CN103755806B - 抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC？NO.C2013189的杂交瘤细胞株所分泌的，本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和应用。本发明的单克隆抗体能特异性地与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，也不与洪湖碘泡虫除壳瓣外的其它结构发生反应，可用于制备特异性检测洪湖碘泡虫的试剂盒，具有检测特异性高，反应灵敏的特点，适用于洪湖碘泡虫的高通量检测。

Description

抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

粘孢子虫（myxosporea）是养殖鱼类常见的寄生虫，能导致养殖鱼类的重大病害发生。其中，洪湖碘泡虫（MyxobolushonghuensisLiuetGu，2012）是异育银鲫“喉孢子虫病”的病原，经过移行与发育最终在鱼体咽部形成大小不等的孢囊，夺取宿主营养、阻塞鱼体进食和造成机械压迫，最终导致鱼体死亡。多年来，该病在湖北省武汉、仙桃、荆州、黄冈及江苏省盐城等地区大面积暴发，鱼种死亡率超过90%，严重危害了异育银鲫的健康养殖。

洪湖碘泡虫成熟胞囊外有一层坚硬的生物膜，一般化学药物很难渗透其中，至今对该病尚无有效的治疗办法。快速和准确地诊断是有效开展“喉孢子虫病”防治的关键。从洪湖碘泡虫的移行与发育过程来看，要想有效防控喉孢子虫病的发生，必须在胞囊形成前作出正确诊断并采取有效措施阻断孢囊形成。但是，目前在养殖生产中最广泛应用的临床诊断法是基于典型病症和光学显微镜观察成熟孢子进行诊断，这种方法诊断成本低，也能作出诊断，但致命缺点是诊断结果严重滞后，即显微镜能见成熟孢子和临床症状出现时胞囊已经形成。因此，建立早期、快速、灵敏的有效诊断技术对异育银鲫“喉孢子病”的防控具有非常重要的意义。

随着免疫学的快速发展，免疫学快速诊断技术在生物医学的理论研究和临床诊断等许多领域得到了广泛应用。其中，免疫荧光抗体技术在水产动物疾病诊断上的应用具有灵敏度高、特异性强、定位准确和应用广泛等优点。近年来，粘孢子虫病的早期快速诊断有了长足的发展，国外许多对渔业有重大危害的粘孢子虫均发展了快速免疫诊断技术，如Ceratomyxashasta、PKX、M.cerebralis等。

然而，粘孢子虫在免疫原性方面存在属特异性和种特异性，国内外建立的免疫诊断技术及商品检测试剂均只适用于特定种类，如脑粘体虫的免疫荧光诊断技术，只能特异性诊断脑粘体虫，对其他粘孢子虫无法识别。对于严重危害我国异育银鲫的洪湖碘泡虫，目前尚缺乏种特异性的早期诊断技术。因此，急需发展洪湖碘泡虫的种特异性检测技术，为“喉孢子虫病”的早期诊断和防治提供重要的依据，保障异育银鲫养殖业的健康发展。

发明内容

本发明的第一个目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是提供能分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的第三个目的是提供所述单克隆抗体的制备方法。

本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体的应用。

为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体对洪湖碘泡虫壳瓣蛋白有特异性。

本发明中所述的“特异性”是指单克隆抗体对相应抗原或近似抗原物质的识别能力。特异性高，抗原的识别能力就强。因此，上述的单克隆抗体能够特异性识别和结合洪湖碘泡虫壳瓣蛋白。

所述单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C2013189的杂交瘤细胞株3B7分泌。所述杂交瘤细胞株3B7已保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期：2013年11月15日，分类命名为小鼠杂交瘤细胞(Mousehybridoma)。

所述杂交瘤细胞株3B7是采用洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，该可溶性蛋白的SDS-PAGE分析如附图1所示。

所述可溶性蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对洪湖碘泡虫壳瓣蛋白有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B7，从所述杂交瘤细胞株3B7的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取所述单克隆抗体。

