CN105859842B - A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位及其应用 - Google Patents

A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位及其应用，属于口蹄疫的防治领域。所述中和表位的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示；其中，X1为任意一种氨基酸；X2为Pro、Ser、Ala、Gln、Val或Thr；X3为Leu、Val、Ala或Thr。所述中和表位与A型口蹄疫病毒抗体阳性血清的特异性反应试验表明其与A型FMDV的阳性血清呈现良好的反应能力，而与O型和Asia1型FMDV阳性血清以及A型FMDV阴性血清没有反应，试验结果证明该中和表位能够特异性区分A型FMDV的阴、阳性血清，在A型口蹄疫的诊断、预防和治疗等方面具有应用潜力。

Description

A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位及其应用
技术领域
本发明涉及中和表位，尤其涉及A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位，本发明进一步涉及所述的中和表位在诊断、预防或治疗A型口蹄疫中的应用，属于口蹄疫中和表位的鉴定以及应用领域。
背景技术
口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，FMDV基因组RNA全长约8.5kb。口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的，主要侵害牛、猪、羊等家畜及多种野生偶蹄动物的高度接触性传染病。该病的爆发和流行常常给畜牧业生产和经济发展带来巨大的损失，严重影响了经济贸易与畜牧业的发展，备受世界各国的关注。世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为A类动物传染病。
FMDV有7个血清型，分别为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial，各血清型之间无交叉免疫保护。FMDV的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离株的抗原位点和抗原表位都不尽相同。中和性抗原位点不仅决定了的血清型、基因型以及株的特异性，而且成为特异性中和抗体的靶向位点。对于多数病毒，中和性抗原位点在感染或免疫个体所建立的保护性反应中具有重要意义。
目前，中国主要流行O型、Asial型和A型FMD。近年来，中国部分地区相继发生了A型FMDV。因此鉴定出A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位对于该病的诊断和预防均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位；
本发明的目的之二是将上述的中和表位应用于诊断、预防或治疗A型口蹄疫中。
本发明为达到上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先公开了能分泌抗A型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞系以及由该杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体。
本发明利用灭活并纯化的A型口蹄疫病毒免疫BALB/c鼠，制备抗A型FMDV A/JLYS/CHA/2014株的单克隆抗体，抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得 三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为9A9、8G9和9H4。经IFA特异性鉴定，单抗9A9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型。单抗8G9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型。单抗9H4重链类型为IgG2b，轻链为κ类型。
微量细胞中和试验表明，杂交瘤细胞9A9所分泌的单抗具有很高的中和活性，其腹水中和效价高达1:4096，而杂交瘤细胞8G9所分泌的单抗腹水中和效价仅为1:89，杂交瘤细胞9H4所分泌的单抗则无中和活性；试验结果表明，杂交瘤细胞9A9所分泌的单抗的中和活性显著高于杂交瘤细胞8G9分泌单抗的中和活性。
本发明用单抗9A9对全病毒进行Western blot分析，显示明显的特异性反应条带，由此认为单抗9A9识别A型FMDV的一个线性表位。将单抗9A9培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细胞进行间接免疫荧光检测，结果显示，9A9只与A型毒株呈阳性反应，而与多个O型和Asia1型FMDV分离株均无交叉反应，可认定9A9为A型FMDV血清型特异性单抗。
鉴于杂交瘤细胞系9A9所分泌的抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体为A型FMDV血清型特异性单抗，且有高中和活性，本发明将该杂交瘤细胞系9A9提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC 12049；建议的分类命名为：分泌抗A型FMDV的中和性单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年3月21日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明将制备的单抗9A9腹水，经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化，紫外分光光度计测定9A9浓度为7.64mg/ml。抗体9A9再经DEAE-sephadex a-50离子交换层析进一步纯化，用改良过碘酸钠法标记HRP。用方阵滴定法初步确定A型口蹄疫病毒抗体检测系统中A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度为6.4μg/ml，稀释倍数为1:1000；HRP-9A9最适稀释倍数为1:1500。
