RU2684417C1 - Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i - Google Patents
Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i Download PDFInfo
- Publication number
- RU2684417C1 RU2684417C1 RU2018117226A RU2018117226A RU2684417C1 RU 2684417 C1 RU2684417 C1 RU 2684417C1 RU 2018117226 A RU2018117226 A RU 2018117226A RU 2018117226 A RU2018117226 A RU 2018117226A RU 2684417 C1 RU2684417 C1 RU 2684417C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ducklings
- virus
- type
- serum
- antigen
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 48
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 10
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 241001651352 Avihepatovirus A Species 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000908019 Homo sapiens Ceruloplasmin Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241001480506 Mammalian orthoreovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии. Предложен способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена. В качестве антигена используют вирус, полученный в результате введения в организм штамма "ВН-3" вируса гепатита утят типа I. При очистке инактивированного вируссодержащего материала используют активированное макропористое стекло 1000 ВГХ. В качестве антивидового иммунопероксидазного конъюгата используют специфичный к IgG уток. Результаты ИФА учитывают по формуле: титр = antilg [1.36 (lg S/P) +3.53]. Пробы сыворотки с S/P-отношением ниже 0,2 расцениваются как отрицательные, с S/P-отношением, равным 0,21 - 0,23 - сомнительными, больше или равными 0,24 - положительными. Изобретение обеспечивает эффективное определение специфических антител к вирусу гепатита утят типа I. 2 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способам для выявления специфических антител к вирусу гепатита утят типа I.
Вирусный гепатит утят типа I (ВГУ-1) - высококонтагиозная, сверхостро протекающая среди утят и латентно среди уток болезнь, с преимущественным поражением печени и большой смертностью молодняка. ВГУ-1 наносит значительный экономический ущерб утководческим хозяйствам, особенно промышленного типа, поскольку вызывает массовую гибель утят 1-30 - суточного возраста 30-95% и снижение продуктивности уток. Переболевшие утята отстают в росте и развитии, что ведет к частичной потере мясной продуктивности, нарушению племенной работы. Ущерб от ВГУ-1 усугубляется затратами на ограничительные мероприятия, нарушающие экономику хозяйства, особенно когда болезнь принимает стационарный характер [1, 2, 3].
Поэтому исключительно важное значение приобретает диагностика данной болезни, основанная на эпизоотологических данных, клиническо-патологоанатомической картины, результатах лабораторных исследований (выделение вируса и его идентификация в реакции нейтрализации, биопроба), а также обнаружение специфических антител в сыворотке крови птиц методом иммуноферментного анализа.
В настоящее время для определения антител в пробах сыворотки крови утят (уток) к вирусу гепатита используют, как правило, реакцию нейтрализации, заключающейся в том, что к двукратным разведениям сыворотки добавляют равный объем вируссодержащей суспензии, содержащей 100 или 1000 ТЦД50 антигена. Смеси инкубируют при комнатной температуре 1 час и заражают культуру клеток. Титр вируснейтрализующих антител выражают в log2 (4).
Недостатком данного способа является его длительность - (5-6 суток), что недопустимо в разгар эпизоотии, а также способ дорогостоящий и трудоемкий.
Известен способ определения антител к экзотоксину коклюшных бактерий путем иммуноферментного анализа, включающий в себя адсорбцию экзотоксина на поверхности полистирола, внесение исследуемых антител, конъюгатаантивидовых антител с ферментом субстрата, причем перед адсорбцией токсина поверхность полистирола обрабатывают частично денатурированным церулоплазмином человека (5).
Однако, указанный способ не позволяет проводить диагностику вирусного гепатита утят типа I.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является известный способ определения антител к антигену вирусного энтерита гусей (6).
