CN106244562B - 杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素d3单克隆抗体和应用 - Google Patents

杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素d3单克隆抗体和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106244562B
CN106244562B CN201610929558.7A CN201610929558A CN106244562B CN 106244562 B CN106244562 B CN 106244562B CN 201610929558 A CN201610929558 A CN 201610929558A CN 106244562 B CN106244562 B CN 106244562B
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
cell strain
application
hybridoma cell
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610929558.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106244562A (zh
Inventor
陈东
苏娟
郑孝君
高飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Alltest Biotech Co ltd filed Critical Hangzhou Alltest Biotech Co ltd
Publication of CN106244562A publication Critical patent/CN106244562A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106244562B publication Critical patent/CN106244562B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体和应用。杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株6B5.2，保藏编号为CCTCC No.C201648。本发明利用自行设计的25羟基维生素D3人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对25羟基维生素D3进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体和应用。
背景技术
维生素D3是胆固醇的衍生物，也称胆钙化醇，其活性形式有25-羟维生素D3(25-(OH)2-VitD3)，1,25-二羟维生素D3(1,25-(OH)2-VitD3)两种。25-羟维生素D3是维生素D的主要循环形式，1,25-二羟维生素D3为主要活性形式。
VitD3无生物活性，它首先在肝脏被25-羟化酶催化为具有一定生物活性的25-(OH)-VitD3，然后在肾近端小管1α-羟化酶的催化下生成活性更高的1,25-(OH)2-VitD3。血液中各种形式的VitD3都与VitD结合蛋白结合，形成结合型VitD在血中运输。血浆中25-OH-VitD3的浓度为40～90mmol/L，而1,25-(OH)2-VitD3的含量为100pmol/L，半衰期为12～15h，其灭活主要在靶细胞内发生侧链氧化或羟化，形成钙化酸等代谢产物，这些产物在肝脏与葡萄糖醛酸结合后随胆汁排入小肠，在小肠，其中一部分被吸收入血，从而形成VitD3的肝肠循环，一部分随粪便排出体外。
25羟基维生素D3的临床应用主要包括1.维生素D与儿童健康：血清25-OH-VD是维生素营养状况的最佳指标，应逐步开展。血清25-OH-VD是维生素D不足、轻度维生素D缺乏和佝偻病早期的主要诊断依据。2.维生素D与心血管：心血管疾病患者体内25羟基维生素D水平明显低于正常人,心衰患者降低程度更为明显,可通过补充维生素D降低心血管疾病的发病率。3.维生素D与孕妇健康：孕中晚期维生素D水平不足或缺乏是普遍现象，孕期应注意补充维生素D治疗，存在明显VitD缺乏，应补充VitD，维持25-OH-VD达正常范围。母亲血清25-OH-VD水平小于37.5nmol/L,剖腹产率增加4倍。4.维生素D与高血压：在一项研究中，南澳大利亚大学的研究人员对146，500名欧洲、北美后裔的健康信息进行分析后发现，体内维生素D浓度每上升10％，出现高血压风险就会下降8％。
免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法，开发25羟维生素D3的酶联免疫试剂盒和胶体金检测试纸条关键是能够制备出对25羟维生素D3具有高亲和力和高特异性的抗体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一种分泌抗25羟基维生素D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗25羟基维生素D3单克隆抗体。
一种分泌抗25羟基维生素D3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株6B5.2，已于2016年3月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C201648；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。
本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法，利用25羟基维生素D3人工抗原注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从而获得所述杂交瘤细胞株。
25羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对25羟基维生素D3进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的25羟基维生素D3人工抗原。所述25羟基维生素D3的分子结构式如式(Ⅰ)所示：
每次注射时，25羟基维生素D3人工抗原的用量为15μg。
采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株在制备25羟基维生素D3检测试剂盒中的应用；或在制备用于检测25羟基维生素D3的试纸条中的应用。
将所述杂交瘤细胞株6B5.2扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中可得到高效价的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，利用该抗25羟基维生素D3单克隆抗体可用于制备25羟基维生素D3检测试剂盒。
本发明的第二个目的是提供一种抗25羟基维生素D3单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株6B5.2或其传代细胞株分泌产生。该抗体的亚型为IgG2a，轻链为Kappa链。
本发明的第三个目的是提供上述抗25羟基维生素D3单克隆抗体制备25羟基维生素D3检测试剂盒中的应用；或在制备用于检测25羟基维生素D3的试纸条中的应用。
作为优选，所述检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒；其内还含有25羟基维生素D3标准品和酶标二抗。由于25羟基维生素D3本身分子结构的限制，本发明的检测试剂盒是以竞争抑制ELISA原理制备的。使用时，先包被25羟基维生素D3标准品，再加入待测样品，然后依次加入所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体、酶标二抗，进行反应，检测OD值，计算竞争抑制率。25羟基维生素D3标准品的包被量以所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限为宜。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG-HRP。
所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有抗25羟基维生素D3单克隆抗体的酶标板、25羟基维生素D3标准品、酶标抗原、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标记的25羟基维生素D3抗原一起加入酶标板反应，若样品中残留有25羟基维生素D3，则会与酶标25羟基维生素D3抗原竞争结合板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的25羟基维生素D3量成反比。根据25羟基维生素D3标准品做出的标准曲线，计算出样品中的25羟基维生素D3的含量。
所述的试纸条包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的抗25羟基维生素D3单克隆抗体。
本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG。
本发明的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有25羟基维生素D3且检测25羟基维生素D3的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测25羟基维生素D3的含量低于检测限，或待测样品中无25羟基维生素D3；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用自行设计的25羟基维生素D3人工抗原免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，效价高，特异性强，可用于对25羟基维生素D3进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。