为了验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测中的诊断价值，用初步建立的A型口蹄疫病毒抗体检测方法分别检测不同稀释倍数的A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似(临界值)和阴性血清，同时设立O型和Asia1型FMDV强阳性血清作为对照，以验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测方法中与抗原的结合能力、以及单抗9A9区分A型口蹄疫病毒阴阳性血清的能力。用上述检测结果绘制强阳性、弱阳性、疑似(临界值)、阴性血清的抗体滴度曲线，结果表明：单抗9A9在A型FMDV抗体检测方法中与A型FMDV的强阳性、弱阳性和疑似血清呈现良好的竞争能力，而与O型和Asia1型FMDV强阳性血清以及FMDV阴性血清没有竞争性，能够特异性区分A 型FMDV的阴阳性血清，确定了单抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗体检测方法中的价值和应用潜力。
本发明进一步公开了上述单抗9A9识别的中和表位，所述中和表位的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，其中，X1为任意一种氨基酸，优选为Leu；X2为Pro、Ser、Ala、Gln、Val或Thr，优选为Pro；X3为Leu、Val、Ala或Thr，优选为Leu。
更优选的，所述中和表位的氨基酸序列为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。
本发明利用衣壳蛋白的截短表达、表位肽的GST融合表达、系列表位突变肽的GST融合表达等方式，通过SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析，最终确定了4RGDLGPLAARL14为单抗9A9识别表位的反应活性单元，即单抗9A9识别的中和表位。进一步以9A9表位4RGDLGPLAARL14为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端逐个进行氨基酸替换对9A9识别表位的关键氨基酸进行确定，表明在9A9所识别表位的氨基酸序列中，Gly147、Leu149为关键氨基酸，Arg143、Gly144、Asp145、Pro148、Arg152和Leu153为重要氨基酸，Leu146对表位活性无影响。为验证9A9表位的保守性，选取了GenBank收录的753条A型FMDV的VP1氨基酸序列(其中包含血清A型FMDV三种拓扑型的毒株)进行比对分析，结果显示，9A9表位氨基酸序列在A型FMDV毒株之间是高度保守的。序列比对中发现，该表位序列中突变最多的是Pro148与Leu153，其中Pro148可突变为Ser、Ala、Gln、Val和Thr，Leu153可突变为Val、Ala和Thr；而Gly147和Leu149作为本发明鉴定的9A9表位关键氨基酸，在所有的发表序列中均是保守的。
为了确定单抗9A9所针对的抗原表位能否作为诊断抗原来检测A型口蹄疫病毒抗体阳性血清，将9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL(其氨基酸序列为SEQ ID NO:2)进行定点诱变：Leu146突变为Phe(F)或Met(M)；Pro148突变为Ser、Ala、Gln、Val或Thr；Leu153突变为Val、Ala或Thr，这些突变肽以GST融合的方式表达，分别命名为L146F(其氨基酸序列为SEQ ID NO:3)、L146M(其氨基酸序列为SEQ ID NO:4)、P148S(其氨基酸序列为SEQ ID NO:5)、P148A(其氨基酸序列为SEQ ID NO:6)、P148Q(其氨基酸序列为SEQ IDNO:7)、P148V(其氨基酸序列为SEQ ID NO:8)、P148T(其氨基酸序列为SEQ ID NO:9)、L153V(其氨基酸序列为SEQ ID NO:10)、L153A(其氨基酸序列为SEQ ID NO:11)和L153T(其氨基酸序列为SEQ ID NO:12)。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，检测A型FMDV阳性和阴性血清，同时 设立O型和Asia1型FMDV阳性血清作为对照，以检测单抗9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其突变体与A型口蹄疫病毒抗体的反应能力，由此评价9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL在A型口蹄疫诊断中的价值。结果表明：单抗9A9识别的A型FMDV中和表位肽及其系列表位突变肽与A型FMDV的阳性血清呈现良好的反应能力，而与O型和Asia1型FMDV阳性血清以及A型FMDV阴性血清没有反应，表明该中和表位能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清。
本发明进一步公开了所述的中和表位在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的用途。
其中，所述的药物还包括药学上可接受的佐剂。
