CN107090438A - 抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明对分泌抗血清I型MDV gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行3轮亚克隆筛选，获得了一株命名为A2E10B8的杂交瘤细胞株，该细胞产生的单克隆抗体仅能与血清I型MDV gI蛋白发生特异性结合反应，而与其它MDV血清型(血清2型、3型)不发生反应。继而经体外间接免疫荧光试验表明，A2E10B8单克隆抗体仅能与血清I型MDV病毒蚀斑结合，产生特异性绿色荧光，而与其它血清型MDV病毒蚀斑不能结合，不产生绿色荧光，证明该A2E10B8单克隆抗体是MDV血清I型特异性单克隆抗体。本发明的提出为血清I型MDV的基因工程诊断试剂的研制和MDV二价或多价疫苗检验提供了有力工具。

Description

抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细 胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其应用，尤其涉及一种抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其在检测MDV-1相关领域中的应用，本发明属于分子免疫学技术领域。

背景技术

鸡马立克氏病(Mareks disease，MD)是由鸡马立克氏病病毒(Mareks diseasevirus，MDV)引起的一种禽淋巴组织增生性疾病，具有高度传染性，主要引起内脏器官、外周神经及皮肤的T细胞淋巴瘤。近年来MDV毒力不断增强，给禽养殖业带来了更大的挑战。

根据血清学相关性，MDV分为3个血清型：血清1型(MDV-1)，即禽疱疹病毒2型(GaHV-2)，具有致瘤性，能够引起MD的致瘤型毒株；血清2型(MDV-2)，即禽疱疹病毒3型(GaHV-3)，非致瘤型毒株；血清3型(MDV-3)，即火鸡疱疹病毒(MeHV-1)，是用于MD疫苗的非致瘤型毒株(Biggs,2001)。其中，GaHV-2又被划分为4种致病型，分别为温和型(m，如CU-2株)，强毒力型(v，如GA和JM/102W株)，超强毒力型(vv，如Md5和RB-1B株)和超超强毒力型(vv+，如584a和648a株)(Witter,1997；Witter et al.,2005)。三种血清型的毒株之间具有血清学交叉反应。

1997年，Calnek和Witter阐述了MD的致病机理，详细阐述了MD致病过程的主要阶段。一般认为，MD主要通过呼吸系统感染机体，引起脾脏、法氏囊、胸腺及其他组织器官的B细胞溶解性感染；随后发生炎症反应，招募大量的炎症细胞，包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞；T淋巴细胞被激活，发生潜伏感染(Calnek,2001)。感染的早期，形成全身细胞结合性病毒血症。随后病毒转移至羽毛囊上皮细胞向外界排放病毒粒子，这是机体向外界环境排放病毒的唯一部位(Calnek et al.,1970)。脱落的羽毛囊细胞呈角质化，不仅可以保护细胞内病毒，而且能够维持病毒感染力达一年之久(Hlozanek et al.,1973；Schat etal.,1985)。在潜伏期，淋巴细胞内病毒DNA的拷贝数较低(不足5个拷贝)。溶细胞阶段，初级淋巴器官受到损害并导致免疫抑制。在受感染家禽体内，潜伏感染的CD4+T细胞转化形成肿瘤细胞(Schat et al.,1991)，内含大量的病毒DNA(至少10～20个拷贝)并有大量的病毒基因得以表达，最终导致宿主死亡。

MDV-1重要功能基因主要包括：直接致瘤基因：meq和vTR；间接致瘤基因：vIL-8、vLIP、RLORF4和pp38；立即早期基因：ICP4和ICP22；囊膜糖蛋白：gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK和gM等；复制相关基因：ΜL5、ΜL8、ΜL9、ΜL29、ΜL30、ΜL42、ΜL52等。gI是MDV的主要囊膜糖蛋白之一，可与gE蛋白形成异二聚体复合物(BALAN,1994)，促进糖蛋白的成熟并协助糖蛋白在胞浆的转运及正确分布，是病毒复制的必需蛋白(Ye et al.,1999)。通过免疫共沉淀试验表明gI和gE之间可相互作用形成gE/gI复合物(Tan et al.,2001)。用BAC克隆构建的gM、gI和gE基因缺失突变株，不能传播病毒感染((Schumacher et al.,2001)，表明这些基因编码的糖蛋白是病毒复制必需蛋白。

MDV普遍存在于养殖鸡群，鸡感染后能够引起神经炎症以及内脏与皮肤的肿瘤，导致鸡消瘦和死亡。同时导致免疫细胞感染，造成细胞死亡，降低机体抵抗力，增加继发感染的机会。1970年，HVT Fc126株首次作为疫苗应用于临床MD的防控，实践表明该疫苗能够产生抗MD保护性免疫(Okazaki et al.,1970；Purchase et al.,1972)，并减少疾病造成的相关损失(Purchase and Okazaki,1971；Witter,1998)。然而，随着MDV的毒力的不断增强，HVT已不能为MDV感染提供完全保护(Baaten et al.,2004；Parcells et al.,2003)。