说明书附图
图1为本发明一种25羟基维生素D3胶体金检测试纸条的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1杂交瘤细胞株的制备
(1)小鼠免疫
选择8周龄的BALB/c雌鼠用25羟基维生素D3人工抗原10μg与quick antibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射第2针；再2周后，用10μg抗原进行腹腔注射。
(2)制备淋巴细胞
取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整淋巴细胞至10ml；加入25羟基维生素D3人工抗原至终浓度100μg/ml孵育培养6小时。
(3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：
(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL 37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。
(3-3)淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL 37℃预温的1mL PEG 1450，边加边轻微摇动；加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(4).杂交瘤细胞的融合筛选
(4-1)初筛：
步骤(3-3)中融合细胞在5％CO2培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
间接ELISA方法的操作步骤是：
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释25羟基维生素D3抗原至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的25羟基维生素D3人工抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
⑤加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。
(4-2)复筛：
竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：
①先将50μl浓度为30ng/ml的25羟基维生素D3标准品加入酶标孔中，再加入50ul阳性克隆培养上清液，同时设计空白对照，即50μl PBS缓冲液和50μl阳性克隆培养上清液混合加入到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；
③每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应8分钟；
④加入50μl浓度为2M的H2SO4终止反应，在450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。
竞争抑制率的计算式为：
表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果
由表1可见，杂交瘤细胞株6B5的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株6B5做克隆培养。
(4-3)杂交瘤细胞株6B5的克隆化
杂交瘤细胞株6B5的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为6B5.2，扩大培养后进行抗25羟基维生素D3单克隆抗体纯化。
(5)抗25羟基维生素D3单克隆抗体纯化
取扩大培养后的杂交瘤细胞株6B5.2，接种1×106细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD280测定蛋白含量,蛋白浓度为3.47mg/ml。
实施例2抗25羟基维生素D3单克隆抗体的反应活性测试
采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释25羟基维生素D3人工抗原至500ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的25羟基维生素D3人工抗原，4℃包被过夜；
②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗25羟基维生素D3单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；
③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB 37℃反应8分钟后，浓度为2M的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值，以抗25羟基维生素D3单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值；检测结果见表2。
表2不同浓度下抗25羟基维生素D3单克隆抗体的OD450值
抗25羟基维生素D3单克隆抗体浓度 OD<sub>450</sub>值
0.3μg/ml 1.835
0.1μg/ml 1.541
0.03μg/ml 1.024
0.01μg/ml 0.586
0.003μg/ml 0.311
0.001μg/ml 0.127
PBS(空白对照) 0.062
由表2可见，实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体反应活性可以到达0.003μg/ml。
实施例3
如图1所示，本实施例一种25羟基维生素D3胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物的包被量为抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限(以30ng/ml为例)。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。
检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。
若只有C线显色，表示待测样品中含有25羟基维生素D3且检测25羟基维生素D3的含量高于30ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测25羟基维生素D3的含量低于30ng/ml，或待测样品中无25羟基维生素D3；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗25羟基维生素D3杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株6B5.2，已于2016年3月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为 CCTCC No.C201648；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。
2.一种抗25羟基维生素D3单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
3.权利要求2所述的抗25羟基维生素D3单克隆抗体在制备25羟基维生素D3检测试剂盒中的应用。
4.如权利要求2所述的抗25羟基维生素D3单克隆抗体在制备用于检测25羟基维生素D3的试纸条中的应用。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒，其内还含有25羟基维生素D3标准品和酶标二抗。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于检测试剂盒使用时，先包被25羟基维生素D3标准品，再加入待测样品，然后依次加入抗25羟基维生素D3单克隆抗体、酶标二抗，反应后检测OD值，计算竞争抑制率。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的25羟基维生素D3标准品的包被量以所述抗25羟基维生素D3单克隆抗体对25羟基维生素D3的检测限为宜；所述酶标二抗选用羊抗鼠IgG-HRP。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒，其内含有包被有抗25羟基维生素D3单克隆抗体的酶标板、25羟基维生素D3标准品、酶标抗原、底物和终止液。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的试纸条包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的抗25羟基维生素D3单克隆抗体，反应膜的检测线处包被有25羟基维生素D3-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线处包被有二抗。
10.如权利要求1所述的一种抗25羟基维生素D3杂交瘤细胞株，其特征在于在制备杂交瘤细胞株过程中采用的抗原是对25羟基维生素D3进行化学修饰，偶联牛血清丙种球蛋白获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的25羟基维生素D3人工抗原。
CN201610929558.7A 2016-05-20 2016-10-31 杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素d3单克隆抗体和应用 Active CN106244562B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016103431785 2016-05-20
CN201610343178 2016-05-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106244562A CN106244562A (zh) 2016-12-21
CN106244562B true CN106244562B (zh) 2019-07-23

