CN105907724A - 一种脊髓灰质炎ⅱ型病毒单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域和疫苗领域。具体地，本发明涉及一种保藏编号为CGMCC No.12291的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株、由所述杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体以及所述杂交瘤细胞株及所述单克隆抗体的应用。

Description

一种脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。

背景技术

脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的严重危害儿童健康的急性传染病，该病毒为嗜神经病毒，主要侵犯中枢神经系统的运动神经细胞，以脊髓前角运动神经元损害为主。患者多为1～6岁儿童，主要症状是发热，全身不适，严重时肢体疼痛，发生分布不规则和轻重不等的迟缓性瘫痪，俗称小儿麻痹症。脊髓灰质炎临床表现多种多样，包括程度很轻的非特异性病变，无菌性脑膜炎(非瘫痪性脊髓灰质炎)和各种肌群的弛缓性无力(瘫痪性脊髓灰质炎)。脊髓灰质炎患者，由于脊髓前角运动神经元受损，与之有关的肌肉失去了神经的调节作用而发生萎缩，同时皮下脂肪、肌腱及骨骼也萎缩，使整个机体变细。

已知脊髓灰质炎病毒有3个血清型，这3个血清型病毒的核苷酸数目为7500个左右。虽然有71％左右的核苷酸为3个型别脊髓灰质炎病毒所共有，但不相同的核苷酸序列却都位于编码区内，因此3个型别病毒间中和试验无交叉反应。用抗原抗体结合试验可查出病毒有两种抗原，一种称为D(致密)抗原，另一种称为C(无核心)抗原。前者存在于成熟的、有感染性的病毒颗粒中，是该病毒的中和抗原，具有型特异性。C抗原存在于经过56℃灭活、或者未成熟的空心病毒颗粒中，是一种耐热的抗原成份。D抗原与C抗原均可与病毒的抗血清均呈抗原抗体结合阳性反应。D抗原相对C抗原的一个优势是其含量可以很好地反映免疫原性效力。

口服脊灰减毒活疫苗推广后，全球消灭脊灰行动取得了令人瞩目的成绩。但是实现全球消灭脊灰的目标尚存在许多障碍和挑战。2008年在尼日利亚脊灰死灰复燃后，蔓延到邻近的8个国家。而在1995～1996年及1999年，我国云南和青海省发生了分别由缅甸和印度输入的脊灰野毒株病例，经当地疾病预防控制部门采取紧急措施后，才未发生二代病例。

自50年代中期以来，一直采用Salk灭活疫苗及Sabin减毒活疫苗，免疫效果良好，极大地降低了脊髓灰质炎的发病率。Salk疫苗由3个型别病毒经甲醛灭活后混合制成，肌肉注射，可诱导机体产生中和抗体。其优点是便于保存及运输，无减毒株返祖现象，且副作用较少。Sabin疫苗是用减毒变异株制成，采用口服，方法简便，不但可使机体产生抗体，还能刺激肠壁浆细胞产生分泌型IgA，对野毒株有消灭作用，从而切断其在人群中的传播，因而Sabin疫苗的免疫效果更好。

目前国际上正在推行的3价疫苗为采用减毒的Sabin株经过灭活、纯化后配制而成的注射剂型疫苗，该疫苗不仅免疫保护效果好，而且避免了毒力返祖的危险。Sabin株脊髓灰质炎病毒是WHO推荐使用的安全毒株，可用于疫苗的研究和临床检测。

脊髓灰质炎病毒抗体是指动物或人体抗脊髓灰质炎各型别病毒产生的IgG、IgM等类型抗体的总称，广泛应用于脊髓灰质炎病毒鉴定、脊髓灰质炎疫苗以及各型别抗原的定性和定量检测中。

