CN101768218A - 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用。本发明以超离纯化的猪圆环病毒II型作为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞融合，经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为8-60、10-48，对其生物学特性进行鉴定，并将其作为一抗，建立了间接免疫荧光诊断方法。该间接免疫荧光诊断方法，与PCR诊断方法的结果基本一致，阳性和阴性符合率分别为93.75％和100％，为预防和治疗猪圆环病毒病提供了参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，特别是一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及其应用。
背景技术
近年来新出现的断奶后仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)是一种以发烧、渐进性消瘦、呼吸和消化系统紊乱为特征的猪病，目前多个国家和地区存在该病的流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2)被认为是PMWS的主要病原，此外其还与多种其他猪病有关，如猪呼吸道病综合症、猪皮炎肾病综合症等。
目前，国内外许多学者已经建立了多种诊断方法来检测猪圆环病毒2型及其抗体，例如检测病原的多聚酶链式反应(PCR)技术、原位杂交方法、免疫组化方法等和检测抗体的间接免疫荧光技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)方法等，但这些诊断方法有诊断周期长、成本高等局限性，不太适用于临床诊断的快速、普及应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处而提供一种可用于建立一种特异、敏感和快速的间接免疫荧光诊断方法来检测猪圆环病毒II型的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的还在于提供一种由上述制备方法生产的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体。
本发明的再一个目的还在于提供一种由上述方法制备的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的应用。
本发明的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：
(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解，蛋白含量测定仪测定其质量浓度，-70℃～80℃冻存备用；
(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天，三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在107以上的小鼠在细胞融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，
(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；
(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞。
所述的制备方法还包括将取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射杂交瘤细胞0.5mL(含5×105～1×106个杂交瘤细胞)/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，去除油脂和沉淀后即为单抗腹水，-70℃～80℃冻存备用。
将所获得的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，可从其腹水中获得大量该单克隆抗体。
所述的制备方法步骤1中的超离离心的转速为55,000r·min-1离心4h。
所述的制备方法步骤1中还包括在离心后采用适量的PBS溶解。
通过上述方法制备获得杂交瘤细胞，进而获得猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，可利用如下方法进行鉴定：(1)利用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液的效价，(2)用单克隆抗体分型试剂盒进行分型鉴定，经亚型鉴定表明抗体的免疫球蛋白均为IgM，(3)杂交瘤细胞的染色体分析将传代2～3天的杂交瘤细胞取出，向细胞瓶内加入含1/15mol/L秋水仙碱的培养基，继续培养5h，使染色体停止在分裂中期，1,000r/min离心10min，收集细胞，用10mL 5g/L KCl溶液重悬，置37℃水浴低渗处理25min，加入1mL细胞固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)＝3∶1)预固定2min，1,000r/min离心10min，弃上清液，用新鲜固定液将细胞重悬，在4℃固定过夜，根据细胞压积的多少留一定量的固定液将细胞悬浮，滴管吸取细胞悬液少许滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即吹散，火焰固定，用体积分数10％姬姆萨(Giemsa)染色液染色10min，洗去染液自然干燥，于显微镜下观察计数，每株细胞计数10个细胞染色体数，计算平均值(4)间接免疫荧光特性分析PCV2感染96孔板上生长的PK15细胞，待细胞长成单层后弃上清液，用无水乙醇固定，PBS洗涤3次，分别将制备获得的两株单克隆抗体腹水按不同浓度加入96孔板中，37℃反应60min，PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃反应30min，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察，将PBS作为阴性对照，小鼠阳性血清作为阳性对照。有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性，(5)单克隆抗体的鉴定还包括其结合位点分析，用间接ELSIA叠加实验分析单克隆抗体的结合位点。根据腹水单克隆抗体的效价，将腹水单克隆抗体分别稀释至饱和时的工作浓度，在此浓度下各取50％两两混匀。分别测定腹水单克隆抗体混和后的及饱和浓度下的效价。计算加成指数AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％。式中A1、A2分别为2株不同单克隆抗体所测的效价，A1+2为两两混和抗体所测的效价。每组重复实验3次，计算其平均值，AI值大于50％即认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。。
