UA141590U - Імуноферментна тест-система для серологічної діагностики метапневмовірусної інфекції курей та індиків - Google Patents

Abstract

Імуноферментна тест-система для серологічної діагностики метапневмовірусної інфекції курей та індиків містить специфічний антиген штаму "PVT-09/В" метапневмовірусу індиків, інактивований етиленіміном (ЕІ) у залишковій концентрації 1 %, адсорбований на поверхні полістиролових лунок в карбонатно-бікарбонатному буфері, контрольні позитивні сироватки, отримані до антигену "PVT-09/B", контрольну негативну сироватку, буферний розчин. Додатково містить кон'югат (Goat)anti-Chicken, натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний, натрій фосфорнокислий однозаміщений 2-водний, натрій хлористий, хромоген (орто-фенілендіамін), детергент Твін-20, субстратно-індикаторну суміш АБТС з перекисом водню, стоп-реагент і панелі для постановки реакції імуноферментного аналізу.

Description

Корисна модель належить до області ветеринарної вірусології, біотехнології, а саме стосується імуноферментної тест-системи для серологічної діагностики метапневмовірусної інфекції курей та індиків. Використання високопродуктивних іноземних кросів птиці, завезених із різних країн світу, призвело до появи та поширення на території України нових вірусних хвороб, однією з яких є метапневмовірусна інфекція курей та індиків. Для серологічної діагностики з метою виявлення АТ до метапневмовірусної інфекції птиці розроблено різні аналітичні методики: реакція непрямої імунофлуоресценції (РНІФ), реакція затримки гемаглютинації (РЗГА), реакція нейтралізації (РН), реакція дифузної преципітації (РДП); імуноферментний аналіз (ІФА), імунодифузії (РІД), метод імуноцитохімії. Недоліки їх полягають у неможливості порівняння отриманих результатів із-за різниці діагностичних титрів та чутливості цих тестів.

Відома методика реакції нейтралізації (РН) за допомогою якої можна вивчати властивості пневмовірусу. Для цього використовують різні культури клітин: ТОК, Мего, ВОМ, МА1ІО4, СЕРН.

Для постановки реакції нейтралізації необхідно мати еталонні, адаптовані до курячих ембріонів (КЕ), штами вірусу. Найчастіше використовують шт. ВОТ 1 2 8544: » - 1030 ТЦіІДрвьо/см3, який викликає загибель КЕ через 24 години. |Пневмовирусная инфекция птиц (зпизоотология, диагностика) /Б.Б. Трефилов, Н.В. Никитина, Д.В. Дмитриев и др.| //Акту ал. пробл. вет. медицинь!: научно-практ. конгр. 24-25 августа 2007 г. - СПб, 2007. - С. 210-2111.

Відома методика реакції дифузної преципітації (РДП), яка використовується для швидкої діагностики гострих випадків хвороби, оскільки АТ можна виявити на 7-й день з початку виникнення захворювання (оптимальний термін - 15 днів). Проте за допомогою РДП антитіла виявляють лише у 10-1595 випадків. У разі виявлення великого відсотка преципітуючих сироваток, стадо птиці вважають неблагополучним щодо МІВ - інфекції. (Биргер М.О.

Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.

Медицина, 1982. - С. 129-140).

Найбільш близьким аналогом за технічною суттю до Тест-системи ІФА, що заявляється, є методика реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) (Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В.

Реакция непрямой гемагглютинации /В.Н. Сюрин, Белоусова Р.В., Фомина Н.В. //Ветеринарная вирусология. - М., 1984. - С. 323-327).

Суть реакції - еритроцити, на яких попередньо адсорбують антигени (антитіла), набувають

Зо властивості аглютинуватися у присутності гомологічних сироваток (антигенів). Еритроцити при цьому виконують роль носіїв із специфічними детермінантами, аглютинація яких відбувається в результаті реакції антиген-антитіло та реєструється візуально за характером сформованого осаду або аглютинатів. Для діагностикуму можуть бути використані еритроцити різного видового походження. Найбільш широко використовують формалінізовані, танізовані та сенсибілізовані еритроцити барана.