Согласно способу, вируссодержащий материал получают с использованием штамма "П-75". Очистку полученного биосырья осуществляют путем вирусной гельхроматографии на макропористом стекле с диаметром пор, соответствующим диаметру очищаемого вируса. Разведение очищенного антигена вируса энтерита гусей проводят фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 5,0 - 10,0 мкг/0,1 см3. Адсорбцию разведенного антигена проводят на поверхности полистироловых планшет, затем на планшеты наносят исследуемые сыворотки крови гусей. Детекцию комплекса антиген- антитело осуществляют с использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG гуся и учитывают результаты реакции ИФА.
Учет результатов реакции ИФА исследуемых сывороток крови гусят (гусей) проводят, как визуально путем сравнения цветового окрашивания содержимого лунок исследуемой сыворотки с интенсивностью окраски продукта пероксидазной реакции титруемого контроля, так и используя математическую формулу.
Однако данный способ также не позволяет проводить диагностику вирусного гепатита утят.
Задачей, решаемой в рамках данного изобретения, является создание способа определения антител к вирусу гепатита утят типа I, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, а также позволяющего сократить время исследования и снизить экономические затраты.
Указанная задача была решена в результате создания способа определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающего получение антигена, его инактивацию и очистку способом вирусной гельхроматографии на активированном макропористом стекле, его иммобилизацию (адсорбцию) на поверхности полистироловых планшет, внесение контрольных и исследуемых сывороток крови и детекцию комплекса антиген-антитело с помощью антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к IgG уток в присутствии субстратно-индикаторной смеси, причем в качестве антигена используют вирус, полученный в результате введения в организм штамма «ВН-3» вируса гепатита утят типа I, при очистке инактивированного вируссодержащего материала используют активированное макропористое стекло 1000 ВГХ, а в качестве антивидового иммунопероксидазного конъюгата используют специфичный к IgG уток, а результаты ИФА учитывают по формуле: титр = antilg (1.36 (lg S/P) +3.53), где S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки; Р - значение оптической плотности положительного контроля, и пробу сыворотки S/P - отношением ниже 0,2 расценивают как отрицательную, S/P - отношением равно 0,21 - 0,23 - сомнительную, больше или равными 0,24 - положительную.
Заявляемые свойства способа обусловлены, прежде всего, использованием штамма «ВН-3» вируса гепатита утят типа I, инфекционный титр которого составляет 7,0±0,25 lg ЭЛД50/см3. Полученный штамм вируса депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им.
Д.И. Ивановского ФГБНУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2859.
Установлено, что оптимальной дозой антигена вируса гепатита утят для сорбции на полистироловом планшете по белку является 5-9 мкг /0,1 см3, поскольку увеличение ее выше 9 мкг /0,1 см3 не приводило к возрастанию емкости твердофазного иммуносорбента. При концентрации белка менее 5 мкг/см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола.
Специфический комплекс - антиген - немеченное антитело выявляют использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к lg G уток, поскольку это определяется его биологическими свойствами.
Способ осуществляют следующим образом.
Вирус гепатита утят типа I штамма "ВН-3" хранится в ФГБНУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» и выдается по требованию предприятия не реже 1 раза в год с паспортом, характеризующим свойства штамма. Для получения вируссодержащего материала используют общепринятые методики (4). Инфекционный титр вируссодержащей жидкости должен быть не ниже 7,0 lg ЭЛД50в 1,0 см3. Активный и специфичный антиген вируса гепатита утят получают путем очистки вируссодержащей эмбриональной жидкости методом колоночной хроматографии на активированном макропористом стекле 1000 ВГХ, обработанном 4% раствором ПВП. В очищенном препарате вируса количество белка определяют методом Лоури, и оно, как правило, составляет от 60 до 90 мкг / см3. Затем очищенный препарат вируса, разводят 0,01 М ФСБ с содержанием 0,15 М хлорида натрия, рН 7,3-7,5, до конечной концентрации 6-9 мкг / 0,1 см3. Эта концентрация является оптимальной для адсорбции очищенного антигена
вируса в лунках планшета, поскольку увеличение концентрации антигена свыше 9 мкг/0,1 см3 и уменьшение ее ниже 5 мкг/0,1 см3 снижает чувствительность реакции.