Family

ID=57600724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610929558.7A Active CN106244562B (zh) 2016-05-20 2016-10-31 杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素d3单克隆抗体和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106244562B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113495159A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种系统反应液、一种25羟基维生素d定量检测试剂盒及其使用方法
CN113999311B (zh) * 2020-07-28 2022-11-04 东莞市朋志生物科技有限公司 可特异性结合25-羟基维生素d的抗体、其应用以及诊断试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013042426A1 (ja) * 2011-09-21 2013-03-28 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110097733A1 (en) * 2009-10-27 2011-04-28 Michel Anciaux Process for the production of a hybridoma and antibody obtained therefrom, able to recognize more than one vitamin d metabolite

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013042426A1 (ja) * 2011-09-21 2013-03-28 富士レビオ株式会社 親和性複合体に対する抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
25-羟基维生素D3人工完全抗原的合成与鉴定;万魏巍等;《细胞与分子免疫学杂志》;20111231;第27卷(第11期);1173-1179 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106244562A (zh) 2016-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104480072B (zh) 一种分泌抗金刚烷胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
WO2007026689A1 (ja) ダチョウを用いた抗体、及びその作製方法
CN106244562B (zh) 杂交瘤细胞株及其分泌的抗25羟基维生素d3单克隆抗体和应用
CN113049828A (zh) 定量检测牛乳酪蛋白过敏原的双抗体夹心elisa检测方法
CN1560081A (zh) 用能产生人IgGl重链－κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用
CN102747044A (zh) 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用
CN102219854A (zh) 抗人p1gf蛋白的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN107988168A (zh) 抗可卡因单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及制备方法
CN104965083B (zh) 一种检测h3n2亚型犬流感病毒的试剂盒
CN109507421B (zh) 抗水牛IgG单克隆抗体细胞株及其制备方法和应用
CN105907724A (zh) 一种脊髓灰质炎ⅱ型病毒单克隆抗体及其应用
CN113817054B (zh) 一种特异性结合猪轮状病毒vp6蛋白的鼠单克隆抗体5b11及其应用
CN111944765B (zh) 杂交瘤细胞株及其分泌的抗利他林单克隆抗体和应用
CN101962359A (zh) 恩诺沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN105754953B (zh) 抗人平足蛋白血小板聚集区的单克隆抗体及其应用
CN111825764B (zh) 一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用
CN101481724A (zh) 抗菌肽pmap-23单克隆抗体的制备方法及用途
CN1974600B (zh) 抗氟甲喹的单克隆抗体、其制备方法及其应用
CN110218703A (zh) 一种抗原特异性b细胞筛选方法及其在单克隆抗体制备中的应用
CN106929479A (zh) 一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz‑4及其应用
CN105925538A (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的抗合成大麻单克隆抗体和应用
CN114409776A (zh) 一种鸡毒支原体单克隆抗体的制备方法
CN113049832A (zh) 定量检测牛乳中过敏原α-乳白蛋白的双抗体夹心法
CN106117341B (zh) Il-9的抗原表位肽及其应用
CN103755806B (zh) 抗洪湖碘泡虫壳瓣蛋白的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 311121 workshop 2, third, fourth floor, workshop No. 550, Yinhai street, Baiyang street, Hangzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang

Applicant after: Hangzhou Aotai biotechnology Limited by Share Ltd

Address before: 311121 workshop 2, third, fourth floor, workshop No. 550, Yinhai street, Baiyang street, Hangzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang

Applicant before: Hangzhou Ao Tai Bioisystech Co., Ltd

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP02 Change in the address of a patent holder
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 310053 factory building 5, building 4, building 3, No. 550, Yinhai street, Baiyang street, Hangzhou Economic and Technological Development Zone, Jianggan District, Hangzhou, Zhejiang Province

Patentee after: Hangzhou Aotai biotechnology Limited by Share Ltd

Address before: 311121 workshop 2, third, fourth floor, workshop 550, Yinhai street, Baiyang street, Hangzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang

Patentee before: Hangzhou Aotai biotechnology Limited by Share Ltd