本发明的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体为采用上述制备方法制备获得的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体。
本发明由上述方法制备的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体可应用于建立间接免疫荧光诊断方法，其具体步骤为：(1)制作病料切片，采取疑似PCV2病料，切取黄豆大小肺脏和淋巴结组织块，放置于组织固着器上并冷冻，待组织块冷冻后将其装到切片机上，调整好位置后，切取0.1～0.3mm的组织薄片，将经过冷乙醇浸泡过的玻片贴片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存备用；
(2)间接免疫荧光诊断方法建立，取出制备好的病料切片，分别滴加PCV2小鼠阳性血清、猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min，共3次，然后滴加的不同浓度的羊抗鼠荧光二抗，同时以小鼠阳性血清为阳性对照，以PCV2的PCR阴性病料为阴性对照，以伪狂犬病毒(PRV)阳性而PCV2阴性的PCV2病料为实验对象，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min次，共3次，滴加体积分数50％甘油盖玻片封片，荧光显微镜观察。分别将8-60和10-48作为一抗，检测临床上的20份PCV2病料，并将间接免疫荧光诊断结果与PCR结果做符合率比较。
综上所述，本发明相比现有技术具有如下优点：
本发明采用超离全病毒免疫小鼠，通过间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得了针对PCV2-ORF2蛋白的单克隆抗体。表明使用全病毒蛋白作为免疫原，能避免原核或真核表达的蛋白失真。在采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞的过程中，使用以Cap蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法检测，快速准确地检测到特异性针对PCV2 Cap蛋白的单克隆抗体，并经3次亚克隆后最终获得能稳定分泌抗PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的细胞株。从杂交瘤细胞染色体核型、经过连续传代培养和冻存后的生物学特性、以及单克隆抗体的亚类、效价及针对的抗原表位等方面，对所获得的单克隆抗体生物学特性进行了系统鉴定，结果表明，所获得的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强而且稳定，单克隆抗体效价高，对应同一个抗原表位，具有一定的应用价值。间接免疫荧光试验结果表明，所获得的单克隆抗体均具有针对PCV2病毒天然Cap蛋白的结合表位，具有很强的特异性。说明所筛选单抗均具有良好的荧光特性，适宜作为荧光一抗来建立间接免疫荧光诊断方法，为PCV1和PCV2的鉴别诊断方法的研究提供了材料。本研究通过获得的PCV2单克隆抗体为一抗，羊抗鼠荧光抗体为二抗，经过条件优化，初步建立了能检测猪病料中PCV2病原的间接免疫荧光诊断方法，并检测了来自福建省各个猪场的20份临床疑似PCV2的猪病料，与诊断PCV2的PCR诊断方法比较，结果表明，2种诊断方法的诊断结果基本一致，这为PCV2引发的一系列疾病的预防和治疗提供了帮助。
附图说明
图1是本发明实施例的8-60(A)和10-48(B)2株单克隆抗体细胞的染色体(1000×)图
图2是本发明实施例2株单克隆杭体对PCV2感染的PK15细胞涂片的间接免疫荧光试验结果(10×40)
图3是2株单克隆杭体对PCV2感染的猪病料的间接免疫荧光试验结果(10×20)
图2中的A.阴性对照；B.阳性对照；C.8-60；D.10-48
图3中的A.小鼠阳性血清；B.8-60；C.10-48；D.PCR阴性病料；E.PRV病料
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行更详细的描述。
实施例1
一种猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体的制备方法：
1.材料与方法
1.1菌株、细胞及试验动物
PCV2分离株、PK15细胞系、骨髓瘤细胞SP2/0均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所畜病室保存，BALB/c小鼠购自福建省中医学院。
1.2主要试剂
HAT培养基、HT培养基、胎牛血清、DMEM高糖培养基、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG、荧光素(FITC)标记羊抗鼠IgG均购自Sigma公司。
1.3抗原的制备
将冻存的PCV2复苏后扩大培养，55,000r·min-1离心4h，适量PBS溶解、收集沉淀，超声波裂解，经蛋白定量仪测定其质量浓度为1.1mg/ml，-80℃冻存备用。
1.4动物免疫