本发明还公开了一种用于诊断A型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，包括：用于包被酶标记抗原的检测板、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、酶标记的抗原、酶标记的羊抗鼠IgG、阳性对照血清和阴性对照血清。
其中，所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的抗原为SEQ ID NO:1所示的中和表位肽，优选为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的中和表位肽；
所述的检测板优选为96孔板；所述的稀释液为pH9.6的Na2CO3/NaHCO3缓冲液；所述的洗涤液为pH7.4的PBST；所述的显色液为OPD底物溶液；所述的终止液为2M H2SO4；所述的阳性对照血清为A型口蹄疫病毒阳性血清；所述的阴性对照血清为A型口蹄疫病毒阴性血清。
本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位，能应用于口蹄疫的诊断、预防或治疗中，可对口蹄疫的被动免疫起到良好的免疫效果，对于口蹄疫的免疫预防将具有重要的意义。
附图说明
图1IFA检测单抗9A9与A型、O型、Asia1型FMDV的反应；
图2经辛酸-饱和硫酸铵方法和离子交换层析法纯化的单抗9A9；
图3用A型口蹄疫病毒抗体检测方法检测A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似、FMDV阴性、O型FMDV强阳性和Asia1型FMDV强阳性血清的滴度变化曲线；
图4单抗9A9对灭活的A型FMDV全病毒与的Western blot分析；
图5GST融合蛋白的SDS-PAGE(a,c,e)和Western blot分析(b,d,f)；
图6截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)；
图7丙氨酸扫描突变合成肽的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b)；
图8 9A9表位肽氨基酸序列的保守性分析；
图9GST融合表达的系列表位突变肽与A型FMDV阳性、阴性、O型FMDV阳性和Asia1型FMDV阳性血清的免疫反应性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1.材料
1.1病毒、细胞、菌株和实验动物
用于免疫荧光进行单抗特异性分析的毒株包括：A FMDV A/KT/58(GenBankaccession number:AJ131665),Asia1FMDV Asia1/YS/CHA/05(GU931682),O/YS/CHA/05(HM008917),O FMDV O/Tibet/CHA/99(AJ539138),O/GD/86(AJ131468),O/Akesu/58(AF511039)(Wang H,Zhao L,Li W,Zhou G,Yu L(2011)Identification of aconformational epitope on the VP1G-H Loop of type Asia1foot-and-mouth diseasevirus defined by a protective monoclonal antibody.Veterinary microbiology148:189-199)。另，口蹄疫病毒株A/JLYS/CHA/2014属于A型FMDV东南亚97谱系(Sea-97)，其VP1序列的同源性与A/GDMM/CHA/2013(GenBank accession number:KF450794)(Zheng H,Lian K,Yang F,Jin Y,Zhu Z,Guo J,Cao W,Liu H,He J,Zhang K,Li D,Liu X(2015)Cross-protective efficacy of engineering serotype A foot-and-mouth diseasevirus vaccine against the two pandemic strains in swine.Vaccine 33:5772-5778.)高达99％，来源上属于同一次流行的毒株。上述毒株由本实验室保存。
乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；
质粒pGEX-6p-1和受体菌BL21由本实验室保存；
清洁级雌性BALB/c小鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1.2主要试剂
融合剂PEG/DMSO(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、HRP或FITC标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司；
L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco公司；
二甲基亚砜(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司；
限制性内切酶EcoRI、XhoI购自TaKaRa公司；
T4DNA连接酶购自New England Biolabs公司；
高糖DMEM干粉购自GIBCO公司；
进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；
96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司；
ELISA板购自于Corning公司；
DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
BL21感受态购自于天根公司；
pGEX-6p-1由本实验保存。
实验例1 A型口蹄疫病毒中和性单克隆抗体的制备