После определения активности и специфичности очищенный антиген вируса разделяют на две партии (части), одну из которых используют для иммунизации утят с целью получения штамма специфической сыворотки крови, а вторую для сорбции в лунках планшета для ИФА.
Твердофазный иммуносорбент получают посредством сорбции в лунках планшета для ИФА по 0,1 см3 разведенного в 0,01 М ФСБ до оптимальной концентрации очищенного антигена в течение 16-18 часов при 4-8°С. Затем содержимое лунок планшета удаляют резким встряхиванием и трехкратно промывают буфером следующего состава: 0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,5 М хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией детергента твина-20, рН 7,3-7,5. После чего лунки планшета подсушивают путем постукивания по фильтровальной бумаге.
Для постановки иммуноферментного анализа используют: одно - и восьмиканальные автоматические пипетки со сменными наконечниками разных объемов, термостат с температурой нагрева (37±0,5)°С, бытовой холодильник, спектрофотометр любой конструкции вертикальным лучом света при длине волны 492 нм.
Для исследования в лабораторию доставляют по 20-25 проб в объеме 0,1-0,2 см3 сыворотки крови утят разных возрастных групп из утководческих хозяйств, где имеется подозрение на данное заболевание. Затем готовят иммуноспецифические и неспецифические компоненты и рабочие растворы:
Иммуноспецифические компоненты:
К.1 - положительная сыворотка крови утят, содержащая антитела к вирусу гепатита утят типа I(положительный контроль), разведенная 1:100 0,15М хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки, лиофилизированная, 1,0 см3 - 1 ампула или флакон;
К.2 - нормальная сыворотка крови утят, не содержащая антител к вирусу гепатита утят (отрицательный контроль), разведенная 1:100 0,15М раствором хлорида натрия с содержанием 1% фетальной сыворотки, лиофилизированная, объем 1,0 см3 - 1 ампула или флакон;
К.3 - полистироловые 96-луночные планшеты с адсорбированным в лунках очищенным инактивированным антигеном вируса гепатита утят типа I- 2 планшета;
К.4 - антивидовой (кроличий) иммунопероксидазный конъюгат против IgG уток, жидкий, объем 0,1 см3 - 1 флакон;
Неспецифические компоненты:
К.5 - буферный раствор (концентрированный) для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового конъюгата и межэтапных промывок, объем 5,0 см3 - 1 флакон;
К.6 - набор солей для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора, таблетка 0,63 г, - 2 шт.
К.7 - детергент твина-20, объем 5,0 см3 - 1 флакон;
К.8 -субстрат ортофенилендиамин (ОФД), таблетка 5 мг, 2 шт.;
К.9 - гидроперит, таблетка 1,5 г - 1 шт.;
К. 10 - натрий хлористый, кристаллический порошок 22,0 г - 1 флакон.
1. Приготовление рабочих растворов осуществляют следующим образом.
Раствор №1 - буферный раствор для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового конъюгата и межэтапных промывок. Содержимое флаконов К.5 и К.10 растворить в 750,0 см3 дистиллированной воды и измерить величину рН, которая должна быть в пределах 7,3-7,5. Затем в этот раствор добавить содержимое флакона К.7. Раствор рекомендуется хранить при температуре 4-8°С не более 10 суток.
Раствор №2 - фосфатно-цитратный буферный раствор.
Содержимое флакона К.6 (1 таблетку) растворить в 10,0 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН в пределах 4,9-5,0. Готовить перед использованием.
Раствор №3. 1 таблетку гидроперита (К.9) растворить в 45,0 см3 дистиллированной воды. Раствор хранить в защищенном от света месте при температуре 4-8°С не более 10 сут.
Раствор №4 - субстратно-индикаторная смесь. 1 таблетку ОФД (К.8) растворить в 10,0 см3 раствора №2, перемешать до полного растворения и добавить 0,4 см3 раствора №3.