取健康8周龄BALB/c小鼠3只，颈背部皮下多点注射免疫，抗原(PCV2全病毒)剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg。免疫间隔14d，三免14d后尾静脉采血测抗体效价，血清中PCV2抗体效价为109，选效价高的小鼠在细胞融合前3d脾脏注射50μg加强免疫。
1.5细胞融合
无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，1000r/min离心10min后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％(HAT∶DMEM)HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；注意补充体积分数1％HAT(HAT∶DMEM)培养液。(试验中发现，将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合后3d即可见杂交瘤细胞生长，细胞融合率达到85％以上。)
1.6杂交瘤细胞的筛选和克隆
待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，将其分别命名为10-48和8-60，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；3次亚克隆后，获得了2株稳定分泌抗体且效价高的细胞扩大培养并冻存。将其连续传代2个月和经过冻存复苏后仍能保持分泌抗体的能力。
1.7单抗腹水的制备
取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射杂交瘤细胞0.5mL(含5×105～1×106个杂交瘤细胞)/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，去除油脂和沉淀后即为单抗腹水，-80℃冻存备用。
1.8 PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的鉴定
1.8.1单克隆抗体的效价 利用间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水效价。
1.8.2单克隆抗体亚型鉴定 用Sigma单克隆抗体分型试剂盒进行分型鉴定。结果见表1：
表1 8-60、10-48这2株单克隆抗体的效价及亚类
由表一可见，利用包被Cap蛋白的间接ELISA对所得的2株单克隆抗体进行检测，小鼠腹水效价明显高于细胞培养上清液效价，亚类鉴定结果表明，2株单克隆抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。
1.8.3单克隆抗体结合位点分析 用间接ELSIA叠加实验分析单克隆抗体的结合位点。根据腹水单克隆抗体的效价，将2株腹水单克隆抗体分别稀释至饱和时的工作浓度，在此浓度下各取50％两两混匀。分别测定2株腹水单克隆抗体混和后的及饱和浓度下的效价。计算加成指数AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％。式中A1、A2分别为2株不同单克隆抗体所测的效价，A1+2为两两混和抗体所测的效价。每组重复实验3次，计算其平均值，AI值大于50％即认为两种单克隆抗体识别不同的抗原表位。
表2 8-60、10-48这2株单克隆抗体结合位点的ELISA叠加的AI值
Table2 Results of additivity ELISA for two monoclonal antibody ％
表2显示，8-60与10-48之间反应的AI值均小于10％，因此可以初步判定获得的2株单克隆抗体具有同一个结合位点。
1.8.4 杂交瘤细胞的染色体分析 将传代2～3d的杂交瘤细胞取出，向细胞瓶内加入含1/15mol/L秋水仙碱的培养基，继续培养5h，使染色体停止在分裂中期。1000r/min离心10min，收集细胞，用10mL 5g/L KCl溶液重悬。置37℃浴低渗处理25min，加入1mL细胞固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)＝3∶1)预固定2min，1000r/min离心10min，弃上清液，用新鲜固定液将细胞重悬，在4℃固定过夜。根据细胞压积的多少留一定量的固定液将细胞悬浮，滴管吸取细胞悬液少许滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即吹散，火焰固定，用体积分数10％姬姆萨(Giemsa)染色液染色10min，洗去染液自然干燥，于显微镜下观察计数。每株细胞计数10个细胞染色体数，计算平均值。
2株单克隆抗体细胞的染色体数均为98～105对，多数核型为端着丝点染色体，少数为核型为中间着丝点染色体(图1)
1.8.5荧光特性分析 PCV2感染96孔板上生长的PK15细胞，待细胞长成单层后弃上清液，用无水乙醇固定，PBS洗涤3次，加入小鼠腹水(稀释10倍)，37℃反应60min，PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃反应30min，PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察。将PBS作为阴性对照，小鼠血清作为阳性对照。有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。观察发现，PCV2感染的阳性孔PK细胞及8-60和10-48孔中的PK细胞均呈现出明显的绿色荧光，且荧光多聚集在PK15细胞的细胞质中，而阴性孔PK细胞无明显绿色荧光(图2)，表明8-60和10-48均具有良好的荧光特性。
本实施例未述部分与现有技术相同。
实施例2
本实施例为由实施例1制备获的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体。
实施例3
由实施例1制备所得的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体的应用，其为：
1制作病料切片 采取疑似PCV2病料，切取黄豆大小肺脏和淋巴结组织块，放置于组织固着器上并冷冻，待组织块冷冻后将其装到切片机上，调整好位置后，切取0.1～0.3mm的组织薄片，将经过冷乙醇浸泡过的玻片贴片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存备用。
