-за введения дополнительной стадии, тем самым увеличивая длительность ее постановки.
Техническим результатом является упрощение постановки реакции, сокращение времени и снижение материальных затрат на ее проведение.
Техническим решением способа постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота является: выделение лимфоцитов из крови крупного рогатого скота центрифугированием в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества (тразографа или его аналога). Из выделенной взвеси лимфоцитов делают мазок типа «высушенной капли», высушивают при комнатной температуре, фиксируют в 96 % этиловом спирте 30 минут, затем наносят 50 мкл диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в рабочем разведении 1:640, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают при комнатной температуре в условиях затемнения и просматривают в люминесцентном микроскопе.
Также осуществляют контроль реакции с антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота и физиологическим раствором. Для оценки интенсивности свечения используют четырех крестовую систему: (++++) - очень яркая люминесценция, четко контрастирующая на темном фоне; (+++) - яркая люминесценция; (++) или (+) - слабое свечение; (-) - отсутствие люминесценции.
За положительный результат принимают специфическое свечение антигена с оценкой в четыре, три креста.
Отличительными признаками предложенного способа является то, что осуществляется прямое окрашивание диагностическими флуоресцирующими иммуноглобулинами против ВЛКРС зафиксированных на стекле мазков с высушенной клеточной взвесью лимфоцитов. Предлагаемый способ позволяет сократить время постановки реакции в 2,0 раза и упростить ее за счет исключения одной из двух стадий инкубаций, необходимых для постановки РНИФ, а также снизить ее стоимость за счет уменьшения трудозатрат и исключения необходимости использования дорогостоящего компонента реакции - стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка.
Получение, определение активности и специфичности диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС.
Получают сыворотку крови от больной лейкозом в гематологической стадии коровы. С этой целью проводят инкубацию отобранной периферической крови в термостате при температуре 37°С в течение 60 мин, затем в холодильнике при температуре 4°С в течение 4-х часов. Образовавшийся сгусток фибрина отделяют от стенок пробирок с помощью стеклянной палочки или проволоки. Прозрачную жидкость, отделенную от кровяного сгустка, центрифугируют при 1500 об/мин. в течение 10 минут. Полученную таким образом сыворотку сливают в чистую сухую пробирку в объеме не менее 20 мл, затем инактивируют на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут, центрифугируют при 10 000 об/мин 20 минут для удаления агрегированных белков.
Получают глобулиновую фракцию методом высаливания [Кубица Ю. Иммунофлюоресценция. - М.: Медицина, 1967. - С. 84-85] в насыщенном растворе сернокислого аммония (542 г соли в 1 л дистиллированной воды) в условиях холодильника 4°С в течение 20 минут на магнитной мешалке. Отчищают глобулиновую фракцию от сернокислого аммония центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость выливают, а осадок с сернокислым аммонием растворяют в 0,15 М растворе хлористого натрия и фильтруют через колонку сефадекс G-25. Очищенные иммуноглобулины (Ig) проверяют в качественной реакции на наличие солей аммония с реактивом Нейслера (50 мкл глобулиновой фракции смешивают с 50 мкл реактива Нейслера). В случае положительной реакции (желтое окрашивание) повторяют фильтрацию через колонку сефадекс G-50. Затем определяют количество белка по биуретовой реакции спектрофотометрическим методом.
Проводят мечение глобулинов люминесцентным красителем флюоресцеин 5-изотиоционатом (FITC) на магнитной мешалке в условиях холодильника 4°С в течение 16-18 часов из расчета FITC 0,05 мг: Ig 1 мг белка (1:20) предварительно растворив краситель в карбонатно-бикарбонатного буфере (рН 9,2). Очищают от краски с помощью гельфильтрации на колонке сефадекс G-50.
Оценку активности и специфичности проводят разведением опытных диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в 0,9% физиологическом растворе с 1:80 до 1:1280, учитывают активность красящего титра иммуноглобулинов по максимальному разведению, обеспечивающему окраску препарата не ниже 3-х крестов. Рабочим разведением считают титр в 2 раза меньший красящего титра - 1:640 (табл. 1).
| Таблица 1 - Определение активности и специфичности диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС | ||||||||||
| Компоненты реакции антиген | опытные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины против ВЛКРС |
1иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие бруцеллезные | ||||||||
| 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 | 1:1280 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | |
| 2вакцинный штамм Brucella abortus 19 | ++ | + | - | - | - | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | +++ |
| 3антиген вируса лейкоза |
++++ | ++++ | ++++ | +++ | +++ | ++ | + | - | - | - |
Примечание:
1иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие бруцеллезные - иммуноглобулины диагностические, флуоресцирующие бруцеллезные сухие Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (рекомендуемое инструкцией рабочее разведение 1:32);
2вакцинный штамм Brucella abortus 19 - «Вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма Brucella abortus 19 живая сухая» производства Щелковского биокомбината г. Москва;
3антиген вируса лейкоза, положительная контрольная сыворотка против ВЛКРС - набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота Курской биофабрики г. Курск.