由于目前脊髓灰质炎Ⅱ型病毒抗原检测普遍采用的多克隆抗体包被——多克隆抗体夹心的检测体系，该体系不仅对于Ι、Ⅲ型存在较大的交叉反应，而且不能很好的区分D抗原和C抗原，尤其在用于3个型别混合疫苗Sabin IPVⅡ型抗原检测时，由于交叉反应导致检测结果不能真实反应Ⅱ型抗原的含量以及疫苗Ⅱ型的免疫原性，同时WHO也推荐采用多克隆抗体与单克隆抗体匹配的方式检测三价脊灰疫苗中的各型抗原含量；目前国际上尚缺乏Sabin IPV D抗原检测的标准化的试剂，制备特异性好，具有中和活性的单克隆抗体，可为SabinIPV体外效力检测方法的标准化奠定基础。因此，有必要制备一种型特异的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体，用于Ⅱ型脊髓灰质炎抗原、抗体的检测与病毒的鉴别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体，用于脊髓灰质炎Ⅱ型病毒抗原含量或抗体含量的检测。本发明的另一目的在于提供上述单克隆抗体的应用。

因此，在第一方面，本发明首先提供一种分泌Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株JⅡ-175，该细胞株于2016年5月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.12291。

在第二方面，本发明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株JⅡ-175即保藏编号为CGMCC No.12291的杂交瘤细胞在制备用于诊断脊髓灰质炎的诊断剂中的应用。

在第三方面，本发明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株JⅡ-175即在制备用于预防或治疗脊髓灰质炎的药物中的应用。

在第四方面，本发明还提供了脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体，该抗体采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备。

在一个实施方案中，所述制备可以包括以下步骤：将经脊髓灰质炎II型病毒原液免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体的交瘤细胞，将该杂交瘤细胞接种小鼠腹腔，由此制备含有特异性脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体的腹水。

在一个进一步的实施方案中，所述小鼠经纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒原液免疫，所述纯化灭活的Sabin株II型脊髓灰质炎病毒液的制备方法为例如以下示例的方法：取II型病毒制备的工作种子批毒种按MOI＝10～0.05接种Vero细胞或其他原代、传代细胞，接种病毒时细胞的浓度为0.1-10×10⁶细胞/ml，病毒培养后收获细胞上清，即为Sabin株脊髓灰质炎II型病毒收获液，浓缩(例如通过超滤膜包)10倍以上后，进行分子筛层析和离子交换层析以及甲醛灭活后即得纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒原液。

在一个具体实施方案中，所述脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体由第一方面的分泌Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株JⅡ-175即保藏编号为CGMCC No.12291的杂交瘤细胞株分泌获得。

在一个实施方案中，所述脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体不进行任何标记。

在另一个实施方案中，所述脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体经生物标记或化学标记。优选地，所述脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体经酶标记。优选地，所述的酶为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。

在第五方面，本发明提供了第四方面的单克隆抗体在制备用于检测脊髓灰质炎Ⅱ型病毒抗原的检测剂中的应用。

在第六方面，本发明提供了第四方面的单克隆抗体在制备用于检测脊髓灰质炎Ⅱ型病毒抗体的检测剂中的应用。

在制备用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗原或抗体的检测剂的过程中，上述第四方面的单克隆抗体在不进行生物标记或化学标记时，可以通过添加经生物标记或化学标记(例如诸如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶标记)的第二抗体来进行，即以一个物种的抗脊髓灰质炎病毒抗体作为包被抗体，以本发明的单克隆抗体为捕获抗体，以上述经生物标记或化学标记的第二抗体作为检测抗体，用于检测或制备检测试剂。

在第七方面，本发明提供了一种用于检测脊髓灰质炎Ⅱ型病毒抗原或抗体的试剂盒，含有第四方面的单克隆抗体。

本发明提供了一种可以用于生产脊髓灰质炎治疗性抗体的改造的细胞株，以及包含于细胞株的保护性抗体的基因信息。

本发明提供的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体具有如下一个或多个或全部的有益效果：

1.本发明的单克隆抗体具有较高的效价即反应性，间接法效价可达10⁵以上。

2.本发明的单克隆抗体具有较好的中和病毒的能力，对于脊髓灰质炎II型病毒的中和效价大于1：16384。

3.本发明的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体可以特异性地区分开脊髓灰质炎II型病毒与Ⅰ、Ⅲ型病毒，不与后者反应，是能够与脊髓灰质炎II型病毒特异性结合的单克隆抗体。