在本发明的一个具体实施例中，以洪湖碘泡虫可溶性蛋白作为抗原免疫小鼠，取小鼠的脾细胞与同系动物的骨髓瘤细胞进行融合。筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，进行克隆化培养，并建立杂交细胞株。上述方法仅是示例性的，例如可以用同样的方法免疫其他哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞。还可以选择适宜的骨髓瘤细胞用于融合，例如用来自大鼠、小鼠或仓鼠的骨髓瘤细胞。免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照常规方法进行。

筛选产生目的抗体的杂交瘤细胞进行单克隆化，得到的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可以在普通培养基中传代培养或者在液氮中长时间保存。从杂交瘤细胞收集本发明的单克隆抗体时，可以从杂交瘤细胞体外培养上清液中获得抗体，或者将杂交瘤细胞注入适宜的哺乳动物并从动物腹水中获取抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体，后一种方法适于大量获取抗体。通过上述方法获得的抗体，可以用常规方法纯化，例如盐析、凝胶过滤、亲和层析等方法。

在本发明的第四方面，提供了一种免疫测定法，所述免疫测定法采用上述的抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体。

所述免疫测定法是间接酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光法（IFAT）。

本发明建立的ELISA和IFAT检测试剂盒，含有本发明的单克隆抗体和用于与单克隆抗体结合的标记物(标记物可以是放射性同位素、荧光化合物、生物素和酶等物质)，以及用于检测的其他试剂和缓冲液。对于本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述单克隆抗体，制备相应的检测产品，是显而易见的。

本发明的有益效果在于：

1）该单克隆抗体（mAb3B7）可特异地与洪湖碘泡虫反应，而不与其它粘孢子虫发生反应，从而可以进行洪湖碘泡虫的种特异性检测，弥补目前尚无洪湖碘泡虫特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏。

2）该单克隆抗体（mAb3B7）仅特异地与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白发生反应，而不与其它结构发生反应。

3）本发明的免疫试剂盒可用于洪湖碘泡虫的种特异性检测，弥补目前尚无洪湖碘泡虫特异性检测方法之不足，特异性高，反应灵敏，成本低，适于高通量检测和大规模推广应用。

附图说明

图1：抗原（洪湖碘泡虫可溶性蛋白）的SDS-PAGE分析。M：蛋白marker，M.honghuensis：洪湖碘泡虫可溶性蛋白。

图2：抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体3B7的免疫印迹分析（Western-blot）。M：蛋白Marker，mAb3B7：单克隆抗体3B7识别的蛋白条带（Mr28000处）。

图3：抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体3B7的间接免疫荧光检测（IFAT）（a，b标尺为20μm；c标尺为10μm）。a、c：洪湖碘泡虫荧光显微镜拍照图；b：洪湖碘泡虫光学显微镜拍照图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1抗原的制备

1.1孢子的分离纯化

用剪刀将宿主鱼体鳃盖剪开，用弯头手术镊从咽部剥离完整孢囊；用磷酸缓冲液（PBS，pH7.0）洗涤3次，300rpm，离心5min；孢囊重悬于少量PBS中，玻璃匀浆器手工匀浆直至浆液较均匀，1000rpm，离心20min，收集沉淀和上清；沉淀用适量PBS重悬，用蔗糖密度梯度（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5）离心，1000rpm，15min分离出成熟孢子（位于1：1～1：2之间）；成熟孢子用PBS洗涤两次，3000rpm，离心10min，去上清，沉淀物即为成熟孢子。

1.2可溶性蛋白的制备

分离纯化后的孢子经PBS（pH7.0）洗涤后，用液氮进行研磨，然后离心取上清即为孢子可溶性抗原。具体步骤如下：纯化后的成熟孢子用PBS洗涤两次，3000rpm，离心10min，去上清；沉淀用少量PBS混匀后倒入研钵，倒入液氮研磨促使壳瓣破裂释放内含物；加少量PBS溶解，12000rpm离心，取上清；用BCA法测定抗原浓度。