HVT与MDV-1致弱毒株、MDV-2型联合组成的双价或三价苗(Schat and Calnek,1978；Witter,1987)的广泛使用，有效地降低了MD带来的损失。但是，由于高效疫苗的普遍应用，导致了MDV毒力不断增强，给家禽养殖业带来了更大的挑战(Gimeno,2008；Venugopal,2000)。

我国当前广泛使用的疫苗毒株为MDV-1的CVI988/Rispens(CVI988)株和我国自主研发的高效MDV-1活疫苗814株(Zhang et al.,2012)，以及MDV-1和HVT组成的双价疫苗。由于不同血清型毒株之间具有免疫协同作用，这样的双价疫苗具有免疫效力上的优势，便于在MD发病严重的地区控制MD。

MD疫苗需要1日龄免疫。免疫7日，可以终生受益。接种疫苗并不能阻止双重感染和排毒，这对宿主将是一个更大的挑战，也是MDV野毒株不断进化的一个重要原因。近几年以来，MDV的毒力在不断上升，尤其是疫苗使用以来这种形势一直持续。这就刺激新的疫苗策略，目前，不同血清型病毒组合的双价苗，主要是血清1型和血清3型组成的双价苗，较好的兼顾安全性和免疫效力。

MDV是一种大分子的疱疹病毒，基因组编码100种以上的蛋白，血清学检测过程中经常会发生非特异性反应，并且检测的敏感性较低，影响检测和诊断结果。同时，3种血清型病毒编码的蛋白种类大多相似，存在血清学交叉反应，给血清学诊断带来困难。因此，研制一种针对MDV表面主要囊膜糖蛋白、且能特异性与血清1型MDV反应的单克隆抗体，对于MD的血清学诊断具有重要意义和应用价值。另外，对于应用广泛的MD多价疫苗，正确的疫苗配比是疫苗免疫效力的保证。在生产和检验过程中，尤其是在产成品检验中，特异性结合血清1型MDV的单克隆抗体是必备的技术条件。能够区分血清型的单克隆抗体具有现实应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡马立克氏病病毒血清I型特异性单克隆抗体、分泌该抗体的杂交瘤细胞株及其用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

为制备分泌抗鸡马立克氏病病毒gI囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，本发明将原核表达获得的gI重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，通过淋巴细胞杂交瘤技术，共筛选获得多株能够稳定分泌抗MDV gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中一株经抗体亚型鉴定为IgG1型，轻链为κ链，该单克隆抗体具有马立克氏病病毒血清I型特异性，即该单克隆抗体只与马立克氏病病毒血清I型病毒反应，而与其它马立克氏病病毒血清型无特异性反应。

将该稳定分泌抗血清I型鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus，MDV)gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2E10B8，分类命名为鼠杂交瘤融合细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；其微生物保藏号是：CGMCC No.13817；保藏时间是：2017年3月29日。

由所述的杂交瘤细胞分泌产生的单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的杂交瘤细胞及/或所述的单克隆抗体在以下方面的用途：

1、所述的杂交瘤细胞及/或所述的单克隆抗体在制备检测或诊断鸡马立克氏病病毒感染的试剂中的用途。其中，优选的，所述的鸡马立克氏病病毒为血清I型鸡马立克氏病病毒。

例如在分离的MDV病毒，可以通过该单克隆抗体的间接免疫荧光检测法，检测或诊断分离的MDV病毒是否为马立克氏病病毒血清I型。

2、所述的杂交瘤细胞及/或所述的单克隆抗体在制备鸡马立克氏病病毒血清分型试剂中的用途。

3、所述的杂交瘤细胞及/或权利要求2所述的单克隆抗体在鸡马立克氏病病毒抗原表位分析与鉴定中的用途。

其中，优选的，所述的鸡马立克氏病病毒为血清I型鸡马立克氏病病毒。

4、所述的杂交瘤细胞及/或所述的单克隆抗体在鸡马立克氏病病毒二价或多价疫苗检验中的用途。

其中，优选的，所述的二价或多价疫苗中含有血清I型鸡马立克氏病病毒。

更进一步的，本发明还提出了一种用于检测或诊断鸡血清I型马立克氏病病毒的试剂，其特征在于，所述试剂的有效成分包括本发明所述的单克隆抗体。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

