CN102898517B - 抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体，所述的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，所述的单克隆抗体1C16A24由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌，所述的单克隆抗体1E85A4由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌。本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可组成采用双抗体夹心ELISA方法检测西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高和特异性好的优点。

Description

抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及杂交瘤细胞株，该细胞株可分泌抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体。

背景技术

西尼罗河热和西尼罗河性脑炎是由西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)感染引起的，该病于1937年首次暴发于乌干达，随后迅速传播到非洲各地、欧亚和中东等地区，1999年，WNV首次登陆西半球，并迅速肆虐美国，是继炭疽事件之后，又一种导致全美恐慌的致病性微生物。目前，该病毒在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，加拿大和欧洲一些国家相继出现了人感染而死于西尼罗河脑炎的报道。虽然，迄今为止，中国尚未有发现WNV感染的临床病例，但中国南部的气候、地里环境复杂，含有多种传播WNV的蚊虫种类，具备有WNV传播的条件，再者，随着国际交流的日益频繁，WNV传人中国境内的可能性越来越大。

西尼罗河病毒属于黄病毒属，日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)群的成员之一，与日本脑炎病毒具有相近的免疫原性，其主要的传播媒介是蚊子。研究认为，WNV是目前发现宿主最多的虫媒病毒，至少能寄居于36种蚊子，而我国能传播WNV的蚊种就有11种。对我国而言，西尼罗病毒是一种全新的致病病毒，全民普遍易感，人群中又没有免疫屏障，其危险性之大。因此，提前做好防范及相应的技术储备为我国应对WNV的传人至关重要。

至今，具有保护性的疫苗尚未研制成功，临床上对于西尼罗河性脑炎尚未有特异性的治疗药物。但实践表明早期采取对症治疗可以大大减少西尼罗河脑炎的发病率和死亡率，因此西尼罗河热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。由于多数西尼罗河病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、头痛、全身肌肉酸痛等呼吸道症状，难以和其它发热性疾病和脑炎相鉴别。因此，灵敏、特异的早期诊断技术，对早期发现传染源，及时阻断西尼罗河病毒的传播途径至关重要。

目前，西尼罗河病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。其中病毒分离是西尼罗河病毒感染诊断的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求很高，必须具备III级生物安全实验室才能进行WNV的培养。虽然病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、快速，但分子诊断操作相对繁琐，对技术水平要求较高，较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果，再者，西尼罗河病毒感染患者出现病毒血症的时间特别短，血清中病毒核酸存在时间短暂，不利于病毒感染的早期诊断。抗体检测试剂目前已成为美国等国家主要诊断方法，但由于西尼罗河病毒与其它黄病毒特别是与日本脑炎病毒存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒疫苗的人群易发生抗体假阳性的反应结果，不能特异的诊断WNV的感染。

因此，选择一个适合的靶抗原建立抗原诊断试剂盒，不仅能够达到早期特异诊断疾病的目的，同时也能避免核酸检测中检测时限短的问题。西尼罗河病毒的非结构蛋白1(nonstructural protein1，NS1)是一种相对保守的糖蛋白，分子量为48kDa，其抗原性很强，且研究发现在西尼罗河热患者的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此，检测急性期病人血清中的循环NS1抗原可用于早期诊断西尼罗河病毒感染。目前已报道的几种检测西尼罗河病毒NS1的抗原捕获ELISA法，如VecTest的抗原检测方法，能在15min内快速检测出WNV的感染，但该方法的敏感性不好；MacDonald等利用黄病毒的交叉抗体4G4作为包被和检测抗体建立双抗体夹心，该方法能灵敏的检测到病毒培养上清中NS1蛋白，其最大检测限为1ng/ml，但该方法特异性不好，不能区分不同黄病毒的感染；Kyung Min Chung.等，用西尼罗河病毒NS1特异性单克隆抗体建立的双抗体夹心抗原检测方法，其敏感度、特异性和稳定性都有很多的提高。而我国目前尚未有任何WNV的抗原检测试剂的报道，因此，建立一种快速、可靠、标准化的实验室诊断西尼罗河病毒的早期抗原检测试剂已成我国预防和控制该疾病的重要手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供抗WNV-NS1(即，西尼罗河病毒的非结构蛋白1)的抗体，该抗体可作为西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂，且灵敏度高和特异性好。