1.3SDS-PAGE对洪湖碘泡虫可溶性蛋白分析

孢子可溶蛋白加入凝胶上样缓冲液，沸水中水浴10min，冰上冷却；临用前12000rpm，4℃，离心5min，取上清，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（分离胶12％、浓缩胶4％）鉴定洪湖碘泡虫可溶性蛋白（图1）。

实施例2单克隆抗体的制备

2.1动物免疫

2.1.1动物：雌性，6～8周龄BALB/c小鼠5只(购自中国科学院武汉病毒研究所)。

2.1.2抗原：实施例1中制备的洪湖碘泡虫可溶性抗原，50μg/只/次。

2.1.3免疫途径及程序：初次免疫：洪湖碘泡虫可溶性抗原与等体积完全弗氏佐剂充分混匀，形成油包水，于鼠背部皮内多点注射；第二次免疫：3周后，洪湖碘泡虫可溶性抗原与不完全弗氏佐剂等体积混匀，背部皮内多点注射。之后隔3周免疫一次（腹腔内不含佐剂），并于免疫后第5～7天取尾静脉血20μL，用ELISA法测抗体效价；加强免疫：待抗体效价达到1:3000时，尾静脉加强免疫（不含佐剂），于3天后取脾脏，进行细胞融合。

2.2细胞融合

2.2.1饲养细胞的制备：BALB/c小鼠拉颈处死，75％酒精中浸泡消毒5min。剖开腹外皮肤，用5mL无血清1640培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心计数。用20％小牛血清1640调整细胞浓度至0.5～2×10⁵/mL，立即种植于96孔培养板内，0.1mL/孔。

2.2.2脾细胞的制备：最后一次加强免疫后第3天，无菌取小鼠的脾脏，置于无血清的1640培养液中，用注射器内栓将脾脏撵碎，通过尼龙网过滤，制备细胞悬液。1000rpm离心5min，弃上清后重悬于5mL无血清1640培养液中，计数细胞浓度。

2.2.3骨髓瘤细胞的准备：选用小鼠骨髓瘤株SP2/0，收集对数生长期的骨髓瘤细胞，洗涤记数，调整浓度为4～5×10⁵/mL，悬浮于无血清1640培养液中备用。

2.2.4细胞融合：将脾细胞与SP2/0细胞以10∶1（细胞数比）混合，1000rpm离心5min，倾去上清，轻弹沉降下来的细胞团块，使之完全松散。以1mL移液管吸取0.7mL的50％PEG-4000在1min内边搅拌边加入，加完后静置90s。之后以无血清1640培养液终止融合，开始时须缓慢加入（1mL/min），而后逐渐加快，边加边搅，共加入30mL终止液。整个融合过程须在37℃水浴下进行。800rpm离心5min，去除上清，继续下一步操作。

2.2.5细胞培养：将离心后的细胞团块轻弹至散开。待细胞完全松散后用HAT培养基重悬，加入到已用饲养细胞铺好的96孔板中，每孔200μL置于37℃，5％（体积百分比）CO₂的培养箱中培养。1周后，在倒置显微镜下观察克隆生长情况并记录每孔克隆数。待细胞生长至占培养孔底1/3面积时即可吸取培养液上清进行ELISA检测。

2.3阳性克隆的筛选和亚克隆

2.3.1ELISA检测：用包被液将洪湖碘泡虫可溶性抗原(0.5mg/mL)每孔100μL包被酶标板，置于4℃过夜；用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次3min，然后用1％BSA-PBS封闭，每孔200μL，室温放置2h；倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100μL待检杂交瘤细胞培养上清，于37℃孵育1h；倾去培养上清，洗涤后每孔加入1∶3000（工作浓度）稀释的羊抗鼠IgG-HRP(辣根过氧化物酶)结合物100μL，于37℃孵育1h。将多余的酶结合物弃去，同上洗涤。每孔加入100μL的TMB底物反应液，室温显色10～30min后，每孔加入50μL的终止液（2mol/LH₂SO₄）终止反应。用酶标仪450nm测吸光值，吸光值大于阴性孔2倍以上者为阳性，选择阳性细胞孔进行亚克隆。