Компоненти реакції: - антиген "РМУТ-09/В" метапневмовірусу індиків; - сенсибілізовані формалінізовані і танізовані еритроцити барана; - буферні фізіологічні розчини рін-6,4 та рн-7,2 - контрольна позитивна сироватка; - контрольна негативна сироватка.

Для постановки реакції використовували 9б-лункові "М-подібні" мікропанелі. Перед постановкою РНГА позитивну і негативну сироватки крові виснажували шляхом прогрівання на водяній бані за температури 56 "С протягом 30 хвилин. Починаючи з 1 по 10 лунки, вносили буферний фізіологічний розчин рН (7,2-7,4) в об'ємі по 0,04 см3. Гіперімунну сироватку крові вносили у 1 лунку в об'ємі 0,04 см3 і проводили її послідовне розведення по 0,04 см3. З 10-ї лунки залишок (0,04 сму) видаляли. Флакон з еритроцитарним антигеном перед використанням ретельно струшували. В кожну лунку вносили по 0,02 см3 сенсибілізованих еритроцитів.

Результат враховували за чотирибальною системою згідно з формою осаду еритроцитів через 30 та 60 хвилин після постановки реакції. За титр сироватки в РНГА приймали те максимальне її розведення, що обумовлювало аглютинацію еритроцитів, - на дні лунки утворювалась чітка "парасолька". Негативною реакцію визначали при утворенні з еритроцитів осаду у вигляді "гудзика" з рівними краями. Це рішення може бути прототипом. Недоліком близького аналога є: - витрати на утримання барана з метою отримання дефібринованих еритроцитів; - трудомісткість і тривалість даного методу при отриманні формалінізованих еритроцитів, - термін зберігання формалінізованих еритроцитів до 6 міс.; - технологія обробки самих еритроцитів; - трудомісткість і тривалість даного методу, що вимагає для постановки одного робочого дня, що обмежує можливість одночасного дослідження великої кількості зразків сироваток крові.

В основу корисної моделі поставлена задача розробити імуноферментну тест-систему для серологічної діагностики метапневмовірусної інфекції курей та індиків, що містить специфічний антиген штаму "РМТ-09/8" метапневмовірусу індиків, інактивований етиленіміном (ЕЇ) у залишковій концентрації 1 96, адсорбований на поверхні полістиролових лунок в карбонатно- бікарбонатному буфері, контрольні позитивні сироватки, отримані до антигену "РМУТ-09/В", контрольну негативну сироватку, буферний розчин шляхом додавання кон'югату (Ссоадапії-

Спіскеп, натрію фосфорнокислого двозаміщеного 12-водного, натрію фосфорнокислого однозаміщеного 2-водного, натрію хлористого, хромогену (орто-фенілендіамін), детергенту твін- 20, субстратно-індикаторної суміші АБТС з перекисом водню, стоп-реагенту, щоб забезпечити ефективність тест-системи ІФА. Тест-система дозволяє проводити діагностику метапневмовірусної інфекції курей та індиків з високою чутливістю.

Згідно з "ТУ У24.4-00497169-001:2018", один комплект тест-системи розрахований для проведення на одному планшеті одночасного аналізу - 92 досліджувані проби сироваток крові в одному розведенні і 2 контрольних сироватки (у двох повторах) Одна тест-система розрахована на дослідження 184 проб сироваток крові в одному розведенні.

Отже, корисна модель, що заявляється, має істотні відмінності і характеризується новою сукупністю ознак, що дозволяє отримати більш високий очікуваний ефект на відміну від близького аналога, що відповідає критерію "новизна".

Основна перевага пропонованої корисної моделі полягає в тому, що як антиген використовується штам "РМТ-09/В", який циркулює серед поголів'я індиків у птахогосподарствах

України.

Техніко-економічна ефективність: - безпека (використовується інактивований антиген); - зручність роботи (автоматизація проміжних стадій реакцій); - використання приладу - спектрофотометра, за допомогою якого за кілька секунд можна виміряти поглинання світла в 96 лунках планшета і отримати об'єктивні показники оптичної щільності досліджуваних проб сироватки крові, що дозволяє значно збільшити кількість проведених аналізів і спростити методичну процедуру виконання ІФА. Діагностичні параметри і показники якості розробленої тест-системи ІФА для серологічної діагностики

Зо метапневмовірусної інфекції курей та індиків відповідають вимогам стандартів МЕБ (Керівництво по діагностиці та виробництва вакцин, видання МЕБ, 2004. - С. 21-29).