本发明解决上述问题的技术方案如下所述：

本发明所述的抗WNV-NS1的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，单克隆抗体1C16A24是由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌的；单克隆抗体1E85A4是由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌的。分泌上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株已于2012年06月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，分泌单克隆抗体1C16A24的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201276；分泌单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201275。

上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可作为西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂，所述试剂可组成采用双抗体夹心ELISA方法的检测WNV-NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，所述的捕获抗体为上述单克隆抗体1C16A24，所述的检测抗体为上述单克隆抗体1E85A4。

上述免疫诊断试剂盒为常规的采用双抗体夹心ELISA方法的免疫诊断试剂盒，该试剂盒由用于包被上述捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的上述检测抗体、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液组成。上述试剂盒中，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，优选生物素。当所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，所述试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。所述的亲和素能与生物素以1∶4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提高检测的灵敏度。

本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4分别是由两株能分泌抗西尼罗河病毒NS1蛋白的杂交瘤细胞株分泌的，因此能特异性结合西尼罗河病毒的NS1蛋白的不同位点，可以实现准确、快速地检测出西尼罗河病毒，而与其它黄病毒属成员，如登革病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和黄热病毒无交叉反应。更进一步地，由本发明所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4所组成的免疫诊断试剂盒检测西尼罗河病毒NS1蛋白的灵敏度可达30pg/ml，检测西尼罗河病毒培养上清的最低滴度为61PFU/ml，而且快速、准确。

附图说明

图1是单抗1C16A24和单抗1E85A4免疫印迹图，是重组WNV NS1蛋白与单克隆抗体的反应，条带1为无关单抗，条带2为单抗1C16A24，条带3为单抗1E85A4，条带4为抗GST单抗。

图2是所述检测试剂盒检测西尼罗河病毒NS1蛋白的标准曲线图，其中

为检测西尼罗河病毒NS1蛋白的曲线，

为BSA对照。

图3是所述检测试剂盒的特异性分析结果图。

图4是所述检测试剂盒检测模拟WNV感染病人血清标本的结果图。

图5是所述检测试剂盒检测病毒感染的动物血清标本的结果图。

具体实施方式

例1

A、抗WNV-NS1蛋白的单克隆抗体1C16A24和1E85A4的制备

a.免疫抗原的制备

本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组WNV NS1蛋白。基因重组WNV NS1蛋白是用携带WNV NS1蛋白基因的一种大肠杆菌的工程菌株制备的，其制备按常规方法进行，详细的制备方法可参照使用手册。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量，免疫原鉴定结果见图2。

b.免疫小鼠

取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积WNV NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积WNV NS1抗原混匀乳化后免疫，共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射WNVNS1抗原100μg进行加强免疫。

c.免疫血清抗体效价测定

建立间接ELISA法测定免疫血清抗体效价。配制1μg/ml重组NS1蛋白的50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。次日，用含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液300μl/孔4℃过夜，弃液并拍干后真空干燥2～12小时，用铝膜袋真空包装4℃保存，用于鼠免疫血清抗体效价测定。于第四次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含0.1％BSA10mM PBS以10³～10⁶倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃30分钟，10mM PBS含0.1％Tween-20洗涤液洗板五次后，加入1∶1000倍稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μl/孔37℃30分钟，同上洗板后，加入TMB显色液，100μl/孔，室温避光显色10分钟，加100μl/孔1M H₂SO₄终止反应，测450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性来判断免疫血清的抗体效价。

d.杂交瘤制备和筛选

选择血清抗体效价达1×10⁶的小鼠，于融合前3天腹腔注射WNV NS1抗原100μg。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按10∶1的比例混合，45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将聚乙二醇溶液加入细胞。在37℃水浴中，在1min内缓慢加入1.0ml PEG，边加边轻轻摇匀，分别于1min、2min、3min、4min、5min内加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640培养基终止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中温度为37℃、5％CO2的培养箱中。次日于每孔加入100μl含次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT，Sigma)筛选培养基。以后每3天用此筛选培养基给培养物换液一次，直到细胞克隆形成。