1、试验方法
1.1鼠免疫与单克隆抗体的制备
(1)将A型FMDV接种于长满的BHK-21细胞单层，待75％以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，初步裂解细胞，释放病毒。冻融后的病毒液以加入1∶1000TritonX-100和4∶10000甲醛裂解与灭活48h以上，取灭活过的病毒液1mL上BHK-21细胞盲传三代、检测灭活是否彻底。将经冻融裂解后的培养液9000rpm(Beckman高速离心机，JA-10转子)、4℃离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀。按病毒液上清的体积加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室温搅拌2h至完全溶解，4℃过夜沉淀。次日将上清9000rpm、4℃离心90min，弃上清，回收沉淀。用NET缓冲液于低温下将沉淀轻轻重悬，29000rpm、4℃离心2h，在冰盒中用适量的NET缓冲液轻轻重悬沉淀。 制备15％～45％均匀线性蔗糖梯度，对病毒浓缩液进行蔗糖密度梯度超速离心，利用用紫外分光光度计检测OD259值，根据公式计算146S的抗原含量。
(2)用纯化的A型FMDV抗原，100μg/200uL加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经背部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射二倍剂量的抗原。
(3)细胞融合
a)饲养层细胞的制备：细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75％酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻提起腹膜，将10mL注射器内吸取的8-10mL HAT完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mL HAT培养液中，吹散混匀细胞，分装于6块96孔培养板，100μL/孔。置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
b)骨髓瘤细胞的制备：融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，用15mL DMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50mL离心管中。1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mL DMEM基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。
c)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结缔组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mLDMEM基础培养液的平皿中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM基础培养液大约至30mL，混匀。1000rpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mL DMEM基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。
d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：取65mLHAT培养液，15mL基础DMEM培养液和1mL50％PEG于37℃水浴中预热，另备盛有37℃水的200mL烧杯。按5份脾细胞数加1 份骨髓瘤细胞数取相应细胞悬液量，加入50mL玻璃离心管中，补加DMEM基础培养液至30mL，混匀。1 000rpm离心10min，弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞松散均匀呈糊状。将离心管放入盛有37℃水的200mL烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用1mL巴氏吸管吸取37℃50％PEG溶液1mL，1min内加完，静置2min。随后先慢后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37℃水浴静置10min。1000rpm离心10min，弃上清，加入65mLHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔0.1mL接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37℃、5％的CO2培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积1/4-1/3时取上清进行检测并换HT培养液。
1.2抗体检测ELISA
用提纯的病毒抗原包被于96孔板中，加入100uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物OPD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。
1.3间接免疫荧光(IFA)
微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4×103TCID50/well，出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50uL杂交瘤细胞培养上清，37℃温育40min后PBS洗涤三次，加入1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃温育40min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。