2.3.2杂交瘤细胞的亚克隆（单个细胞培养）：有限稀释法进行克隆化。饲养细胞的准备同2.2.1，将ELISA检测阳性孔中的细胞从培养板内轻轻洗脱计数。用培养液连续稀释细胞悬液成30个细胞/mL接种在铺有饲养细胞的96孔板内，0.1mL/孔。培养10天左右，杂交瘤细胞集落长至孔底1/3面积时，开始测定上清中抗体活性。对有抗体活性的阳性细胞孔再克隆，共进行3次。

经上述重复进行ELISA筛选及亚克隆，最后筛选出1株能稳定分泌抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为mAb3B7，保藏号为CCTCCNO.C2013189。

2.4单克隆抗体大量制备和初步纯化

2.4.1小鼠腹水的制备及收集：将杂交瘤细胞扩大培养，选取20～22gBALB/c雌性小鼠，腹腔注射杂交瘤细胞2×10⁷/只，10～14天后待小鼠腹部明显膨胀后，收集腹水。将收集的腹水3000rpm离心5min，取上清，-20℃储存。

2.4.2腹水的初步纯化：采用盐析法，取腹水2mL加入洁净的离心管中，加2mL生理盐水混匀；逐滴加入4mL饱和硫酸铵，4℃静置2h或过夜；5000rpm离心30min，沉淀再用50％饱和硫酸铵洗涤2次；用2mLPBS使沉淀溶解，将此蛋白质溶液加入透析袋中，对PBS缓冲液4℃透析过夜，期间换液2～3次。

实施例3单克隆抗体的鉴定

3.1抗体亚类

使用鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒(Sigma)测定。将羊抗鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA和IgM分别用包被液1∶1000稀释，100μL/孔包被，4℃过夜或37℃孵育2h；用洗涤液PBST洗涤3次，3min/次，每孔加入100μL待检测的单抗细胞培养上清，37℃孵育1h；同上洗涤3次，加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多价免疫球蛋白(G、A、M)抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；同上洗涤3次，每孔加入新鲜配置的TMB底物溶液100μL，37℃避光孵育20min；每孔加入50μL2MH₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀吸光值，以阳性反应孔包被的亚类类别为待测上清的抗体类别。鉴定结果表明，本发明制备的抗体亚类为IgG1。

3.2Western-Blot检测

孢子可溶蛋白加入凝胶上样缓冲液，沸水中水浴10min，冰上冷却；临用前12000rpm，4℃，离心5min取上清，用于Western-blot分析；蛋白样品经12%SDS-PAGE胶(Bio-RadMini-Protein电泳系统)电泳分离；电泳结束后按照MiniTrans-Blot电泳转移系统操作指南装配转膜Sandwich，安装电转移系统，以80V电压冰浴转膜40min，将蛋白转移至孔径为0.45μm的PVDF膜上；转膜缓冲液配方：25mMTrispH8.3，192mM甘氨酸，20%甲醇；丽春红染色3min，标出Marker，其余的膜用TBST溶液（25mMTrispH7.5，150mMNaCl，0.05%Tween-20）洗膜3次，每次10min；5%脱脂奶粉（溶于TBST中）室温封闭1h；以1∶500～1000稀释比例（根据抗体效价调整）将抗血清稀释于TBST（含1%脱脂奶粉和0.1%Tween-20）中，室温孵育1h；TBST洗膜3次，每次15min；以1∶1000稀释比例加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1h；TBST（TBS溶液中加入0.1%Tween-20）洗膜3次，每次15min，采用ECL（化学发光法）系统曝光存图。