4.本发明的单克隆抗体与甲肝病毒、肠道病毒71型病毒、柯萨奇A16病毒等无交叉反应，有较好的病毒特异性。

5.本发明提供了一种技术构思全新的技术方案，即第四方面的单克隆抗体。

6.本发明的单克隆抗体基本上仅与作为可产生中和抗体的抗原D抗原反应，因此可以作为反映疫苗保护效果的有效工具。

7.除了与Sabin株脊髓灰质炎II型病毒发生特异性反应之外，本发明的单克隆抗体还可以与目前在国内外市售的由野毒株Mahoney株脊髓灰质炎II型病毒制备的脊髓灰质炎灭活疫苗发生反应，因此具有相当的广谱性，可以广泛应用。

8.本发明的单克隆抗体可广泛应用于脊髓灰质炎Ⅰ型病毒的检测、鉴别、筛查与对疫苗生产的抗原检测以及流行病调查中；同时检测的是Ⅱ型特异性抗原，可以更加有效地反映反应混合疫苗的Ⅱ型抗原含量，对疫苗的工艺研究与生产以及疫苗产品的质量控制和质量研究具有重要意义。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。

实施例1 免疫原制备与动物免疫

(1)取Vero细胞工作细胞库复苏后于36.5±0.5℃培养，至细胞浓度为0.1-10×10⁶细胞/ml时，接种病毒。

(2)取Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒制备的工作种子批毒种按MOI＝5～0.1接种Vero细胞，置32.5±0.5℃培养。

(3)病毒培养2～4天,收获细胞上清，即为Sabin株脊髓灰质炎病毒II型病毒收获液。

(4)Ⅱ型病毒收获液澄清后用超滤膜包浓缩10倍以上。

(5)然后进行分子筛层析和离子交换层析，监测波长为280nm，分别收集洗脱液和流穿液，即得纯化液，甲醛灭活后即得纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒原液。

(6)将纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒原液与弗氏佐剂(首次免疫为弗氏完全佐剂，后期免疫为弗氏不完全佐剂)等体积混合乳化后于第0天、14、28天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，0.2ml/只。

(7)于第39天以纯化灭活后的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒原液静脉注射小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行细胞融合。

实施例2 细胞融合及建株

(1)细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除RPMI 1640细胞培养液(Gibco)，重新添加培养液，准备SP2/0细胞。

(2)处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液。

(3)根据脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全IMDM培养液(Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与SP2/0细胞按1:2～10:1混合于50ml离心管中，混匀。

(4)加不完全IMDM培养液至50ml，离心5-10分钟，倒净上清。轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，离心管置37℃水浴，准备融合。

(5)将37℃预热的50％的PEG4000 1ml用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动离心管，使细胞保存在混匀状态。

(6)静置90秒后立即缓慢加入15ml无血清的IMDM培养基(Gibco)(37℃)，然后离心5-10分钟，弃去上清。

(7)加入IMDM完全培养液(Gibco)，混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中，100μl/孔，于37℃、5％CO₂培养箱内培养。

(8)第2天向细胞板加HAT培养液(IMDM含1*HAT(Sigma))100μl/孔。

(9)每2-3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基(IMDM含1*HT(Sigma))，观察融合细胞生长状况。

(10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。

(11)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的32个细胞系，综合抗体效价和特异性(测试方法见下文)两个指标，我们选择其中一个最好的细胞系，将其命名为JⅡ-175，冻存该细胞。将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏编号为CGMCC No.12291，分类命名为：脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏时间：2016年5月11日；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

实施例3 单克隆抗体细胞株腹水制备及抗体ELISA法效价检测

按常规方法将冻存的实施例2获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养，待细胞覆盖25ml的细胞培养瓶瓶底50％以上时即可按照常规方法腹腔接种BALB/c小鼠，定期收集腹水JⅡ-175。

将纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒采用0.01M PBS1:200稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜，然后100μl/孔加入1:10²起始10倍梯度稀释的阴性对照和JII-175单克隆抗体腹水，37℃反应1小时，100μl/孔加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠二抗，37℃反应1小时后洗板、显色、终止，读取OD450nm，由此检测本发明杂交瘤细胞分泌的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒腹水JⅡ-175的间接ELISA法抗体效价，抗体效价达10⁵以上，效价较高。结果见表1。