Результаты, представленные в таблице, демонстрируют, что полученные диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины против ВЛКРС специфичны в отношении антигена ВЛКРС в 100% случаях, о чем свидетельствует положительная реакция (свечение не менее трех крестов) и отрицательная с антигеном B. abortus 19.
Таким образом, описанный способ способствовал получению диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против вируса лейкоза крупного рогатого скота с высокой активностью в титре 1:640 - 1:1280.
Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.
Пример.
Испытание диагностической эффективности реакции иммунофлуоресценции в производственных условиях
Проводят производственное испытание предлагаемого способа путем отбора проб крови от крупного рогатого скота, принадлежащего двум сельскохозяйственным формированиям Омской области с различным эпизоотическим статусом по лейкозу. В хозяйстве (А) с широким распространением вирусной инфекции (до 70 % инфицированных коров в стаде) по результатам серологических исследований в реакции иммунной диффузии (РИД) производят отбор проб крови от 50 РИД-негативных и от 50 РИД-позитивных коров и исследуют в ПЦР, а также с помощью известного способа и предлагаемого способа. РИД-негативный крупный рогатый скот (n=50) из благополучного по лейкозу хозяйства (Б) служил в качестве контроля.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
При исследовании 50 РИД-позитивных коров в 100 % случаях отмечают положительную реакцию иммунофлюоресценции, проведенную как по известному [Патент RU 2767688 С1 Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота], так и по предлагаемому способу. В то же время у двух животных, несмотря по положительную серологическую реакцию, ПЦР оказалась отрицательной, что можно связать с наличием низкого уровня провирусной ДНК у этих животных.
| Таблица 2 - Сравнительный анализ диагностической эффективности реакции иммунофлюоресценции, проведенной по известному и предлагаемому способу | ||||||||
| Хозяйство | Статус животных | Кол-во проб |
ПЦР | Реакция иммунофлюоресценции | ||||
| Известный способ | Предлагаемый способ | |||||||
| (-) | (+) | (-) | (+) | (-) | (+) | |||
| А | РИД (-) | 50 | 45 | 5 | 42 | 8 | 42 | 8 |
| РИД (+) | 50 | 2 | 48 | 0 | 50 | 0 | 50 | |
| Б (контроль) | РИД (-) | 50 | 50 | 0 | 50 | 0 | 50 | 0 |
Следует отметить, что как с помощью известного, так и предлагаемого способов постановки реакции иммунофлюоресценции среди РИД-негативного поголовья было дополнительно выявлено 8 носителей ВЛКРС, что составило 16 %, тогда как ПЦР позволил идентифицировать провирус только у 5 животных (10 %).
Диагностические исследования РИД-негативных коров из благополучного по лейкозу хозяйства подтвердили отсутствие вирусной инфекции.
На следующем этапе в этих же хозяйствах проводят испытание диагностической эффективности предлагаемого метода на телятах в возрасте до 5-и месяцев.
С этой целью в хозяйстве (А) по результатам исследований в ПЦР проводят отбор проб крови от 19 голов ПЦР-негативного молодняка крупного рогатого скота и от 21 животного носителя провирусной ДНК и исследуют в реакции иммунофлюоресценции по известному и предлагаемому методам. Еще 40 ПЦР-негативных теленка из благополучного по лейкозу хозяйства служили в качестве контроля.
Результаты исследований представлены в таблице 3.
| Таблица 3 - Сравнительный анализ диагностической эффективности реакции иммунофлюоресценции, проведенной по известному и предлагаемому способу на телятах до 5-месячного возраста | ||||||
| Хозяйство | Статус животных | Количество проб | Реакция иммунофлюоресценции | |||
| Известный способ | Предлагаемый способ |
|||||
| (-) | (+) | (-) | (+) | |||
| А | ПЦР (-) | 19 | 18 | 1 | 18 | 1 |
| ПЦР (+) | 21 | 0 | 21 | 0 | 21 | |
| Б (контроль) | ПЦР (-) | 40 | 40 | 0 | 40 | 0 |
Во всех случаях у ПЦР-негативных телят из благополучного по лейкозу хозяйства была подтверждена отрицательная реакция иммунофлюоресценции, что подтверждало специфичность диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС.
По результатам диагностических исследований в хозяйстве (А) у всех носителей ДНК провируса регистрировалось специфическое свечение. У одного ПЦР-негативного теленка выявлен антиген ВЛКРС как при постановке реакции иммунофлюоресценции известным, так и предлагаемым методом.
Таким образом, установлена идентичная диагностическая эффективность реакции иммунофлюоресценции независимо от способа ее постановки, превосходящая по своей чувствительности ПЦР и подтверждающая в 100 % случаях результаты РИД у коров в случаях ее несоответствия с ПЦР (РИД+, ПЦР-).