Раствор №4 готовить непосредственно перед использованием. Хранению не подлежит.
Раствор №5 - стоп - раствор. 1,0 см3 концентрированной серной кислоты (в наборе отсутствует) растворить в 10,0 см3 дистиллированной воды. Раствор рекомендуется хранить во флаконе из темного стекла при температуре 18-25°С не более одного месяца.
В связи с высокой токсичностью ОФД и серной кислоты приготовление субстратно-индикаторной смеси и стоп-раствора проводить в резиновых перчатках, избегая попадания на кожу и слизистые оболочки.
2. Подготовка иммуноспецифических компонентов.
2.1. К содержимому ампулы (флакона) с лиофилизированной положительной сывороткой крови утят (К.1) добавить 1,0 см3 раствора №1. Готовят перед использованием. Подготовленную сыворотку рекомендуется хранить при температуре минус 10°С и ниже не более 15 сут. В течение срока годности размораживание допускается один раз.
2.2. К содержимому ампулы (флакона) с лиофилизированной нормальной сывороткой крови утят (К.2) добавить 1,0 см3 раствора №1. Готовят перед использованием. Подготовленную сыворотку рекомендуется хранить при температуре минус 10°С и ниже не более 15 сут. В течение срока годности размораживание допускается один раз.
2.3. Рабочий раствор конъюгата. К содержимому флакона с антивидовым конъюгатом (К.4) добавить 10,0 см3 раствора №1. Раствор готовить непосредственно перед использованием. Хранению не подлежит.
3. Разведение испытуемых и контрольных сывороток крови.
1. При постановке ИФА в одном разведении все испытуемые и контрольные сыворотки (положительную и нормальную) развести 1:400 раствором №1.
Для контрольных к 0,3 см3 раствора №1 добавить 0,1 см3 сыворотки крови уток, для испытуемых к 1,0 см3 раствора №1 добавить 0,0025 см3 сыворотки крови уток и трижды пипетировать, используя для каждой пробы новый наконечник.
2. При постановке ИФА методом раститровки контрольные пробы сывороток (положительная и нормальная), приготовленные по п.п. 2.1, 2.2. разведены 1:100. Готовы к использованию. Все испытуемые пробы сыворотки крови уток развести 1:100 раствором №1. Для чего к 1,0 см3 раствора №1 добавить 0,01 см3 сыворотки крови и трижды пипетировать, используя для каждой пробы новый наконечник.
4. Постановка реакции
1.1. При постановке ИФА в одном разведении в лунки вертикальных рядов планшета А1,В1,С1 внести положительную сыворотку, подготовленную по п. 1 в объеме 0,1 см3. В лунки планшета D1,E1,F1 внести нормальную сыворотку (отрицательный контроль), подготовленную по п. 1 в объеме 0,1 см3. Лунки G1-H1 служат контролем конъюгата и заполняются раствором №1 по 0,1 см3. В остальные лунки планшета внести испытуемые пробы, подготовленные по п. 1 в объеме 0,1 см3.
1.2. Планшет осторожно встряхнуть для перемешивания содержимого, накрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. По окончании инкубации лунки планшета освободить от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промыть раствором №1 (по 0,2 см3 в каждую лунку). Затем жидкость окончательно удалить и планшет подсушить, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
1.3. Во все используемые лунки планшета внести по 0,1 см3 рабочего раствора конъюгата, накрыть крышкой и инкубировать 30 минут при температуре 37±0,5°С. По окончании инкубации лунки планшета
освободить от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промыть раствором №1 (по 0,2 см3 в каждую лунку). Затем жидкость окончательно удалить и планшет подсушить, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
1.4. Во все используемые лунки планшета внести по 0,1 см3 раствора №4, накрыть крышкой и выдержать 3-5 мин при температуре 18-25°С в темном месте.
1.5. Реакцию остановить добавлением в каждую используемую лунку по 0,05 см3 (50 мкл) раствора №5.
