CN105548550A - 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒 - Google Patents

检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105548550A
CN105548550A CN201610014683.5A CN201610014683A CN105548550A CN 105548550 A CN105548550 A CN 105548550A CN 201610014683 A CN201610014683 A CN 201610014683A CN 105548550 A CN105548550 A CN 105548550A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
enterovirus
immunofluorescence
monoclonal antibody
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610014683.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王新平
邢泽黎
朱利塞
郭昌明
刘丹
盖小春
张群
袁悦
刘亚静
王方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN201610014683.5A priority Critical patent/CN105548550A/zh
Publication of CN105548550A publication Critical patent/CN105548550A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，是应用本发明的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，试剂建立的直接免疫荧光检测方法，既可用于临床快速诊断E种肠道病毒感染，也可用于E种肠道病毒抗原在组织中的定位与鉴定。直接免疫荧光检测时间短，40分钟内即可报告结果；特异性强，仅与E种肠道病毒反应；重复性好，准确性高，与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上，可用于E种肠道病毒感染的快速诊断。

Description

检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，适于E种肠道病毒感染的诊断及组织或细胞中牛肠道病毒抗原的定位与鉴定。
背景技术
牛肠道病毒（Bovineenterovirus,BEV）包括E、F两个病毒种，属于小RNA病毒科肠道病毒属中的成员，它所引起的传染病给养牛业造成严重经济损失。该病毒感染以临床上发热、流泪、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难和严重腹泻为主要特征。本病于上世纪50年代后期由Moll等首次报道，之后许多国家也相继报道本病的发生。国内李英利等于2011年从内蒙某奶牛场的犊牛粪便样品中分离到一株F种肠道病毒。申请人从吉林省暴发的临床上以呼吸道和消化道症状为主要特征的疫病中，分离鉴定出一种新的肠道病毒：E种肠道病毒。E种肠道病毒感染在国内为新发传染病，严重危害养牛业的健康发展，其诊断与防治缺乏研究。
发明内容
本发明提供一种检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒。
检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，是用FITC标记的VP1单克隆抗体。所述的VP1单克隆抗体，是利用E种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂交瘤单抗制备技术获得；
所述的VP1蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。
所述的VP1蛋白为是由碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示的E种肠道病毒基因VP1表达的。
所述的E种肠道病毒基因VP1为人工合成。
E种肠道病毒直接免疫荧光检测试剂盒，免疫荧光试剂为上述检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂。
本发明提供了检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，是应用本发明的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，试剂建立的直接免疫荧光检测方法，既可用于临床快速诊断E种肠道病毒感染，也可用于E种肠道病毒抗原在组织中的定位与鉴定。直接免疫荧光检测时间短，40分钟内即可报告结果；特异性强，仅与E种肠道病毒反应；重复性好，准确性高，与间接免疫荧光方法的符合率为90%以上，可用于E种肠道病毒感染的快速诊断。