由本发明制备得到的杂交瘤细胞株分泌产生的抗血清I型MDV gI蛋白的单克隆抗体仅能与血清I型MDV gI蛋白发生特异性结合反应，而与其它MDV血清型(血清2型、3型)不发生反应。本发明为基于A2E10B8单克隆抗体的基因工程诊断试剂的研制和MDV二价或多价疫苗检验中的应用提供了有力工具。具体的在疫苗的成品检验中的应用：检测MDV二价疫苗(血清1+2型或血清1+3型)中MDV血清1型的病毒效价，具体的利用A2E10B8单克隆抗体作为一抗的间接免疫荧光，通过荧光蚀斑计数法，确定MDV血清1型的病毒效价，进而确定另外一个血清的病毒效价。

附图说明

图1为A2E10B8细胞株McAb血清型特异性的鉴定检测结果。

图2 A2E10B8单克隆抗体杂交瘤细胞染色体计数分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所使用的生化试剂：

琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、Agar均为分析纯化学试剂，购于上海华舜生物工程有限公司；pMD18-T、LA Taq DNA聚合酶均购于TaKaRa生物工程有限公司；限制性内切酶NotⅠ和XhoⅠ、T4DNA Ligase及Protein Ladder均购于Fermentas公司；DMEM细胞培养培养基、胎牛血清均购于Hyclone公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT储存液(50×)、HT储存液(50×)、PEG1450、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG均购于SIGMA公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购于Promega公司；ELISA酶标板购于JET BIOFIL生物制品有限公司；TMB显色液购于天根生物技术有限公司；增强型DAB显色液、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotech公司。

实施例1稳定分泌抗血清I型MDV gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备

1、滋养细胞的制备

具体步骤如下：

(1)脱颈致死8周龄小鼠，75％酒精对其消毒，固定于解剖板上；

(2)在无菌安全柜内，由后向前剪开腹部皮肤，注射器吸取腹腔内巨噬细胞，悬于HAT培养液内；

(3)加入96孔培养板，100μL/孔，于培养箱内过夜培养；

(4)观察细胞生长状况，贴壁情况，以及是否污染，判定饲养层细胞是否可用。

2、脾细胞的制备

(1)小鼠免疫

将编码血清I型MDV gI蛋白的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET30a中，以原核表达的血清I型MDV gI蛋白作为免疫抗原，剂量为100μg/只。按1：1比例与弗氏完全佐剂混合，充分乳化后腹腔注射4-6周龄BALB/c小鼠；在一免后第14天将免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，免疫部位和剂量同前，进行第二次免疫；二免后第7天，小鼠尾部采血检测血清抗体效价；在二免后第14天重复二免过程，免疫部位和剂量同前，为第三次免疫；7天后尾部采血测定效价，最后加强免疫，由腹腔直接注射2倍剂量免疫原，不使用佐剂，剂量同前。

(2)将已经加强免疫的小鼠，摘眼球采集血液，分离血清作为间接ELISA检测时的阳性对照。小鼠脱颈致死后，75％酒精浸泡消毒，固定于解剖板上。

(3)用高压灭菌的剪刀镊子，于剖开腹腔，轻轻剥离脾脏；将脾脏置于含10mL DMEM培养液的平皿内，轻轻洗涤，并用镊子仔细剥离表面增生的结缔组织；

(4)将脾脏转移入另一含有10mL DMEM细胞培养培养液的平皿内，用注射器吸取平皿内的DMEM细胞培养液，注入小鼠脾脏，将脾细胞吹出；

(5)收集平皿内的脾细胞悬液于50mL离心管内，27℃，1000rpm，水平离心10min；弃上清，将细胞重悬于10mL DMEM细胞培养液；

(6)进行细胞计数，备用。

3、细胞的融合

(1)将上述制备的SP2/0细胞和小鼠脾细胞按照1:5～1:10的比例混合于50mL离心管，补加DMEM细胞培养液至40mL左右，轻轻混匀之。

(2)27℃，1000rpm，水平离心10min，弃上清。

(3)将离心管于掌心轻击，使沉淀的细胞彻底松散均匀；

(4)将离心管置于37℃水浴保温；向离心管滴加预热的PEG1450 1mL(要在1min左右加完，不能过快或过慢)；将离心管小心静置1min；

(5)向离心管内滴加预热DMEM细胞培养液，最后定容至40mL；

(6)800rpm，室温离心10min左右，弃去上清；

(7)用50mL HAT培养液重悬细胞，将之加入含有饲养层细胞的细胞培养板，100μL/孔于细胞培养箱中培养。

(8)5d后，用HAT培养液换出50％培养液；7d后，用HT培养液换出HAT培养液；

(9)10d时，吸取杂交瘤细胞上清，检测抗体的效价。

4、杂交瘤细胞的亚克隆与筛选

吸取杂交瘤细胞上清加于酶标检测板孔内，用建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞上清进行抗体检测，每次检测设立阴阳性对照，读取OD 450nm数值，以P/N≥2.1判为阳性。将判定为阳性的细胞孔，按照优先稀释法进行亚克隆。3次亚克隆后获得多株能够稳定分泌抗MDV gI蛋白抗体的杂交瘤细胞株，其中，一株稳定分泌抗血清I型MDV gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2E10B8，分类命名为鼠杂交瘤融合细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC No.13817；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2017年3月29日。