为检测产生抗体克隆的存在，用上述间接ELISA法检测细胞培养上清。选择强阳性杂交瘤细胞进行了克隆化，用有限稀释法连续克隆化2～3次，共获得两株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别是保藏号为CCTCC-C201276(命名为WNV-M6)的杂交瘤细胞株和保藏号为CCTCC-C201275(命名为WNV-M4)的杂交瘤细胞株。所述的保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株和保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株已于2012年6月23日送交地址在中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

e.抗WNV NS1蛋白单克隆抗体腹水的制备和抗体纯化

采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞WNV-M6制备腹水获得单克隆抗体1C16A24，或者在小鼠体内接种杂交瘤细胞WNV-M4制备腹水获得单克隆抗体1E85A4。具体制备方法简述如下：

每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。大约1～2周后，将2×10⁶个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约1～2周后，用9号针头放腹水，可反复收集数次。腹水经离心澄清后4℃存放备用。

腹水抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法，腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，用0.1N盐酸调pH值至4.8，液体由清亮变混浊，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33ul辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4100mM磷酸盐缓冲液，并用0.1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置过夜，10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油于-80℃保存。

f.抗WNV NS1蛋白单克隆抗体亚类鉴定

用上述的间接ELISA法检测在本实施例中获得的阳性克隆以确定其产生的抗体亚类。即WNV NS1抗原包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清孵育，再分别与为1∶1000倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，这些抗体包括兔抗小鼠IgG1(美国ZYMEDLABORATORIES，INC，目录号61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目录号61-6820)。检测结果显示，杂交瘤细胞株WNV-M6分泌的单克隆抗体1C16A24和杂交瘤细胞株WNV-M4分泌的单克隆抗体1E85A4均为IgG1阳性。

g.鉴定WNV NS1蛋白单克隆抗体的特异性

(1)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析

分别用四个血清型重组WNV-NS1抗原、DV-NS1抗原、天然的DV抗原、JEV抗原和YFV抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。即在包被的微孔板中加入1μg/ml的本专利发明的单克隆抗体1C16A24和1E85A4，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H₂SO₄终止反应，测450nm吸光值(A₄₅₀)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体与重组的WNV NS1抗原产生很强的特异性反应，与其他黄病毒属成员，如乙型脑炎病毒、黄病毒和四个血清型登革病毒均无交叉反应。

表1WNV NS1单克隆抗体与重组的WNV NS1抗原间接ELISA反应结果

(2)间接免疫荧光法进行单克隆抗体特异性分析

分别用WNV感染的BHK21细胞，DV1、DV2、DV3、DV4、JEV和YFV感染C6/36细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，将本专利发明的单克隆抗体1C16A24和1E85A4按10μg/ml的浓度滴在不同的抗原孔中，每孔10μl，同时设阴性和阳性对照，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片放于染色缸中用10mM pH7.2PBS洗3次，吹干，加入荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，置37℃水浴箱中，孵育45分钟后，取出将抗原片洗涤4次，吹干，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。如表2结果显示WNVNS1单克隆抗体与固定在玻片上WNV抗原特异性结合，与其他黄病毒属成员，DV、JEV和YFV均无交叉反应。

表2WNV NS1单克隆抗体的免疫荧光检测结果

WNV

DV1

DV2

DV3

DV4

JEV

YFV

C6/36细胞

1C16A24

+

-

-

-

-

-

-

-

1E85A4

++

-

-

-

-

-

-

-

(3)免疫印迹分析法进行单克隆抗体特异性分析

将重组的WNV NS1蛋白，用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤维膜上，转印膜用含7％脱脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封闭6小时，将转印膜装在专门的反应板中，分别加入杂交瘤细胞培养上清中，4℃反应过夜，用含有0.5％Tween20的10mM PBS洗涤膜后，加入1∶500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。