До складу пропонованої тест-системи ІФА входять компоненти: - полістиролові 96-ямкові мікропланшети фірми "МШОМС" для імуноферментного аналізу, адсорбовані очищеним антигеном метапневмовірусу штаму "РМТ-09/В" індиків у концентрації 6 мкг/см3У, - 4 шт.; - позитивна сироватка крові курей ліофілізована, 1,0 см - 1 флакон або 1 ампула; - позитивна сироватка крові індиків ліофілізована, 1,0 см3-1 флакон або 1 ампула; - негативна сироватка крові курей ліофілізована, 1,0 сме-1 флакон; - негативна сироватка крові індиків ліофілізована, 1,0 см9-1 флакон; - антиген індиків - планшет з іммобілізованим, очищеним, інактивованим антигеном метапневмовірусу індиків, 2 шт. в упаковці; - кон'югат ((Соад)апіі-Снпіскеп: НАРО Сопіцдагїе, ргезегуєд м/йй депіатісіп апа Каїйоп) розчин 20,0 см3-1 флакон; - буферний розчин (0,05 М трис-НСІ-0,2 М Масі) для розведення дослідних і контрольних зразків і міжетапних промивань, 400,0 см - 2 флакони; - детергент твін-20, 0,4 см3-2 флакони; - субстратно-індикаторна суміш АБТС (2,2'-азино-ди(3-етил) бензтіазолін-сульфонова кислота) з перекисом водню, 20,0 см3-1 флакон; - стоп-реагент (1 95 розчин натрію додецил сульфату), 10,0 см3-2 флакони.

Приготування компонентів набору. 1. Приготування робочих буферів: 11. Адсорбційний 0,01 карбонатно-бікарбонатний буферний розчин (КББ рН 9,6), призначений для розчинення і сорбції антигену в лунці планшетів. З маточного розчину беруть 5 см3, додають ще 95 см" дистильованої води і 10-20 мг мертіоляту. Цей розчин використовують в реакції (0,01 М КББ рн 96). 1.2. Фосфатно-буферний розчин з твін-20 призначений для розведення контрольних, досліджуваних сироваток і промивання панелей. Вміст флакона з 10-кратним концентратом фосфатно-буферного розчину з твін-20 доводять дистильованою водою до 1000 см. Робочий розчин буфера являє собою безбарвний розчин із рН 7,2-7,4.

1.3. Робочий хромоген-субстратний розчин. Розчин готують безпосередньо перед використанням. Для цього 4 мг ОФД розчиняють в 10 см" фосфатно-цитратного буфера і додають 0,14 сму З 95 розчину перекису водню. Розчин повинен бути прозорим і мати світло- жовтий колір. 2. Приготування антигену:

В тест-системі ІФА, що заявляється, призначеної для виявлення і кількісного визначення антитіл до метапневмовірусної інфекції курей та індиків, специфічний антиген готують використовуючи метапневмовірус штам ""МТ-09УВ" індиків.

Штам "РМТ-09/В" індиків метапневмовірусу типу В, був ізольований від клінічно хворих індиків ТОВ "Українська продовольча група" Чернівецької області у 2011 році в Інституті птахівництва (нині Дослідна станція птахівництва) НААН України і прийнятий заявником як виробничий, має високу біологічну, антигенну та імуногенну активність, зберігає свої нативні імунобіологічні властивості після інактивації в нативному вигляді та після інактивації, продукується в чутливих біологічних системах культивування, придатний для виготовлення високочутливих і специфічних діагностикумів.

Приклад 1

У тест-системі, що заявляється, антиген метапневмовірусу готують наступним чином:

Для накопичення вірусу використовували первинну культуру фібробластів ембріонів курей (КК ФЕК) або культуру фібробластів ембріонів перепелів (КК ФЕП), які отримували із шкірно- м'язової тканини 10-11-добових курячих або б-денних перепелиних ембріонів. Для інфікування моношару використовували ліофілізований штам РМТ-09/В метапневмовірусу індиків.