本发明的优点
1、应用本发明试剂建立的直接免疫荧光方法，可用于临床快速诊断E种肠道病毒感染，也可用于E种肠道病毒抗原在组织细胞中的定位与鉴定；
2、直接免疫荧光方法特异性强、灵敏度高、具有很好的重复性。40分钟内报告结果，可用于E种肠道病毒的快速诊断；
3、具有生物安全性,试剂盒所用的抗E种肠道病毒VP1的单克隆抗体为原核载体表达的重组蛋白诱导BALB/c小鼠产生，不含活的肠道病毒，因此不存在散毒危险；
4、敏感性高。制备单克隆抗体具有很高的免疫效价，从而确保异硫氰酸荧光素(FITC)标记后试剂的敏感性；
5、特异性强。制备的免疫荧光试剂与其他病原体无交叉反应，只检出E种肠道病毒，具有很高特异性；
6、稳定性好,荧光试剂4℃保存6个月，检测结果与常规方法无明显差异，具有很好的稳定性。
附图说明
图1pGEX-4T-1-VP1重组质粒酶切鉴定（泳道2、3：pGEX-4T-1-VP1；泳道1：pGEX-4T-1质粒阴性对照；泳道4：DNA分子marker）；
图2重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果（泳道3：pGEX-4T-1-VP1重组菌未诱导总蛋白；泳道2：pGEX-4T-1-VP1重组菌诱导后总蛋白；泳道1：蛋白分子marker）；
图3纯化重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果；
图4杂交瘤细胞染色体计数；
图5直接免疫荧光检测结果。
具体实施方式
实施例1E种肠道病毒结构蛋白VP1原核表达重组质粒的构建
1、引物设计
根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增VP1基因的引物，上下游分别含有BamHI、EcoRI酶切位点。引物序列如下：
E-VP1-FCGCGGATCCGAAACAAGCGTGGAGA（BamHI）
E-VP1-RCCGGAATTCGTACGAGGTGAGGCT（EcoRI）
2、基因扩增
常规Trizol法提取E种肠道病毒的基因组RNA，采用市售常规反转录试剂盒，按照说明操作获得cDNA，并以其为模板分别扩增了VP1基因，其碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示，表达的蛋白VP1其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；PCR反应体系：
PCR运行条件：94℃预变性2min；94℃变性1min、54℃退火30sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃再延伸5min。反应结束后，取1μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；
3、人工合成的VP1基因和上述的PCR目标基因与pGEX-4T-1的连接、转化
采用分子生物学领域中的常规酶切、连接等技术，构建重组质粒pGEX-4T-1-VP1，并采用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态中。利用含100μg/mL氨苄霉素的LB培养平板筛选阳性克隆，并进行常规增菌培养，收获菌体，提取质粒，进行BamHI/EcoRI双酶切鉴定，如图1所示。人工合成的VP1基因其碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示
实施例2VP1重组蛋白的表达及纯化
将鉴定的阳性重组质粒pGEX-4T-1-VP1转化BL21(DE3)感受态细胞后，挑取单个菌落接种到3mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中培养过夜，然后取1mL上述培养物接种到200mL含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中37℃振摇培养至对数生长期(OD600=0.6~0.8)，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，20℃诱导培养3h，经SDS-PAGE检测，获得了重组目标蛋白VP1，如图2所示。离心沉淀菌体，超声破碎后以尿素纯化包涵体方法获得高纯度的重组蛋白，如图3所示。
实施例3抗E种肠道病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备