免疫印迹结果如图1所示，本发明的2株单克隆抗体与重组WNV NS1蛋白特异性结合，结合蛋白相对分子质量为65千道尔顿。特异性蛋白质结合带与预测分子量为65千道尔顿相一致。说明获得的单克隆抗体能够特异性识别重组的WNV NS1抗原。

h.单克隆抗体识别位点分析

重组WNV NS1蛋白以1μg/ml加入50mM pH9.6碳酸盐缓冲液，0.1ml/孔包被聚苯乙烯微96孔板，4℃过夜。次日，加入含0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液0.3ml/孔4℃过夜后，先加0.15mg/ml单抗50μl/孔，再加1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记单抗50μl/孔，室温孵育1小时，0.5％Tween20的PBS洗涤五次后加入TMB显色液室温显色10分钟，测A₄₅₀吸光值。以单抗对同一HRP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值/阴性对照值)×100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关。表3结果显示2株单抗识别2个不完全相同的抗原位点。

表3抗WNV NS1单克隆抗体识别抗原位点测定

例2：

西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒的建立

1、本发明所述试剂盒由以下试剂组成：

(1)包被单抗1C16A24的微孔反应板；

(2)样品处理液：由2％的BSA、0.01Tween-20PBS组成；

(3)辣根过氧化酶标记的单抗WNV-M4；

(4)浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3gNaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；

(5)阳性对照：大肠杆菌表达的重组WNV NS1抗原，浓度为1μg/ml；

(6)阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH₂PO₄，58.02gNa₂HPO₄.12H₂O，175.3gNaCl，15磅20min高压灭菌，20倍稀释后加入0.1％Tween-20；

(7)显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的组成成分如下：

显色液A：

将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB0.25g，摇匀于4℃闭光保存；

显色液B：

将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀于4℃闭光保存；

(8)终止液∶1M H₂SO₄。

A、所述包被单抗1C16A24的微孔反应板的制备方法：将本发明单抗1C16A24用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)稀释至10μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃过夜。拍干后，每孔加入300μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。

B、所述辣根过氧化物酶标记的单抗1E85A4的制备方法：将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配0.1M过碘酸钠避光搅拌30min，于1mM PH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，次日用0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液调节10mg抗体至PH值为9.5，加入透析后的醛化酶，同样用0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液调节PH值至9.5。室温避光轻轻搅拌2～3h，然后加入0.1ml新配4mg/ml硼氢化钠，4℃避光过夜，次日冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调PH至7.2)，4℃静置6h后，4℃12000rpm离心30min，弃上清，用适量1×PBS缓冲液重悬沉淀物，4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入含终浓度1％BSA、50％甘油保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即为工作液。

2、本发明所述试剂盒的使用方法：

(1)样品检测

取待测的样品10μl，加入样品处理液90μl，混匀后加入1C16A24包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板五次后，加入1∶500稀释的HRP标记的单抗1E85A4，100μl/孔，室温30min，同上洗板八次后加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。

(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.10，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。

例3：

本发明所述WNV-NS1抗原免疫诊断试剂盒的敏感性和特异性测定

(1)灵敏度测定

将重组WNV-NS1从1000ng/mL开始倍比稀释若干梯度，用上述建立的方法检测WNVNS1蛋白，同时检测相同浓度的四个血清型登革病毒NS1蛋白和BSA作为阴性对照。以BSA的检测值作为标准，以检测值大于或等于相同BSA浓度检测值的2.1倍的WNV NS1的最低浓度作为本方法检测该抗原的灵敏度。结果如图2和表4所示，当重组WNV-NS1稀释至30pg/ml时，A₄₅₀＝0.0345，是相应浓度的BSA对照(A₄₅₀＝0.011)的3.14倍，当重组WNV-NS1稀释至15pg/ml时，A₄₅₀＝0.026，是相应浓度的BSA对照(A₄₅₀＝0.011)的2.36倍，因此根据上述判断标准，本发明试剂盒检测WNV-NS1的最低浓度为15pg/ml，保守地说，灵敏度也可高达30ng/ml。