1.4微量细胞中和试验
(1)病毒毒价的测定：将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75％以上，收获病毒悬液冻融3次，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5％CO2温箱37℃培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID50。
(2)中和试验：取单抗腹水在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等等，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释(与等量腹水混合，其毒价为100TCID50)。每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃ 温箱中和1h。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。置5％CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果。
2、试验结果
2.1针对A型FMDV线性中和表位单克隆抗体的筛选和鉴定
免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合的杂交瘤细胞，其培养上清FMDV特异性抗体用间接ELISA检测和IFA验证，阳性判定标准为：以杂交瘤细胞培养上清对FMDV抗原的OD492光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞培养上清对FMDV抗原OD492值之比均大于2.1，且杂交瘤细胞上清与正常BHK-21细胞不产生荧光反应，判为阳性。抗体阳性杂交瘤细胞经3次有限稀释法亚克隆，获得三株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞，分别命名为9A9、8G9和9H4。
免疫球蛋白亚类鉴定显示，单抗9A9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型。单抗8G9重链类型为IgG2a，轻链为κ类型。单抗9H4重链类型为IgG2b，轻链为κ类型。微量细胞中和试验表明，9A9具有很高的中和活性，腹水中和效价高达1:4096。8G9腹水中和效价达到1:89。9H4则无中和活性。
鉴于杂交瘤细胞9A9所分泌的单抗是A型FMDV高中和活性的单抗，选取单抗9A9进行下一步的研究。
将单抗9A9培养上清分别与感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21细胞进行间接免疫荧光检测；检测结果显示(图1)，9A9只与A型毒株呈阳性反应，而与多个O型和Asia1型FMDV分离株均无交叉反应，可认定9A9为A型FMDV血清型特异性单抗。
上述结果表明，单抗9A9是A型口蹄疫病毒特异性、高中和性的单抗。
本发明将该杂交瘤细胞系9A9提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC 12049；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2016年3月21日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
实验例2 A型口蹄疫病毒抗体检测方法的建立
1、试验方法
1.1单克隆抗体的纯化
采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：
(1)取3ml预处理过的腹水加6ml 0.06mol/L pH4.8醋酸缓冲液；腹水中加99ul辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调pH至7.4。
(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000转离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5ml 0.1M的pH7.4的PBS中；
(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％--40％，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静止2小时以上；11000转离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2ml 0.1M的pH7.4的PBS中；
(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用0.1M的pH7.4的PBS透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。
再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。
1.2辣根过氧化物酶标记单克隆抗体
经纯化合格后的单克隆抗体用过碘酸钠法进行标记。操作步骤如下：
①取5mg HRP溶于0.5ml pH5.6的0.06M HAc-NaAc缓冲液中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4溶液0.5ml，混匀，置4℃20-30min；
②取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；