1、动物免疫：选择6-8周龄健康BALB/c小鼠，以弗氏完全佐剂乳化纯化的VP1蛋白，每只小鼠腹腔注射100μg左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白腹腔注射100μg，最后一次加强免疫时直接腹腔注射100μg纯化的蛋白，融合前3～4d尾静脉注射50μg纯化的蛋白；
2、细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内,以300g离心10min,弃去上清,振荡细胞,使两种细胞尽量混合均匀,然后60s内缓慢滴加预热的PEG-4000溶液,再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合,静置后再以1000r/min离心10min,弃去上清后加入HAT培养基,使细胞混匀悬浮，于96孔培养板中培养,第14d开始换液，并检测杂交瘤细胞；
3、杂交瘤细胞克隆的筛选：采用间接ELISA方法，即用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，包被反应板，加入杂交瘤细胞的培养上清进行ELISA检测；对ELISA阳性的杂交瘤细胞进行克隆，直至所有孔都为阳性。通过3次细胞克隆，获得13株杂交瘤细胞，其中用人工合成VP1基因表达的VP1蛋白免疫，取免疫小鼠的脾细胞进行杂交，获得杂交瘤细胞6株；PCR方法获得的基因，获得杂交瘤细胞7株；最终选定了人合成基因，获得的杂交瘤细胞株4E7用于后期实验；
4、单克隆抗体制备：取高压灭菌的石蜡油0.5mL，注射到小鼠腹腔，7d后腹腔注入106个杂交瘤细胞，一周后抽取腹水，置37℃24h后4℃过夜，然后离心腹水，上清56℃灭活30min备用；
5、单克隆抗体纯化：用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4.5，缓慢滴加3.3%的正辛酸，搅拌30min，离心取上清，加入1/10体积的10倍PBS，调至pH7.4，4℃预冷后用45%饱和硫酸铵沉淀，离心后将沉淀以PBS溶解后移入透析袋，在50倍体积PBS中透析，透析期间每6小时换液1次，透析结束后，以紫外分光光度计测定蛋白浓度并分装冻存；
6、单克隆抗体特性鉴定
（1）腹水效价确定。以间接ELISA方法测定。细胞培养上清与腹水以10×进行倍比稀释，同时以SP2/0细胞培养上清和未接肿瘤细胞健康小鼠的腹水作为对照。检测确定出4E7单抗的腹水效价为6.4×105；
（2）抗VP1蛋白单克隆抗体IgG亚类鉴定。按小鼠mAbIgG亚类检测试剂盒说明书进行。具体方法是将纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100μL，37℃孵育1h，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100μL，37℃孵育1h，洗涤3遍后，加入羊抗小鼠IgG酶标二抗,37℃孵育1h，确定单克隆抗体的亚类为IgG2a；
（3）杂交瘤细胞株染色体的分析采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果显示4E7杂交瘤细胞的染色体数目为101条，鉴定结果见图4；
（4）抗VP1单克隆抗体特异性鉴定。将所获单克隆抗体分别与BPV、BVDV和FMDV进行间接ELISA,结果显示，制备的单克隆抗体与其它病毒病均无交叉反应性，鉴定结果见表1。
实施例4免疫荧光试剂的制备
1、抗体稀释：将VP1单克隆抗体以碳酸盐缓冲液（0.025MpH9.2CBS）稀释为蛋白浓度为10mg/mL，装入透析袋中备用；
2、荧光素溶液制备：称取异硫氰酸荧光素（FITC），用0.025MpH9.2CBS配制成0.1mg/mL，磁力搅拌避光溶解；
3、抗体标记：将抗体和荧光色素混合，加入到透析袋4℃避光标记24h；
4、荧光标记抗体的纯化：取出透析袋中的标记抗体，1000r/min离心3min，取上清液过SephandxG-50层析柱，用灭菌0.01MpH7.2PBS洗脱，除去游离的荧光素和盐；分管收集第一峰，适当浓缩，测定其工作浓度后分装，保存于-20℃备用，即为牛肠道病毒免疫荧光诊断试剂。
实施例5直接免疫荧光试验方法的建立
1、BEV感染细胞的制备：将E种肠道病毒（BEV）接种于已长成单层的96孔Raw264.7细胞培养板，同时设正常Raw264.7细胞为阴性对照；于37℃5%C02条件下培养至细胞病变达30%左右时，弃上清液，以无菌PBS或生理盐水洗涤1，每孔加入冷甲醇100μL，4℃固定30min，弃去固定液同前洗涤1次，-20℃冻存备用；
2、直接免疫荧光试验操作方法：取BEV感染细胞板，加入适量经1%BSA-PBS稀释的上述免疫荧光试剂工作液，置于湿盒内，37℃感作30min，用PBS或生理盐水洗涤3次后，每孔加30μL抗荧光衰减封片剂（50%甘油-PBS），置荧光倒置显微镜下观察，以出现亮绿色荧光病灶判定阳性结果，拍照保存。同时设未接种病毒的正常细胞孔作为阴性对照，结果见图5。
实施例6免疫荧光试剂特性鉴定