结果如图2所示，本发明制备的单抗腹水与洪湖碘泡虫可溶性抗原在约Mr28000处有特异性反应条带。

3.3间接酶联免疫吸附法（ELISA）测定抗体的特异性和亲和性

将洪湖碘泡虫（M.honghuensis）和吴李碘泡虫（M.wulii）可溶性抗原用包被液稀释至1μg/mL的浓度100μL/孔包被酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h；用洗涤液PBST洗涤3次，3min/次；拍干后用含1％BSA的PBST封闭，37℃湿盒作用1h；同上洗涤3次，加入倍比稀释的单抗腹水，稀释度为1∶400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200，37℃孵育1h；同上洗涤3次，加入1∶3000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；同上洗涤3次，加入TMB底物显色，以正常BALB/c小鼠的血清为阴性对照，PBS为空白对照。

表1间接ELISA特异性检测结果

表1结果显示，本发明制备的单抗腹水与同属的吴李碘泡虫（M.wulii）的可溶性抗原无反应性或仅有弱反应性，与正常BALB/c鼠血清的反应为阴性，而与洪湖碘泡虫（M.honghuensis）可溶性抗原有强反应性，抗体稀释度的平台区间跨越4个稀释度，表明抗体的特异性和亲和性较好。

3.4间接免疫荧光（IFAT）检测

用0.1%多聚赖氨酸处理玻片1h，PBS洗涤2-3次；将本实验室采集的洪湖碘泡虫和同属的其它虫种（贝壳碘泡虫、苍梧碘泡虫、茄形碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫、吴李碘泡虫）均匀涂在薄片上；用10%甲醇固定，30min，0.1mol/LPBS(pH8.0)洗涤3次，加入本发明制备的单抗腹水，将多克隆抗体（PAb）、阴性小鼠血清、PBS作对照；37℃，50min孵育，PBS洗涤2次；1:50稀释兔抗鼠IgG-FITC，37℃，40min；PBS洗涤2-3次，甘油封片，荧光显微镜拍照。

图3结果显示，本发明制备的单抗腹水与洪湖碘泡虫壳瓣蛋白特异性结合，而不能与洪湖碘泡虫其它结构发生反应。

表2间接免疫荧光法种特异性检测结果

	PAb	3B7
			洪湖碘泡虫	﹢	﹢
茄形碘泡虫	‐	‐
			吴李碘泡虫	﹢	‐
贝壳碘泡虫	﹢	‐
			丑陋圆形碘泡虫	﹢	‐
苍梧碘泡虫	﹢	‐

表2结果显示，本发明制备的单抗腹水与洪湖碘泡虫有很好的反应，而与同属的其它虫种（贝壳碘泡虫、苍梧碘泡虫、茄形碘泡虫、丑陋圆形碘泡虫、吴李碘泡虫）均没有交叉反应，表现出极好的种特异性。而多克隆抗体（PAb）与上述虫种均有反应，不具有种特异性。（+：有荧光反应，—：无荧光反应）

洪湖碘泡虫的壳瓣作为“骨架”结构，起着致病与免疫逃避作用，与胞囊的形成关系密切，与宿主（鱼体）接触时间最长，可以作为洪湖碘泡虫病早期免疫诊断的理想靶抗原。

本发明通过提供一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的特异性单克隆抗体，用于洪湖碘泡虫的特异性检测，弥补目前尚无洪湖碘泡虫特异性检测方法之不足。

综上所述，本发明的单克隆抗体能特异性检测洪湖碘泡虫壳瓣蛋白，可用于洪湖碘泡虫的特异性检测，检测特异性高、反应灵敏、成本低，适用于洪湖碘泡虫高通量检测。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (5)

1.一种抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCCNO.C2013189的杂交瘤细胞株3B7所分泌的。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株3B7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.C2013189。

3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：从保藏号为CCTCCNO.C2013189的杂交瘤细胞株3B7的培养上清液中或从注射所述杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测洪湖碘泡虫的试剂盒中的应用。

5.一种检测洪湖碘泡虫的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含权利要求1所述的单克隆抗体。