表1 抗体效价检测结果

实施例4 单克隆抗体细胞株腹水中和抗体效价检测

将JII-175单克隆抗体腹水、阴性和阳性血清对照进行2倍梯度稀释，然后50μl/孔加入细胞板，各稀释度平行添加2孔，然后每孔加入100CCID50/0.05ml的II型脊灰病毒，35.0±0.5℃培养箱孵育后加入100μl/孔0.2-1.6×10⁵的Vero细胞悬液，继续培养5～7天判定结果，检测本发明杂交瘤细胞分泌的脊髓灰质炎Ⅰ型病毒腹水JII-175的中和抗体效价。中和抗体效价达1：16384以上，效价较高。

实施例5 抗体型特异性检测结果

将纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎Ι型和Ⅲ型病毒原液采用0.01M PBS 1:10稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜，检测实施例3获得的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体腹水JⅡ-175的抗体效价，同时设置阴性和阳性对照，均为阴性。结果见表2。

表2 间接ELISA法抗体型特异性检测结果

本发明中阳性对照具有较好的反应性，阴性对照无反应，试验成立。JⅡ-175细胞株分泌的单克抗体(JⅡ-175)不与脊髓灰质炎Ⅰ型和Ⅲ型病毒反应，说明本发明的单克隆抗体能够区分开脊髓灰质炎病毒Ⅱ型与Ⅰ型、Ⅲ型病毒，本发明的JⅡ-175杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体在用于脊髓灰质炎疫苗(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒混合的样品)的抗原含量检测时可以特异地识别脊髓灰质炎Ⅱ型抗原，而不被其他两型干扰，具有较好的型特异性和应用价值。

实施例6 抗体对D抗原反应特异性的检测结果

将Sabin株脊髓灰质炎II型实心病毒(D抗原)、空心病毒(C抗原)、D抗原56℃加热30min后病毒(热处理C抗原)均用0.01MPBS 1:200倍稀释后100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜；将本发明中的细胞株分泌的单克隆抗体(JII-175)以1:10²起始10倍梯度稀释后100μl/孔加入酶标板，同时做阴性对照。其后试验步骤与实施例3相同，检测本发明杂交瘤细胞分泌的脊髓灰质炎II型病毒腹水JII-175对上述抗原的效价及特异性，结果见表3。

表3 抗体对D抗原反应特异性检测结果

结果可见，脊髓灰质炎II型病毒腹水JII-175仅对II型实心病毒具有较强的反应性，效价大约10⁵，对于空心病毒以及热处理病毒均不反应。文献显示，仅实心病毒(D抗原)可以产生针对脊灰II型病毒的保护性抗体。本试验表明，该单抗仅能检测有效抗原即D抗原，对于无效抗原无反应性，具有较好的有效抗原的识别能力，可以将它用于有效抗原表位与含量的检测，意义重大。

实施例7 抗体亚类测定

将纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒原液采用0.01M PBS1:10倍稀释后100μl/孔包被酶标板2-8℃过夜，然后采用Sigma公司ISO2-1KT鼠单克隆抗体分型试剂按照单克隆抗体亚类试剂说明书进行试验，最后加入HRP标记的兔抗羊二抗进行单克隆抗体亚类鉴定。结果显示本发明的单克隆抗体为IgG1型。

实施例8 免疫印迹(Western blotting)实验

将纯化灭活的Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒原液采用BIO-RAD的电泳电转设备使用12％的SDS-PAGE电泳胶进行电泳，之后再电转到硝酸纤维素膜，然后以本发明杂交瘤细胞腹水为一抗(1：2000)、AP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blotting鉴定。结果显示，杂交瘤细胞JⅡ-175分泌的单克隆抗体与Sabin株脊髓灰质炎型病毒VP1、VP2、VP3、VP4均不反应，表明该单克隆抗体与变性后的抗原不能产生反应，说明本发明杂交瘤细胞JⅡ-175分泌的单克隆抗体JⅡ-175不能识别线性表位，是构象性单克隆抗体，识别空间结构。