③加入含10mg纯化抗体的溶液1ml，混匀，调pH值9左右，并装入透析袋，用0.05M/LpH9.5的碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析16-24h，使之结合；
④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；
⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃作用30min，3000rpm离心30分钟，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4PBS溶解，装入透析袋，以0.02Mol/L pH7.4PBS在4℃透析除盐过夜；
⑥次日取出离心，10000rpm离心30分钟以除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4PBS溶至1-2ml；
⑦用紫外分光光度计分别测定OD403和OD280，鉴定合格后将标记的IgG-辣根过氧化物酶加等量甘油，-20℃保存。
1.3 A型口蹄疫病毒抗体检测方法中各试剂的最佳使用浓度的滴定
确定A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度和HRP标记的检测单抗的使用浓度。试验所用的酶标板为96孔平底微孔板(Costar酶标板，高亲和性)，试验采用50ul反应体系。分别用pH9.6的Na2CO3/NaHCO3缓冲液稀释纯化的A型FMDV抗原包被ELISA板，4℃过夜，用pH7.4的PBST洗板5次，甩干。然后用PBST的2倍系列稀释的HRP标记检测单抗(1∶100，1∶150～1∶12800，1∶19200)加入ELISA板孔，37℃温育1小时，洗板后加入TMB底物溶液避光显色15～20min后，用2M H2SO4终止反应，450nm读取光密度值(OD值)，以酶结合物的OD值达到1.6～2.0时试剂的最高稀释倍数为其使用浓度。
各试剂的使用浓度经过方阵滴定初步确定，用于后续的A型口蹄疫病毒抗体检测方法。
1.4 A型口蹄疫病毒抗体检测方法试验步骤
A型口蹄疫病毒纯化抗原用pH 9.6Na2CO3缓冲液稀释至使用浓度包被ELISA板，50μl/孔，封板或置湿盒内，4℃过夜。取出ELISA板，弃去其中液体，用pH 7.4PBST洗板5次，甩干。用PBST对待检血清做起始为1：2的倍比连续稀释后50μl/孔加入ELISA板中。在ELISA板中立即加入用PBST稀释的HRP-9A9，50μl/孔，封板，充分摇振混匀，37℃孵育1h。同上洗板5次，加入底物溶液，50μl/孔，封板，室温避光孵育15min。加入终止液，50μl/孔，终止反应，在酶标仪上读取450nmOD值。
2、试验结果
2.1单克隆抗体腹水的纯化及标记
将本发明制备的单抗9A9腹水，经辛酸-饱和硫酸铵方法纯化，紫外分光光度计测定9A9浓度为7.64mg/ml。抗体9A9再经DEAE-sephadex a-50离子交换层析进一步纯化(图2)，用改良过碘酸钠法标记HRP。
2.2 A型口蹄疫病毒抗体检测方法的初步建立
首先用方阵滴定法初步确定A型口蹄疫病毒抗体检测系统中A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度和HRP-9A9检测单抗的使用浓度。结果表明：A型口蹄疫病毒纯化抗原的包被浓度为6.4μg/ml，稀释倍数为1:1000；HRP-9A9最适稀释倍数为1:1500。
为了验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测中的诊断价值，用初步建立的A型口蹄疫病毒抗体检测方法分别检测不同稀释倍数的A型FMDV强阳性、弱阳性、疑似(临界值)和阴性血清，同时设立O型和Asia1型FMDV强阳性血清作为对照，以 验证单抗9A9在A型口蹄疫病毒抗体检测方法中与抗原的结合能力、以及单抗9A9区分A型口蹄疫病毒阴阳性血清的能力。用上述检测结果绘制强阳性、弱阳性、疑似(临界值)、阴性血清的抗体滴度曲线；检测结果表明(图3)：单抗9A9在A型FMDV抗体检测方法中与A型FMDV的强阳性、弱阳性和疑似血清呈现良好的竞争能力，而与O型和Asia1型FMDV强阳性血清以及FMDV阴性血清没有竞争性，能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清，确定了单抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗体检测方法中的价值和应用潜力。
实验例3 A型口蹄疫病毒单克隆抗体中和表位的确定
1、试验方法
1.1衣壳蛋白的截短表达
根据FMDV A/JLYS/CHA/2014株衣壳蛋白序列，设计9对特异性引物，将蛋白分为9个截短片段进行表达。所有上下游引物均分别引入EcoRI、XhoI酶切切位点。具体引物序列见(由Invitrogen公司合成)表1。以病毒RNA反转录的cDNA为模板，利用表1中设计合成的9对引物，通过PCR扩增9个截短基因片段，基因片段的分布如表1所示。将酶切后的基因片段插入pGEX-6p-1的EcoRI和XhoI之间，转化BL21感受态细胞，用PstI酶切鉴定重组质粒，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，37℃继续培养5h，收集菌体并用适量的PBS重悬，融合蛋白分别命名为VP1、VP2、VP3、VP1-1、VP1-2、VP1-3、VP1-4、VP1-5与VP1-6。
表1用于衣壳蛋白及其截短片段表达的引物序列
1.2表位肽的GST融合表达