2.1. При постановке ИФА методом раститровки во все лунки рядов планшета В1-В12…H1-H12 внести по 0,1 см3 раствора №1. В лунку планшета А1 внести нормальную сыворотку (отрицательный контроль), подготовленную по п. 1 в объеме 0,2 см3. В лунку планшета А2 внести положительную сыворотку, подготовленную по п. 1 в объеме 0,2 см3. В остальные лунки планшета А3-А12 внести испытуемые пробы, подготовленные по п. 2 в объеме 0,2 см3. Провести раститровку по вертикальным рядам А1-Н1…А12-Н12 с разведения 1:100 до 1:12800, перенося 0,1 см3 в очередную лунку вертикального ряда. Из последних лунок H1-H12 удалить по 0,1 см3. Дальнейшую постановку ИФА проводят аналогично по п. 1.2 - 1.5.
После остановки реакции учет результатов ИФА проводят визуально - по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструментально - с помощью спектрофотометра (ридера) с вертикальным лучом света при длине волны 492 нм.
5.1. При визуальном способе учета первоначально оценивают контрольные лунки: положительный контроль (положительная сыворотка) при раститровке окрашивается в желтый цвет различной интенсивности, отрицательный контроль (нормальная сыворотка) остается неокрашенным или незначительно желтеет. Затем сравнивают окраску содержимого лунок планшета испытуемых проб с окраской лунок отрицательного контроля.
Титром испытуемой сыворотки считается ее предельное разведение, при котором наблюдают видимое глазом цветовое окрашивание, более интенсивное по сравнению с отрицательным контролем. Титр контрольной положительной сыворотки должен быть не менее 1:800.
5.2. Инструментальный спектрофотометрический способ учета результатов может быть использован как при постановке ИФА в одном разведении, так и при раститровке сыворотки крови. Он позволяет количественно оценить титры специфических антител в исследуемых пробах путем измерения значений оптической плотности (ОП 492 нм).
При правильной постановке ИФА и использовании качественных компонентов набора среднее значение ОП отрицательного контроля в разведении 1:400 не должно превышать 0,200.
Разница показателей средних значений оптических плотностей положительного и отрицательного контролей в разведении 1:400 должна быть в диапазоне 0,340-0,980. Если полученные данные выходят за пределы этих значений, результаты считаются недостоверными и реакцию повторяют.
Наличие или отсутствие антител к вирусу гепатита утят устанавливается сравнением значений оптической плотности тестируемой сыворотки (S) с положительным контролем (Р). Проба сыворотки с S/P -отношением ниже 0,2 должна расцениваться как отрицательная. Если S/P - отношение равно 0,21 - 0,23 - сомнительными, больше или равными 0,24 - положительными.
При определении конечного титра исследуемой пробы по одному разведению 1:400, используют формулу Tитр=antilg [1,36 (lgs/p) + 3,53], где
S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки;
Р - значение оптической плотности положительного контроля.
При выявлении в сыворотках крови утят разных возрастных групп, невакцинированных против вирусного гепатита, специфических антител в титрах 1:100 и выше у более, чем 50% исследуемых проб дает основание
считать хозяйство стационарно неблагополучное по вирусному гепатиту утят типа I. Для подтверждения диагноза проводят вирусологические исследования по выделению вируса из патологического материала (сердце, почки, селезенка, печень, головной мозг). Оценкой эффективности применения вакцины является выявление в сыворотке крови привитых уток специфических антител в титрах не ниже, чем 1:400 у 80% вакцинированной птицы.
Пример 1. Был проведен сравнительный анализ результатов исследования проб сыворотки крови уток с помощью реакции нейтрализации (РН) и с использованием заявляемого способа. Сыворотки, проверяли на наличие антител к вирусу гепатита утят типа I в РН. Тест нейтрализации является классическим тестом для выявления специфических антител при вирусных заболеваниях, в том числе и при вирусном гепатите утят типа I. Результаты сравнительного изучения чувствительности ИФА и реакции нейтрализации при выявлении специфических антител к вирусу гепатита представлены в табл. 1.