实施例9 亲和常数测定

在本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体JⅡ-175纯化后检测蛋白质含量。采用1:5、1:10、1:20稀释的不同浓度的Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒横向包被酶标板，100μl/孔，2-8℃包被过夜。第二天洗板后37℃封闭2小时，拍干待用。将纯化单克隆抗体JⅡ-175二倍梯度稀释，纵向加入包被后的酶标板，采用间接ELISA法检测抗原抗体反应的OD值。以各抗原浓度下的曲线平坦段的OD值计为100％，计算50％OD值，考察50％OD值所对应点的单克隆抗体浓度[Ab]t，再根据亲和常数计算公式可以得到本发明的单克隆抗体的亲和常数为1.132×10⁹M^-1。

实施例10 杂交瘤细胞系分泌单克隆抗体的稳定性检测

分别在3个月和12个月后，从液氮中取出冻存的JⅡ-175杂交瘤细胞株进行复苏、扩大培养后，制备腹水，进行间接ELISA检测抗体效价，以前期制备的腹水为对照进行同时检测。结果本发明的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体腹水效价达到10⁵以上，与前期腹水效价无差异，表明细胞保藏后制备的腹水的效价未下降。因此本发明的单克隆细胞株分泌抗体的活性没有降低，稳定性良好。

实施例11 抗原含量检测试剂盒的初步结果

将脊髓灰质炎Ⅱ型病毒兔多克隆抗体采用0.05M碳酸盐缓冲液1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜。封闭液37℃封闭2小时，分别加入脊髓灰质炎Ⅱ型抗原参比品和3批脊髓灰质炎灭活疫苗(所述脊髓灰质炎灭活疫苗包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型灭活病毒)，37℃反应1小时，洗板后加入1:8000的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体JⅡ-175，37℃反应1小时，洗板后加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，检测脊髓灰质炎灭活疫苗的Ⅱ型抗原含量。结果见表4。

表4 抗原含量检测方法的应用

采用本发明建立的抗原含量检测方法检测了3批脊髓灰质炎灭活疫苗中的Ⅱ型抗原含量，检测值相对于理论值的回收率在92％-117％之间，满足质量标准的要求，在酶联免疫法允许的误差范围以为，检测方法准确可靠。本发明具有较好的应用效果。

实施例12 抗原含量检测试剂盒的特异性研究

将脊髓灰质炎Ⅱ型病毒兔多克隆抗体采用0.05M碳酸盐缓冲液1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜。然后37℃封闭2小时，分别加入Sabin株脊髓灰质炎Ι、Ⅱ、Ⅲ型病毒原液、甲肝灭活疫苗原液、柯萨奇A16(CA16)灭活疫苗原液、CA16收获液、肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗原液、EV71收获液，37℃反应1小时，洗板后加入1:8000的脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体JⅡ-175，37℃反应1小时，洗板后加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，检测样品的Ⅱ型抗原含量，结果见表5。

表5 单克隆抗体特异性(OD值)

本发明的单克隆抗体与Sabin株脊髓灰质炎Ⅰ型和Ⅲ型病毒原液、甲肝灭活疫苗原液、CA16灭活疫苗原液、CA16收获液、EV71灭活疫苗原液、EV71收获液均不反应，表明本发明的单克隆康体可以有效区分上述病毒，同时采用本发明建立的体系和培养基以及Vero细胞培养物不存在交叉反应，可以有效检出脊髓灰质炎Ⅱ型抗原，具有高度的特异性。利用作为脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合疫苗中各型抗原最关键指标的特异性，本发明的单克隆抗体可对脊髓灰质炎I、II、III型混合疫苗进行有效区分：检测Ⅱ型抗原时，本发明的单克隆抗体不与Ι、Ⅲ型抗原交叉反应，因此可以有效检测脊髓灰质炎Ⅱ型抗原含量。