人工合成编码表位和截短表位DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入EcoRI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及XhoI粘性延伸末端，引物序列见表2，将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的EcoRI和XhoI之间，转化BL21感受态细胞，用PstI酶切鉴定重组质粒，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养5h，收集菌体并用适量的PBS重悬，融合蛋白分别命名为VP1-5-1至VP1-5-4、1-14至1-5、2-15至11-15、RGDLGPLAARL、R143A、G144A、D145A、L146A、G147A、P148A、L149A、R152A与L153A。
表2截短肽及截短突变体编码DNA的互补寡核苷酸链
1.3系列表位突变肽的GST融合表达
人工合成编码表位DNA的两条互补寡核苷酸链，上游引入EcoRI粘性延伸末端，下游引入终止密码子以及XhoI粘性延伸末端，引物序列见表3。将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DNA，插入pGEX-6p-1的EcoRI和XhoI之间，转化BL21感受态细胞，用PstI酶切鉴定重组质粒，挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:100稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养5h诱导蛋白的表达，收集菌体并用适量的PBS重悬，表达的GST融合蛋白分别命名为RGDLGPLAARL、L146F、L146M、P148S、P148A、P148Q、P148V、P148T、L153V、L153A和L153T。
表3表位肽编码DNA的互补寡核苷酸链
1.4 SDS-PAGE电泳和Western blot检测
SDS-PAGE电泳(15％Tris-glycine)分离各融合蛋白，转印至硝酸纤维素滤膜上(90V，45min)，用5％脱脂乳-PBS封闭液于4℃封闭过夜，与单抗9A9于37℃温育1h，与HRP标记的羊抗鼠IgG室温作用1h，DAB(6mg/10mL)显色。
1.5体外筛选单抗中和逃逸突变株
将病毒与单抗在37℃共同孵育1h，然后将孵育后的病毒以500TCID50的接毒量感染BHK-21细胞，接毒5h后，更换不含单抗的2％血清的DMEM培养，观察CPE情况。3天后，收获病毒，反复冻融3次后，增加单抗的浓度，再次接种新鲜的BHK-21细胞，经过几轮筛选，当病毒在最高浓度的单抗作用下仍能使细胞出现CPE，即获得了能够逃逸单抗的逃逸突变株。亲本毒在没有单抗的条件下做平行传代。
1.6抗体检测ELISA
用上述试验方法1.3GST融合表达的表位肽作为抗原包被96孔板，加入100uL 100倍稀释的A型FMDV阳性血清和阴性血清，37℃温育1h后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG抗体，洗涤后加入底物OPD避光显色10min，于波长492nm测定吸光值。
2、试验结果
2.1单抗9A9识别表位的初步定位
用单抗9A9对全病毒进行Western blot分析，出现明显的特异性反应条带(图4)，由此认为单抗9A9识别A型FMDV的一个线性表位。
对融合表达的VP1、VP2和VP3蛋白进行SDS-PAGE(图5-a)分离，并以1∶1000稀释的单抗9A9作为一抗、1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗进行Western blot分析(图5-b)，结果显示，9A9所识别的表位位于VP1蛋白上。为了进一步定位9A9识别的表位，将VP1分为6段截短进行融合表达(VP1-1至VP1-6)，SDS-PAGE(图5-c)和Western blot分析(图5-d)显示，9A9所识别的表位位于VP1-5短肽上。为进一步鉴定单抗9A9识别的表位，以上下游引物退火形成目的片段为目的设计4对引物(表2)进行短肽编码基因的GST融合表达。SDS-PAGE电泳(图5-e)与Western blot(图5-f)分析表明，单抗9A9与VP1-5-1短肽呈现反应，表明单抗9A9识别的表位位于A型FMDV的VP1蛋白的140QNRRGDLGPLAARLA154肽段。
2.2单抗9A9识别表位的精确定位
为进一步精确鉴定单抗9A9识别的表位，以上下游引物退火形成目的片段为目的设计20对引物(表2)，分别从VP1-5-1短肽的N端和C端以1个氨基酸残基逐步递减，直到C末端或N末端剩下5个氨基酸组成的短肽为止，通过GST融合表达、SDS-PAGE电泳(图6-a)和Western blot(图6-b)分析显示，单抗9A9与N端的1QNRRGDLGPLAARLA15至4RGDLGPLAARLA15以及C端的2NRRGDLGPLAARL14发生特异性结合，而与其它融合肽以及GST对照均不反应。上述结果表明，4RGDLGPLAARL14为单抗9A9识别表位的反应活性单元，即单抗9A9识别的表位肽。
2.3 9A9识别表位的关键氨基酸
为进一步了解单抗9A9识别表位的各个氨基酸残基在与单抗结合过程中所起的作用，以9A9表位4RGDLGPLAARL14为基础，用丙氨酸(A)从N端至C端逐个进行氨基酸替换(表4)，RGDLGPLAARL作为阳性对照、GST空载体作为阴性对照。
表4用于本发明的合成肽及其氨基酸序列
注：a口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/13株VP1的143～153aa肽
b突变位点氨基酸均加粗并用下划线标出，部分残基用丙氨酸(A)替换
经SDS-PAGE(图7-a)与Western blot分析(图7-b)表明，在9A9所识别表位的氨基酸序列中，Gly147、Leu149为关键氨基酸，Arg143、Gly144、Asp145、Pro148、Arg152和Leu153为重要氨基酸，Leu146对表位活性无影响。