Інфекційний титр ізольованого вірусу визначали на основі обліку ЦПД (тканинна цитопатогенна доза) вірусу на КК ФЕК та КК ФЕП методом десятиразових розведень з відповідними контролями. Величину титру визначали за методом Нева І... 5. Миепсп Н. (1938) і виражали у Ід

ТЦдДово в 1,0 см. Інфекційний титр вірусу не повинен бути нижче 2,0 Ід ТЦДрво/см3. Як інактивант використовували етиленімін (ЕІ). Робочий розчин інактиванту готували шляхом розведення комерційного препарату фізіологічним розчином до 10 95 концентрації з рН 7,4. Інактивацію метапневмовірусу проводили 0,1 95 розчином етиленіміну (ЕЇ). У флакони ємкістю 1,5 л вносили підготовану вірусутримуючу рідину відомого об'єму й доводили її температуру до 37,050,5 "С.

Зо Потім повільним струменем вводили необхідну кількість робочого розчину ЕЕ! при безперервному перемішуванні компонентів реакційного середовища, до одержання 0,1 9б5-ї кінцевої концентрації інактиванту (до 9 об'ємів вірусовмісної рідини додавали 1 об'єм робочого розчину ЕїЇ). Повноту інактивації визначали проведенням 3-х послідовних "сліпих" пасажів на культурі клітин 10-добових РЕ КЕ. Культуральну розплодку штаму РМТ-09/В метапневмовірусу двічі заморожували за температури мінус 20 "С з наступним відтаюванням за температури плюс 4 "С; попереднє очищення вірусу здійснювали шляхом видалення клітинного дебрису з культуральної рідини шляхом центрифугування при 1000-2000 9 протягом 15-20 хв за температури плюс 4"С та отримання супернатанту, вірус змішували з ПЕГ-6000 (поліетиленгліколем) у концентрації 7 95 від загального об'єму і витримували за температури плюс 4 "С. Після цього проводили центрифугування при 12000 9 протягом 90 хв за температури плюс 4 "С. Отримані осади ресуспендували у ТЗЕ-буфері (трис-сольовому буфері, рН 7,6).

Концентрований антиген центрифугували через 20-30 95 розчин сахарози при 70000-76000 49, за температури плюс 4 "С протягом 2-3 годин, після чого осад був ресуспензовано у Т5Е-буфері (до 10 мл).

Приклад 2. Виготовлення контрольних сироваток

На інтактних курчатах та індичатах, вільних від специфічних антитіл до збудників вірусних хвороб (ньюкаслської хвороби, реовірусної інфекції, метапневмовірусної інфекції), отримано дві серії гіперімунної сироватки з титрами антитіл в ІФА не нижче розведення 1:3200. Від клінічно здорових курчат та індичат З0-добового віку, які вирощувалися у камеральних умовах, отримували негативні сироватки крові. Загальний пул сироватки використовували для негативного контролю в ІФА. 2а. Одержання гіперімунної сироватки крові до метапневмовірусу.

Використовували курчат та індичат З30-добового віку, вільних від антитіл до збудників ньюкаслської хвороби, інфекційної бурсальної хвороби, інфекційного бронхіту курей та метапневмовірусної інфекції. Гіперімунізацію здійснювали шляхом триразового введення очищеного, концентрованого та інактивованого метапневмовірусного антигену за схемою: - перша імунізація - внутрішньом'язово у об'ємі 0,5 см; - друга імунізація - внутрішньом'язово у об'ємі 0,5 см3 через 14 днів після першої імунізації; - третя імунізація - очищений, концентрований та інактивований антиген метапневмовірусу попередньо змішували з ад'ювантом "Монтанід" ІБА-70" у співвідношенні 30:70 і вводили бо внутрішньом'язово в об'ємі 0,5 см через 2 тижні після другої імунізації.

Активність сироватки після ліофілізації перевіряли в ІФА. 26. Одержання нормальної контрольної сироватки крові.