实施例13 抗原含量检测试剂盒对D抗原的检测

将脊髓灰质炎Ⅱ型病毒兔多克隆抗体采用0.05M碳酸盐缓冲液1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜。封闭液37℃封闭2小时；将Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒(D抗原)、以及脊髓灰质炎灭活疫苗56℃加热30min，然后将样品加入酶标板。后续试验同实施例12，考察检测试剂盒对于加热前和加热后的样品中D抗原的检测效果。结果见表6。

表6 本发明的单克隆抗体对Ⅱ型有效抗原的检测结果

根据现有文献中的记载以及本发明人在先的研究，脊髓灰质炎病毒原液和灭活疫苗经过56℃加热30min后免疫动物，动物的免疫血清的中和效价极低，表明经热处理的样品中的脊髓灰质炎病毒不再具有免疫原性。而在本申请中，根据表6，本发明的单克隆抗体与Sabin株脊髓灰质炎II型病毒原液以及灭活疫苗具有良好的反应，但与加热后的上述样品具有较差的反应，均低于3％，这表明抗原含量的检测结果与现有的动物试验的免疫原性具有良好的一致性。

另外，已知多克隆抗体-多克隆抗体的脊髓灰质炎抗原含量检测系统与加热后的脊髓灰质炎病毒依然具有较强的反应，和现有的动物试验的免疫原性结果不一致。因此，本发明单克隆抗体的检测系统能够较好地检测D抗原，更好地反映疫苗的保护效果，检测结果更理想，更适合用于疫苗的中间产品和终产品的质量控制。

本发明的单克隆抗体在用于抗原含量检测时，可以作为双抗体夹心ELISA检测的试剂盒的包被抗体，也可对它进行生物标记或化学标记，作为双抗体夹心ELISA检测试剂盒的夹心酶标抗体；同时，也可以将它和另一物种的多克隆抗体配对使用，通过加入夹心抗体的第二酶标抗体的方法制备抗原含量检测试剂盒。

本发明用于抗体检测试剂盒时，可以作为包被抗体或者酶标竞争抗体，也可以作为竞争抗体并加入抗鼠酶标二抗的方法进行检测。

实施例14 抗原含量检测试剂盒对市售各毒株脊髓灰质炎II型病毒的检测

将脊髓灰质炎II型病毒兔多克隆抗体采用0.05M碳酸盐缓冲液1:4000稀释，100μl/孔包被酶标板，2-8℃过夜后封闭，然后加入Sabin株脊髓灰质炎II型抗原参比品及其脊髓灰质炎灭活疫苗，以及Mahoney株国际标准品及其脊髓灰质炎灭活疫苗(所述脊髓灰质炎参比品、标准品、灭活疫苗均包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型灭活病毒)，37℃反应1小时，洗板后加1:8000的脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体JII-175，37℃反应1小时，洗板后加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1小时后洗板进行显色、终止、读数，检测脊髓灰质炎灭活疫苗的II型抗原含量。结果见表7。

表7 抗原含量检测方法的应用

目前已在国际上广泛销售的上市脊髓灰质炎灭活疫苗的II型病毒包括Sabin株和Mahoney株两种，均可有效预防由于II型脊髓灰质炎病毒带来的感染。采用本发明的细胞株制备的单抗腹水JII-175建立的双抗体夹心检测系统，对于Sabin株和Mahoney株两种脊髓灰质炎灭活疫苗中的II型D抗原的检测结果回收率在95％-110％之间，在酶联免疫法允许的误差范围以内，回收率较好，检测方法准确可靠。表明，采用该单抗可以有效检测市售疫苗中的II型D抗原含量，对市售疫苗的产品质量研究与质量控制具有广谱适用性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.12291。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备用于诊断脊髓灰质炎的诊断剂中的应用。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备用于预防或治疗脊髓灰质炎的药物中的应用。

4.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为经生物标记或化学标记的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为酶标记的单克隆抗体。

7.权利要求4-6任一项所述的单克隆抗体在制备用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗原的检测剂中的应用。

8.权利要求4-6任一项所述的单克隆抗体在制备用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗体的检测剂中的应用。

9.一种用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗原或抗体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4-6任一项所述的单克隆抗体。

10.一种制备权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，所述方法包括采用纯化灭活的脊髓灰质炎II型病毒免疫小鼠。