表4本发明试剂盒检测不同浓度重组NS1的结果

(2)检测相关病毒的特异性和灵敏度分析

通过对WNV(chin-01)、WNV(ny99)、DV1、DV2、DV3、DV4、JEV、YFV、TBEV进行空斑实验确定病毒滴度分别为1×10⁷PFU/mL、1×10⁸PFU/mL、2.7×10⁵PFU/mL、2.4×10⁵PFU/mL、4.7×10⁵PFU/mL、1.6×10⁶PFU/mL、3×10⁵PFU/mL、3×10⁵PFU/mL、1×10⁸PFU/mL。采用上述建立的方法检测灭活的WNV、DV1、DV2、DV3、DV4、JEV、YFV、TBEV，从1×10⁶PFU/mL开始倍比稀释多个梯度进行检测。本发明试剂盒的检测结果显示对WNV培养上清的检测灵敏度高达6.1PFU/0.1ml，而对其他病毒的检测结果均为阴性，如图3所示。

例4

本发明所述WNV-NS1抗原免疫诊断试剂盒的临床试验

首先将临床血清标本用样品稀释液按1∶10稀释后用上述建立的方法进行检测。

(1)本发明试剂盒检测正常人血清

本发明的试剂盒检测了1000例正常人血清，用此检测结果确定本方法的临界值。对检测值进行分析，计算得平均值为0.01，标准差为0.0031，以平均值加上5个标准差作为本方法的检测临界值即：0.01+0.0031×5＝0.0253，以大于或等于临界值作为判断检测值阳性标准，1003例正常人血清均为阴性，可确定本方法的特异度为100％。

(2)本发明试剂盒检测模拟病人血清结果

本发明的试剂盒检测了模拟WNV病毒感染的病人血清标本，将已知病毒滴度的西尼罗河病毒加入到正常人血清标本中，37℃孵育1小时后，用正常人血清标本作为稀释液，对模拟病人血清标本进行梯度稀释后检测，本发明试剂盒检测模拟病人血清标本的最低检测限为488pfu/ml，图4是本发明试剂盒检测模拟病人血清标本结果。

(3)本发明试剂盒检测WNV感染的动物血清

本发明试剂盒检测西尼罗河病毒和乙型脑炎病毒感染的动物血清标本，本发明试剂盒在病毒感染第一天便能检测到感染动物血清中的NS1抗原，其中以感染第三、四天检测的NS1蛋白含量最高，随后血清中NS1抗原逐渐减低。图5是本发明试剂盒检测不同感染时间动物血清标本中NS1抗原敏感性结果。

(4)本发明试剂盒检测相关病毒感染病人急性期血清

本发明的试剂盒检测了107例2005年广州地区DV1感染患者急性期血清，这些血清同样经病毒分离或RT-PCR确定为DV1阳性，而且用我们前期工作中建立的检测DV1NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测为阳性；本发明试剂盒对以上血清的检测结果均为阴性，进一步说明本发明的试剂盒的特异性非常好。

Claims (3)

1.一种抗WNV-NS1的单克隆抗体1C16A24，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C201276的杂交瘤细胞株分泌的，且，所述的单克隆抗体1C16A24为小鼠IgG1亚类的单克隆抗体。

2.一种抗WNV-NS1的单克隆抗体1E85A4，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C201275的杂交瘤细胞株分泌的，且，所述的单克隆抗体1E85A4为小鼠IgG1亚类的单克隆抗体。

3.一种采用双抗体夹心ELISA方法检测西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其特征在于，所述的捕获抗体为权利要求1所述的单克隆抗体1C16A24，所述的检测抗体为权利要求2所述的单克隆抗体1E85A4。

Images