2间接免疫荧光诊断方法建立 取出制备好的病料切片，分别加PCV2小鼠阳性血清、8-60和10-48培养上清液单抗，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min，共3次，然后滴加的不同浓度(1∶30000、1∶20000、1∶10000)的羊抗鼠荧光二抗，同时以小鼠阳性血清为阳性对照，以PCV2的PCR阴性病料为阴性对照，以伪狂犬病毒(PRV)阳性而PCV2阴性的PCV2病料为实验对象，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min次，共3次，滴加体积分数50％甘油盖玻片封片，荧光显微镜观察。分别将8-60和10-48作为一抗，检测临床上的20份PCV2病料，并将间接免疫荧光诊断结果与PCR结果做符合率比较。
建立的间接免疫荧光诊断方法与PCR诊断方法的比较见图3显示，对PCV2的PCR阳性病料，小鼠阳性血清以及PCV2单抗8-60和10-48的培养上清液作为一抗的病料荧光染色也很强；而PCR阴性病料的荧光染色呈阴性；伪狂犬病毒阳性，PCV2阴性的病料，其荧光染色也呈阴性(图3)。此外，用单克隆抗体8-60和10-48分别作为一抗，检测了临床上的20份PCV2病料，与PCR结果的阳性符合率为93.75％，与PCR结果的阴性符合率为100％(表3)。
表32株单克隆抗体对PCV2感染猪病料间接免疫荧光诊断与PCR诊断符合率的比较
Table3 Result of accordant rate between IFA and PCR
本实施例未述部分与现有技术相同。
Claims (7)
1.一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：
(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解，蛋白含量测定仪测定其质量浓度，-70～80℃冻存备用；
(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天，三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在107以上的小鼠在细胞融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，
(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；
(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征如下：所述的制备方法还包括将取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射杂交瘤细胞0.5mL含(5×105～1×106个杂交瘤细胞)/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，去除油脂和沉淀后即为单抗腹水，-70℃～80℃冻存备用。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征如下：所述的制备方法步骤1中的超速离心的转速为55,000r·min-1离心4h。
4.根据权利要求2所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征如下：所述的制备方法步骤1中还包括在离心后采用适量的PBS溶解。
5.一种由权利要求1的制备方法所获得的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述的猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体由如下步骤制得，(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解，蛋白含量测定仪测定其质量浓度，-70℃～80℃冻存备用；
(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天，三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在107以上的小鼠在细胞融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，
(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；
(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞。
6.一种由权利要求1方法制得的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体在建立间接免疫荧光诊断方法中的应用。
7.根据权利要求6所述的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体在建立间接免疫荧光诊断方法中的应用为：(1)制作病料切片，采取疑似PCV2病料，切取黄豆大小肺脏和淋巴结组织块，放置于组织固着器上并冷冻，待组织块冷冻后将其装到切片机上，调整好位置后，切取0.1～0.3mm的组织薄片，将经过冷乙醇浸泡过的玻片贴片，放置于冷丙酮中固定，取出晾干，-20℃保存备用；(2)间接免疫荧光诊断方法建立，取出制备好的病料切片，分别滴加PCV2小鼠阳性血清、猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min，共3次，然后滴加的不同浓度的羊抗鼠荧光二抗，同时以小鼠阳性血清为阳性对照，以PCV2的PCR阴性病料为阴性对照，以伪狂犬病毒(PRV)阳性而PCV2阴性的PCV2病料为实验对象，装入密封袋于37℃孵育1h，取出用PBS-T洗涤5min次，共3次，滴加体积分数50％甘油盖玻片封片，荧光显微镜观察。分别将8-60和10-48作为一抗，检测临床上的20份PCV2病料，并将间接免疫荧光诊断结果与PCR结果做符合率比较。
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