Результаты проведенных исследований показали, что предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет выявлять специфические антитела к вирусу гепатита утят в пробах сыворотки крови.
Между двумя сравниваемыми способами коэффициент корреляции составил (r=-1,0), (р<0.05). Время проведения исследования с использованием заявляемого изобретения составило 3 часа, а в случае РН -5-6 суток.
Пример 2.
Были проведены испытания на активность и специфичность предложенного способа в шифрованном опыте. На испытание были представлены:
Положительные сыворотки крови утят (положительный контроль);
Отрицательные сыворотки крови утят (отрицательный контроль);
Сыворотка крови утят-реконвалесцентов - 10 проб;
Сыворотка крови уток, вакцинированных против вирусного гепатита утят типа 1-20 проб;
Сыворотка крови уток из хозяйств, благополучных по вирусному гепатиту утят типа 1-25 проб;
Специфические (гетерологичные) сыворотки крови уток к парвовирусу гусей и реовирусу - по 2 пробы.
Для исследований было зашифровано 7 проб сыворотки крови уток. Исследуемые сыворотки разводили ФСБ 1:100 и вносили в лунки планшета с адсорбированным очищенным антигеном вируса гепатита утят типа I в объеме 0,1 см3, по 2 лунки на каждую сыворотку. Иммуноферментную реакцию проводили аналогичным образом как указано ранее. Результаты испытаний представлены в табл. 2.
Примечание: "+" - наличие антител к вирусу гепатита в ИФА;
"-"- отсутствие антител в ИФА
Результаты шифрованного опыта показали, что ИФА при выявлении специфических антител в сыворотке крови к вирусу гепатита утят типа I обладает высокой чувствительностью и специфичностью.
Таким образом, заявляемый способ может быть использован для качественного и количественного определения специфических антител к вирусу гепатита в сыворотке крови утят и уток при проведении серологического мониторинга птицепоголовья, а также для определения уровня поствакцинального иммунитета при вирусном гепатите утят типа I.
Источники информации
1. Князев В.П. Болезни водоплавающих птиц: монография. Владимир, 2010; 160 с.
2. Gough R.E., McNulty M.S. Picornaviridae. In Poultry Diseases, 6th Edition. Eds Pattison M, McMullin PF, Bradbury JM, Alexander DJ. Elsevier. Butterworth-Heineman, 2008; 350-358.
3. Kim M.C., Kwon Y.K., Joh S.J. [et al]. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) and resent Korean DHV-1 like isolates using multiplex polymerase chain reaction. AvianPathology. 2008; 37: 171-177.
4. Белоусова P.B. Практикум по ветеринарной вирусологии: 3-е изд., перераб. и доп./ Р.В. Белоусова, Н.И. Троценко, Э.А. Преображенская. - М.: Колос. - 2013.-248 с.
5. Патент №1475331, SU. 1999.
6. Патент №2323743, RU, 2006.