Несмотря на одинаковую чувствительность с известным способом, предлагаемый способ постановки РИФ с использованием диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов в титре 1:640 позволяет уменьшить стоимость диагностики лейкоза крупного рогатого скота путем исключения дорогостоящего компонента реакции (стандартной люминесцирующей кроличьей антисыворотки против глобулинов быка), использования антигена вируса лейкоза из набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота только для контроля реакции, снижения расхода наконечников для дозатора и амортизации термостатного оборудования, а также трудозатрат специалиста. Помимо этого, способ позволяет сократить время постановки реакции в 2 раза за счет исключения одной из двух стадий инкубаций, необходимых для постановки РНИФ (дополнительные затраты времени на нанесение на мазок положительной сыворотки с трехкратным промыванием мазка - 6,5 минут и на инкубацию - 30,0 минут). Способ может быть использован как альтернативный метод ПЦР диагностики.
Claims (2)
1. Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий забор проб крови, приготовление мазков из клеточной взвеси лимфоцитов выделенных из крови центрифугированием на градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества, отличающийся тем, что на фиксированный мазок наносят 50 мкл диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов против ВЛКРС в рабочем разведении 1:640, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе с использованием четырехкрестовой системы для оценки интенсивности свечения, контроль реакции осуществляют с антигеном ВЛКРС и физиологическим раствором.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что диагностические флуоресцирующие иммуноглобулины против ВЛКРС получены из сыворотки крови больной коровы в клинико-гематологической форме, инактивированной при 56°С в течение 30 мин, с последующим выделением глобулиновой фракции методом высаливания в насыщенном растворе сернокислого аммония с отчисткой центрифугированием и гельфильтрацией на колонке сефадекс G-25, меченные флюоресцеин 5-изотиоционатом в рабочем разведении 1:20.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2810589C1 true RU2810589C1 (ru) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144189C1 (ru) * | 1999-03-31 | 2000-01-10 | Пащенко Владимир Захарович | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2425377C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-07-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2767688C1 (ru) * | 2021-04-07 | 2022-03-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") | Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2144189C1 (ru) * | 1999-03-31 | 2000-01-10 | Пащенко Владимир Захарович | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2425377C1 (ru) * | 2010-01-11 | 2011-07-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
| RU2767688C1 (ru) * | 2021-04-07 | 2022-03-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Омский аграрный научный центр" (ФГБНУ "Омский АНЦ") | Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| McGuire-Rodgers S. J., Castro A. E. Relationship of the antigens of bovine leukemia virus to clinical enzootic bovine leukosis in cattle //The Bovine Practitioner, 1983, p. 179-183. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7713715B2 (en) | Method for diagnosing infections | |
| Bakker et al. | Paratuberculosis recognized as a problem at last: a review | |
| US7422869B2 (en) | Method for diagnosing infectious diseases | |
| Neul et al. | Immunologic responses in corn snakes (Pantherophis guttatus) after experimentally induced infection with ferlaviruses | |
| RU2810589C1 (ru) | Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| Gruffydd-Jones et al. | Chlamydia infection in cats in New Zealand | |
| Nicoletti | An evaluation of serologic tests used to diagnose brucellosis in buffaloes (Bubalus bubalis) | |
| JP5781617B2 (ja) | 感染の程度を判定するための方法 | |
| Sukura et al. | Pneumocystis carinii pneumonia in dogs-a diagnostic challenge | |
| RU2425377C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| Torres et al. | Influence of Mycoplasma bovis infection on milk production and quality of Holstein dairy cows | |
| CN115166239A (zh) | 牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 | |
| RU2767688C1 (ru) | Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| Durojaiye et al. | Counter immunoelectroosmophoresis in the diagnosis of infectious bursal disease of poultry | |
| RU2339038C2 (ru) | Способ прижизненной диагностики трихинеллеза плотоядных и всеядных животных | |
| Abbas et al. | Seropositivity, involvement in suspected cases of chronic respiratory diseases and comparative efficacy of various sero-diagnostic tests of Mycoplasma gallisepticum | |
| RU2287154C2 (ru) | Способ диагностики токсоплазмоза у собак и кошек | |
| RU2736806C2 (ru) | Способ диагностики сосудистого бактериоза крестоцветных методом дот-иммуноанализа | |
| CN111638329B (zh) | 一种用于检测布鲁氏菌病elispot检测试剂盒及其应用 | |
| RU2684417C1 (ru) | Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i | |
| Singh et al. | Control of ovine brucellosis in a high performance sheep flock using multiple serological tests | |
| RU2111492C1 (ru) | Способ диагностики инфекционных заболеваний животных | |
| RU2251112C1 (ru) | Способ диагностики хламидиозов | |
| Phillips et al. | Identification of encapsulated and non-encapsulated Yersinia pestis by immunofluorescence tests using polyclonal and monoclonal antibodies | |
| Felsenfeld | Chapter IV Borrelia |