经过4轮的单抗9A9加压筛选，在最高浓度单抗的作用下病毒感染细胞出现CPE，即确定为病毒能够逃逸中和单抗产生了中和表位突变株。将获得的可以完全逃逸单抗9A9的突变株经RNA提取、RT-PCR扩增和测序分析发现，突变株在VP1的446位碱基发生T到C的替换，从而导致149位氨基酸由亮氨酸(Leu)突变为脯氨酸(Pro)，这与9A9识别表位鉴定中发现的Leu149为关键氨基酸(图7-b)的结果相一致，再次证明Leu149是单抗9A9识别表位的关键氨基酸，是单抗9A9结合表位的关键位点。
2.4 9A9表位是A型FMDV各基因型毒株的保守性表位
为验证9A9表位的保守性，选取了GenBank收录的753条A型FMDV的VP1氨基酸序列—(其中包含血清A型FMDV三种拓扑型的毒株)进行比对分析见图8，结果显示，9A9表位氨基酸序列在A型FMDV毒株之间是高度保守的。序列比对中发现，该表位序列中突变最多的是Pro148与Leu153，其中Pro148可突变为Ser、Ala、Gln、Val或Thr，Leu153可突变为Val、Ala或Thr；而Gly147和Leu149作为本发明鉴定的9A9表位关键氨基酸，在所有的发表序列中均是保守的。在鉴别9A9识别表位关键氨基酸的试验中(图7-b)发现，Arg143、Gly144、Asp145、Pro148、Arg152和Leu153为9A9表位的重要氨基酸，其突变可使表位活性呈现一定程度的下降。这些结果表明，9A9表位是A型FMDV的一个线性保守性中和表位。
实验例4单抗9A9识别抗原表位及其突变体与A型口蹄疫病毒抗体阳性血清的特异性反应实验
上述研究已经鉴定了单抗9A9所识别的表位肽为143RGDLGPLAARL153。为了确定单抗9A9所针对的抗原表位能否作为诊断抗原来检测A型口蹄疫病毒抗体阳性血清，首先将9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL(其氨基酸序列为SEQ ID NO:2)进行定点诱变：Leu146突变为Phe(F)或Met(M)；Pro148突变为Ser、Ala、Gln、Val 或Thr；Leu153突变为Val、Ala或Thr，这些突变肽以GST融合的方式表达，分别命名为L146F(其氨基酸序列为SEQID NO:3)、L146M(其氨基酸序列为SEQ ID NO:4)、P148S(其氨基酸序列为SEQ ID NO:5)、P148A(其氨基酸序列为SEQ ID NO:6)、P148Q(其氨基酸序列为SEQ ID NO:7)、P148V(其氨基酸序列为SEQ ID NO:8)、P148T(其氨基酸序列为SEQ ID NO:9)、L153V(其氨基酸序列为SEQ ID NO:10)、L153A(其氨基酸序列为SEQ ID NO:11)和L153T(其氨基酸序列为SEQ IDNO:12)。然后，将这些GST融合的表位肽作为抗原分别包被ELISA板，检测A型FMDV阳性和阴性血清，同时设立O型和Asia1型FMDV阳性血清作为对照，以检测单抗9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其突变体与A型口蹄疫病毒抗体的反应能力，由此评价9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL在A型口蹄疫诊断中的价值。
实验结果表明(图9)：单抗9A9识别的A型FMDV中和表位肽及其系列表位突变肽(L146F、L146M、P148S、P148A、P148Q、P148V、P148T、L153V、L153A与L153T)与A型FMDV的阳性血清呈现良好的反应能力，而与O型和Asia1型FMDV阳性血清以及A型FMDV阴性血清没有反应，表明本发明所确定的中和表位肽及其系列表位突变肽能够特异性区分A型FMDV的阴阳性血清。这些检测结果与9A9识别表位鉴定过程中发现的Arg143、Gly144、Asp145、Pro148、Arg152和Leu153为重要氨基酸以及Leu146对表位活性无影响的结果相一致(图7-b)，进一步验证了单抗9A9识别的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其系列表位突变肽对于建立A型口蹄疫诊断方法的价值和应用潜力。

Claims (9)

1.A型口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)单克隆抗体识别的中和表位，其特征在于：所述中和表位的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，其中，X1为Leu、Phe或Met；X2为Pro、Ser、Ala、Gln、Val或Thr；X3为Leu、Val、Ala或Thr。
2.按照权利要求1所述的中和表位，其特征在于：所述的X2为Pro。
3.按照权利要求1所述的中和表位，其特征在于：所述的X3为Leu。
4.按照权利要求1所述的中和表位，其特征在于：所述中和表位的氨基酸序列为SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。
5.权利要求1-4任意一项所述的中和表位在制备诊断A型口蹄疫的试剂或药物中的用途。
6.权利要求1-4任意一项所述的中和表位在制备预防或治疗A型口蹄疫的试剂或药物中的用途。
7.按照权利要求6中所述的用途，其特征在于：所述的药物还包括药学上可接受的佐剂。
8.一种用于诊断A型口蹄疫病毒的ELISA试剂盒，包括：用于包被酶标记抗原的检测板、稀释液、洗涤液、显色液、终止液、酶标记的抗原、酶标记的羊抗鼠IgG、阳性对照血清和阴性对照血清，其特征在于：所述的抗原为权利要求1-4任意一项所述的中和表位。
9.按照权利要求8所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的酶为辣根过氧化物酶；所述的稀释液为pH9.6的Na2CO3/NaHCO3缓冲液；所述的洗涤液为pH7.4的PBST；所述的显色液为OPD底物溶液；所述的终止液为2M H2SO4；所述的阳性对照血清为A型口蹄疫病毒阳性血清；所述的阴性对照血清为A型口蹄疫病毒阴性血清。
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