Негативну (контрольну) сироватку, вільну від специфічних антитіл до метапневмовірусу, отримували з благополучного щодо інфекційних захворювань птахогосподарства. Сироватку крові одержували з крові інтактних курчат та індичат віком 90 діб методом тотального знекровлення. Сироватку перевіряли в ІФА з пневмовірусним антигеном. Специфічних антитіл до збудника МПВІ не було виявлено.

Отримані специфічні позитивні до метапневмовірусу та негативні сироватки крові заморожували, зберігали за температури мінус 20 "С і використовували для контролю в тест- системі.

Приклад 3. Стандартизація основних умов проведення досліджень тест-системою ІФА, що заявляється.

Оптимізацію параметрів постановки реакції для виявлення антитіл до метапневмовірусу птиці проводили згідно з імуноспецифічними та неспецифічними компонентами діагностичної тест-системи, а саме вплив температури та часу, що необхідні для сорбції антигену у лунках планшета. Для отримання активного твердофазного імуносорбенту використовували планшети фірми "Мипс" (Данія).

Для визначення робочої концентрації антигену, що іммобілізується у трьох повторах, досліджували ефективність реакції контрольної референтної сироватки в розведенні 1:400 з різними концентраціями іммобілізованого антигену, який вносили в об'ємі 100 мкл в кожну лунку і проводили його адсорбцію протягом 16 годин за температури плюс 4 "С. Розподіл середніх оптичних показників (ОП) реакції відповідно до досліджуваних розведень антигену поступово змінювався. Стан антигену оцінювали за активністю реакції з контрольними сироватками у розведеннях від 1:100 до 1:12800. В діапазоні розведення 1:200 (Ірах-2,301) спостерігався ефект "плато", що свідчило про надлишок антигену; у лунках. Надалі відбувалося зниження оптичних показників пов'язаних з розведеннями антигену. Таким чином, для іммобілізації на планшети як робоче розведення була вибрана концентрація антигену 1:200.

Кон'югат використовували комерційний. У процесі постановки реакції досліджені і контрольні сироватки та кон'югат інкубували за температури плюс 37 "С протягом 30 хвилин. Як промивну

Зо буферну систему, що забезпечувала специфічність іммуноферментного аналізу, використовували 0,05 М трис-НСЇІ з 0,2 М Масі та 0,1 95 твін-20, рН 7,4-7,6.

Даним умовам відповідають такі параметри реакції: концентрація антигену - 6 мкг/см3 (0,025 мкл на лунку в об'ємі 0,1 сму), розведення контрольних сироваток - 1:400. Оптимальним часом для адсорбції антигену була 16-годинна його інкубація за температури плюс 4 (-1)"С, для сироваток цей час становить 30 хвилин за температури плюс 37 (-1)"70.

Обраховано формулу титрів антитіл у сироватках крові курчат при тестуванні їх в одному розведенні: ІДТ-3,8071--0,8420-1д (Б/Р 400).

Приклад 4

Оцінку чутливості та специфічності тест-системи було проведено шляхом порівняльного аналізу результатів тестування сироваток у тест-системі ІФА, що пропонується з ІФА-тест- системою фірми "ІШЮЕХХ" (США) (креслення). Паралельно порівнювали 60 сироваток крові курчат з різною активністю (30 сироваток від курей, що не щеплювали від метапневмовірусної інфекції (МПВІ) та 30 сироваток крові курчат, щеплених від МПВІ.

У нещеплених проти МПВІ індиків титри антитіл до метапневмовірусу коливалися від 0 до 223 (ІФА, що розробляється) за ПНП 950, тоді як використанням тест-системи фірми "ІЮЕХХ" - від О до 302 за ПНП 396.

У щепленої птиці титри антитіл в ІФА, що заявляється, знаходились в межах від 3352 до 8105, в ІФА "ІЮЕХХ" - від 2946 до 6044. Простежується 100 95 повторюваність результатів за двома діагностикумами. Титри антитіл при різних позитивно-негативних порогах, визначені двома ІФА тест-системами, що заявляється, та "/"ЮЕХХ" (США) наведені на кресленні.