5、A2E10B8杂交瘤细胞株McAb腹水的制备及效价的测定

(1)致敏：液体石蜡腹腔注射8周龄小鼠，500μL/只；

(2)7d后，腹腔注射A2E10B8杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.3mL；

(3)待小鼠腹部明显胀大，可采集腹水；

(4)按照常规方法测定腹水效价。A(一抗):将A2E10B8杂交瘤细胞上清与小鼠腹水作倍比稀释，同时设立阴性、阳性血清对照，每孔100μL，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，3min/次；B(二抗)：加入5000倍稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，3min/次；显色：加入TMB底物显色液，100μL/孔，避光反应5min；终止：加2M H₂SO₄，50μL/孔，终止反应；读取OD_450nm数值。

结果，经检测，A2E10B8杂交瘤细胞株所产生的腹水效价为：1:3×10⁴。

实施例2A2E10B8杂交瘤细胞株McAb血清型特异性的鉴定

(一)McAb间接免疫荧光检测

1.将MDV血清I型病毒814A3、血清3型病毒HVT、血清II型病毒SB1分别接种原代CEF，培养至蚀斑达70％左右，弃培养液，PBS轻轻洗涤2次；冰冷的无水乙醇4℃固定细胞15min；PBS洗涤3次；加入A2E10B8杂交瘤细胞上清作为反应一抗反应，37℃孵育2h；PBS洗涤3次，3min/次；加入1:200倍稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG作为反应二抗，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，3min/次；加入适量90％甘油，置于倒置荧光显微镜下观察。设立正常CEF作为阴性对照。

结果表明：以此单克隆抗体分别与感染MDV 814、感染HVT及感染SB1的CEF反应作为实验组，同时以正常CEF为对照组。IFA结果显示只有MDV 814感染细胞可见特异性荧光信号，HVT感染细胞、SB1感染细胞及阴性对照组均未见荧光信号，说明由A2E10B8杂交瘤细胞株产生的McAb能够与MDV 814蚀斑产生特异性反应，说明该单克隆抗体为马立克氏病病毒血清I型特异性抗体，结果如图1所示。

实施例3A2E10B8单克隆抗体McAb抗体亚类鉴定

采用Southern Biotech公司生产的抗体亚类鉴定试剂盒，对获得的McAb进行亚类鉴定。具体步骤参照使用说明。A2E10B8单克隆抗体McAb亚类鉴定为IgG1型，轻链为κ链。

实施例4杂交瘤细胞株A2E10B8的染色体计数分析

采用吉姆萨染色进行染色体计数。具体步骤，如下：

(1)加秋水仙素：杂交瘤细胞A2E10B8传代24h后，加入终浓度100ug/mL秋水仙素，继续培养5h；800rpm，离心2min，收集细胞；

(2)加KCl：以预热的0.075mol/L KCl重悬细胞，37℃，静置20min；

(3)加固定液：收集细胞，加入1mL新鲜配制的固定液(冰醋酸与甲醇按照1：3混合)；

(4)加于载玻片：将杂交瘤细胞悬液滴于预冷的载玻片上，进行固定；

(5)吉姆萨染色：10％吉姆萨染色液室温染色20min；用蒸馏水轻轻洗去染液，镜检观察。结果表明杂交瘤细胞A2E10B8的染色体平均数目为68条。结果如图2所示。

Claims (10)

1.一株稳定分泌抗血清I型鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus，MDV)gI蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株命名为A2E10B8，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No.13817。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌产生的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞及/或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断鸡马立克氏病病毒感染的试剂中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的鸡马立克氏病病毒为血清I型鸡马立克氏病病毒。

5.权利要求1所述的杂交瘤细胞及/或权利要求2所述的单克隆抗体在制备鸡马立克氏病病毒血清分型试剂中的用途。

6.权利要求1所述的杂交瘤细胞及/或权利要求2所述的单克隆抗体在鸡马立克氏病病毒抗原表位分析与鉴定中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述的鸡马立克氏病病毒为血清I型鸡马立克氏病病毒。

8.权利要求1所述的杂交瘤细胞及/或权利要求2所述的单克隆抗体在鸡马立克氏病病毒二价或多价疫苗检验中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的二价或多价疫苗中含有血清I型鸡马立克氏病病毒。

10.一种用于检测或诊断鸡血清I型马立克氏病病毒的试剂，其特征在于，所述试剂的有效成分包括权利要求2所述的单克隆抗体。