Claims (1)
- Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа I путем проведения ИФА, включающий получение антигена, его инактивацию и очистку способом вирусной гельхроматографии на активированном макропористом стекле, его иммобилизацию (адсорбцию) на поверхности полистироловых планшет, внесение контрольных и исследуемых сывороток крови и детекцию комплекса антиген-антитело с помощью антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к IgG уток в присутствии субстратно-индикаторной смеси, характеризующийся тем, что в качестве антигена используют вирус, полученный в результате введения в организм штамма "ВН-3" вируса гепатита утят типа I, при очистке инактивированного вируссодержащего материала используют активированное макропористое стекло 1000 ВГХ, в качестве антивидового иммунопероксидазного конъюгата используют специфичный к IgG уток, а результаты ИФА учитывают по формуле: титр = antilg [1.36 (lg S/P) +3.53], где S - значение оптической плотности исследуемой сыворотки; Р - значение оптической плотности положительного контроля, и пробу сыворотки с S/P-отношением ниже 0,2 расценивают как отрицательную, с S/P-отношением, равным 0,21 - 0, 23 - сомнительную, больше или равным 0,24 - положительную.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018117226A RU2684417C1 (ru) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018117226A RU2684417C1 (ru) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2684417C1 true RU2684417C1 (ru) | 2019-04-09 |
Family
ID=66089852
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018117226A RU2684417C1 (ru) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2684417C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2323743C2 (ru) * | 2006-05-22 | 2008-05-10 | Российская академия сельскохозяйственных наук, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) | Способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей |
-
2018
- 2018-05-08 RU RU2018117226A patent/RU2684417C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2323743C2 (ru) * | 2006-05-22 | 2008-05-10 | Российская академия сельскохозяйственных наук, Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии) | Способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| KIM M.C. et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction. Avian Pathol. 2008 Apr; 37(2): 171-7 * |
| WOOLCOCK P.R. Duck Virus Hepatitis. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 2.3.8. Retrieved 15 September 2011; p.1-14 [Найдено 21.11.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.08_DVH.pdf . . * |
| WOOLCOCK P.R. Duck Virus Hepatitis. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 2.3.8. Retrieved 15 September 2011; p.1-14 [Найдено 21.11.2018] [он-лайн]. Найдено из Интернет: URL: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.03.08_DVH.pdf . KIM M.C. et al. Differential diagnosis between type-specific duck hepatitis virus type 1 (DHV-1) and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction. Avian Pathol. 2008 Apr; 37(2): 171-7. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hirst | The quantitative determination of influenza virus and antibodies by means of red cell agglutination | |
| CN113009153B (zh) | 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 | |
| Sikder et al. | Seroprevalence of Salmonella and Mycoplasma gallisepticum infection in the six model breeder poultry farms at Patuakhali district in Bangladesh | |
| EA014533B1 (ru) | Способы обнаружения вирусов гриппа | |
| Webb et al. | The measurement of specific antibodies in Bolivian hemorrhagic fever by neutralization of virus plaques | |
| Chua et al. | Performance evaluation of five detection tests for avian influenza antigen with various avian samples | |
| Ma et al. | Evaluation of a new serological technique for detecting rabies virus antibodies following vaccination | |
| RU2674076C1 (ru) | Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2684417C1 (ru) | Способ определения специфических антител к вирусу гепатита утят типа i | |
| CN1928562B (zh) | 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒 | |
| RU2323743C2 (ru) | Способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей | |
| Maduike CO et al. | Modification of the passive heamagglutination test for detection of infectious bursal disease virus | |
| RU2202797C2 (ru) | Набор для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц | |
| RU2192012C2 (ru) | Способ определения антител к антигену реовирусного теносиновита кур | |
| RU2431148C1 (ru) | Способ получения "диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом культурального, поливалентного для непрямого метода иммунофлюоресценции" | |
| Jahan et al. | Sero-surveillance of infectious Laryngotracheitis in layer birds in Bangladesh. | |
| RU2815532C1 (ru) | Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц и идентификации подтипа гемагглютинирующего вирусного агента в реакции торможения гемагглютинации | |
| RU2488117C2 (ru) | Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета | |
| RU2738900C1 (ru) | Диагностический набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9 в реакции торможения гемагглютинации | |
| RU2810589C1 (ru) | Способ постановки реакции иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| Abbas et al. | Seropositivity, involvement in suspected cases of chronic respiratory diseases and comparative efficacy of various sero-diagnostic tests of Mycoplasma gallisepticum | |
| Leland et al. | Virus isolation | |
| US20080032315A1 (en) | Method and Kit for Determining the Immunisation Status of a Person | |
| Bibi et al. | Seroprevalence of Mycoplasma gallisepticum in non Vaccinated broiler flocks in Abbottabad Khyberpakhtunkhwa, Pakistan | |
| RU2305842C1 (ru) | Гемагглютинационный тест на основе рекомбинантного антигена для серодиагностики сифилиса |