Відтворюваність визначали за різницею сигналів одного зразка сироватки в чотирьох повторах. Кількісно відтворюваність оцінювали за розбіжністю результатів. Вона виражається величиною стандартного або середнього квадратичного відхилення.

Коефіцієнт варіації між лунками одного планшета та між планшетами обчислювали за формулою: см - х- х10096 ср , де: с'- середньоквадратичне відхилення,

Хор - середнє арифметичне значення ОГ всіх досліджуваних зразків.

Крім того, досліджували показники негативних і позитивних контролів тест-системи (у 20-ти повторах для позитивного контролю та 10-ти - для негативного). При цьому СМ стандартних відхилень від середнього значення позитивних контролів не перевищувала 20 95, негативних - 10 95. Відтворюваність, яку визначали за відсотком розбіжності від середнього значення ОГ зразків однієї сироватки у 15 повторах, склала 3,26 95 для позитивної сироватки і у 10 повторах 1,4 95 - для негативної сироватки.

Приклад 5 Ілюстрація застосування тест-системи ІФА. Підготовка реагентів для проведення аналізу

Всі розчини повинні бути перед роботою доведені до кімнатної температури - 18-20 "С.

Розчин Ме 1. Буферний розчин для розведення контрольних сироваток, дослідних зразків та міжетапних промивань - до вмісту флакона з буферним розчином додають вміст флакона з детергентом твін-20. Розчин зберігають за температури від 2 "С до 8 "С не більше 1-го місяця.

Розчин Мо 2. Вміст флакона з ліофільною позитивною сироваткою крові розчиняють у 1,0 сму розчину Мо 1 при обережному струшуванні флакона. Підготовану сироватку зберігають за температури від мінус 10 "С та нижче не більше 1-го місяця. Протягом терміну придатності розморожування допускається один раз.

Розчин Ме 3. Вміст флакона з ліофільною негативною сироваткою крові розчиняють у 1,0 см3 розчину Мо 1 при обережному струшуванні флакона. Підготовану сироватку зберігають за температури від мінус 10 С та нижче не більше 1-го місяця. Протягом терміну придатності розморожування допускається один раз.

Розчин Мо 4. Розчин кон'югату зберігають за температури від плюс 4 "С.

Методика проведення аналізу

Розведення сироваток. Зразки контрольних і дослідних проб сироваток крові птиці розводять 1:400. Для цього до 0,005 см3 сироватки крові додають 2 см розчину Мо 1 і ретельно змішують. 1) Із комплекту тест-системи беруть планшет, у лунках якого адсорбований очищений антиген метапневмовірусу, та використовують для постановки імуноферментного аналізу; 2) у лунки АТ та ВІ вносять контрольну негативну сироватку крові курей або індиків по 0,1 см3, розведену 1:400;

Зо 3) у лунки С1 та 01 вносять контрольну позитивну сироватку крові курей або індиків по 0,1 см3, розведену 1:400; 4) у вільні лунки вносять по 0,1 см3 зразків негативних сироваток крові курей або індиків з внутрішньовиробничої панелі, розведені 1:400, у трьох повторах; 5) планшет обережно струшують і поміщають у термостат за температури 37 (-1)"С на 30 хвилин; б) рідину з лунок планшета видаляють і промивають розчином Мо 1 в об'ємі 0,3 см3 на лунку тричі (автоматично або за допомогою багатоканальної піпетки), після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу; 7) у лунки вносять по 100 мкл (0,1 сму) кон'югату (розчин Ме 4). Витримують 30 хвилин у термостаті за температури 37 (-1)"С; 8) рідину з лунок планшета видаляють і промивають розчином Ме 1 в об'ємі 0,3 см3 на лунку тричі (автоматично або за допомогою багатоканальної піпетки), після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу; 9) у лунки, що використовуються в постановці реакції, вносять по 0,1 см субстратно- індикаторної суміші, витримують за кімнатної температури при 22-25 "С протягом 15 хвилин у термошейкері у режимі струшування або у темному місці; 10) реакцію зупиняють внесенням до лунок по 0,1 см3 стоп-реагенту.

Приклад 6. Облік та інтерпретація результатів

Облік результатів реакції проводили спектрофотометрично при довжині хвилі 405 нм проти 450 нм. Для обліку реакції достовірним вважають, якщо розбіжність між середніми значеннями позитивної та негативної контрольних сироваток (РСх-МСх) знаходиться в діапазоні 0,36-0,98.

Якщо одержані значення виходять за межі цих показників, результати вважають недостовірними і реакцію повторюють. Розрахунок середнього значення ОГ нормальних сироваток для кожного розведення проводили з додаванням трьох значень стандартного відхилення. Середнє значення ОГ нормальних сироваток плюс потрійне значення стандартного відхилення склало 0,167. Середні значення ОГ контрольних сироваток розраховували із суми

ОГ усіх розведень у трьох повторах. Для позитивної сироватки середнє значення ОГ склало 0,765, для негативної - 0,093, які були використані для розрахунку порогового 5/Р за формулою:

ОГдослідносироватки- МОХ в/Р

РСх -МОх де: МОХ середнє значення ОГ негативного контролю;

РОх- середнє значення ОГ позитивного контролю.

Для тестування сироваток в одному розведенні проведено перерахунок та вирахувано ПНП.

З/Рюз - М-нЗо, де: М - середнє значення 5/Р негативних сироваток;

О - стандартне відхилення; 0,5 Уопоріг - 1,339527: 8-0,167440;

З/Рпоз - 0,167-0,093-0,074-0,110; 0,765-0,093 0,672.

Таким чином, 5/Рлоз, що дорівнює нижньому позитивному титру антитіл до МПВ, дорівнювало 0,110.

Гав/Р - -0,9586.

За формулою розраховували найменший позитивний титр. 9 Ттіп-0,8420--3,8071; 9 Тюз-3,8071-0,8420714 (5/Р 400); 4 Тпюз - З3,8071-0,84207(- 0,9586) - 2,99;

Ттіп-1 0299-477.

Титр антитіл від 0 до 949 вважали негативним, а титр від 950 і вище позитивним.

Специфічність тест-системи визначають у реакції ІФА з використанням внутрішньовиробничої панелі негативних сироваток і розраховують за формулою (1): с---Мпх1009;

МІ п-- Мхр (у де С. специфічність системи у 95;

Міп - кількість істинно-негативних значень в даній системі;

Мхр. кількість хибно-позитивних значень.

Специфічність тест-системи ІФА з використанням внутрішньовиробничої панелі негативних сироваток повинна бути не нижче 95 95.

Підставою для встановлення діагнозу на метапневмовірусну інфекцію (МПВІ) птиці є виявлення специфічних антитіл у сироватках крові різних вікових груп, не щеплених проти МПВІ у титрах 1:850 та вище. Отже, отримані результати в умовах експерименту показали, що набір

ІФА, який заявляється для контролю метапневмовірусної інфекції є активним та специфічним і

Зо може використовуватися при проведенні епізоотологічного моніторингу щодо розповсюдження захворювання та визначенні напруженості імунітету у щепленої проти даної інфекції птиці. У порівнянні з закордонними аналогами вітчизняна ІФА-тест-система, що заявляється, буде дешевша у З рази, доступна для усіх спеціалізованих лабораторій ветеринарної медицини, а також є конкурентоспроможною та імпортозаміщуючою.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Імуноферментна тест-система для серологічної діагностики метапневмовірусної інфекції курей та індиків, що містить специфічний антиген штаму "РМТ-09/8" метапневмовірусу індиків, інактивований етиленіміном (ЕЇ) у залишковій концентрації 1 95, адсорбований на поверхні полістиролових лунок в карбонатно-бікарбонатному буфері, контрольні позитивні сироватки, отримані до антигену "РМТ-09/8", контрольну негативну сироватку, буферний розчин, яка відрізняється тим, що додатково містить кон'югат (Ссоадапіі-СпісКеп, натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний, натрій фосфорнокислий однозаміщений 2-водний, натрій хлористий, хромоген (орто-фенілендіамін), детергент Твін-20, субстратно-індикаторну суміш АБТС з перекисом водню, стоп-реагент і панелі для постановки реакції імуноферментного аналізу.