1、荧光试剂工作浓度的确定：取实施例5中制备的感染细胞板和阴性细胞板作为对照，每孔分别加入预先经1%BSA-PBS系列稀释的免疫荧光试剂，进行直接免疫荧光试验，以出现清晰、明亮、特异性荧光的稀释倍数为试剂的最大稀释倍数。结果显示，荧光试剂的最高稀释倍数为1:600。为保证试剂的敏感性和荧光强度，确定工作浓度为1:300；
2、荧光试剂的特异性检测：将荧光抗体适当稀释后，分别与BPV、BVDV和FMDV感染的细胞感作，同时设阴性对照，每孔加1:300稀释的荧光试剂30μL，进行直接免疫荧光试验试验。结果显示，在荧光显微镜下仅BEV感染细胞孔出现亮绿色荧光病灶，呈阳性反应，直接免疫荧光试验的荧光特性与IFA相同；而其它病毒感染细胞及正常Raw264.7细胞均无交叉反应。表明制备的免疫荧光试剂特异性好，可用于BEV感染细胞的鉴定，见表2；
3、免疫荧光试剂的重复性和稳定性检测：在96孔细胞培养板中进行，将抗VP1荧光试剂分装后分别置-20℃保存1、2、3、4、5和6个月后，对BEV感染细胞进行直接免疫荧光试验试验，测定试剂保存期和批内批间重复性。结果显示，在-20℃保存至6个月荧光效价不变，因此暂定其保存期为6个月；同时，批内和批间重复性都较好，质量稳定。
<110>吉林大学
<120>检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
<160>2
<210>1
<211>645
<212>DNA
<213>人工
<400>1
gaaacaagcgtggagagcttcttcggtaggtcagcactggttggcatgcccatccttgag60
aacggatcacgcgtcaccatgtggcgcattgacttcagggagtttgtccagctccgtgct120
aaaatgtcctggtttacttacatgagatttgacgtggagttcacaatcgtagcgaccaca180
gccaacacctccggttccgtcgaccagaacaatagattccaggtcatgtacgtccctccc240
ggggcaccacaaccggcagatcaagactcataccagtggcaatcgggctgcaacccctca300
gtgatagctgataccgaagggcccccggtgcaattctcagtgcctttcatgagcaccgct360
aacgcgtattccaccgtatacgatgggtacgcccggttcatgaacactgacccagacaag420
tatggtatattgcccagtaactttctcgggcttatgtactttaggtgccttgaggacacg480
catacccaaatgaggttccgtatctatgcaaagattaaacatacacagtgttggattccc540
cgagccccgagacaagcgccatataagaagagataccatcttgtgtttggtggcccaaac600
ttccaagacaagatctgcgctgacagggctagcctcacctcgtac645
<210>2
<211>215
<212>PRT
<213>人工
<400>2
GluThrSerValGluSerPhePheGlyArgSerAlaLeuValGlyMet
51015
ProIleLeuGluAsnGlySerArgValThrMetTrpArgIleAspPhe
202530
ArgGluPheValGlnLeuArgAlaLysMetSerTrpPheThrTyrMet
354045
ArgPheAspValGluPheThrIleValAlaThrThrAlaAsnThrSer
505560
GlySerValAspGlnAsnAsnArgPheGlnValMetTyrValProPro
65707580
GlyAlaProGlnProAlaAspGlnAspSerTyrGlnTrpGlnSerGly
859095
CysAsnProSerValIleAlaAspThrGluGlyProProValGlnPhe
100105110
SerValProPheMetSerThrAlaAsnAlaTyrSerThrValTyrAsp
115120125
GlyTyrAlaArgPheMetAsnThrAspProAspLysTyrGlyIleLeu
130135140
ProSerAsnPheLeuGlyLeuMetTyrPheArgCysLeuGluAspThr
145150155160
HisThrGlnMetArgPheArgIleTyrAlaLysIleLysHisThrGln
165170175
CysTrpIleProArgAlaProArgGlnAlaProTyrLysLysArgTyr
180185190
HisLeuValPheGlyGlyProAsnPheGlnAspLysIleCysAlaAsp
195200205
ArgAlaSerLeuThrSerTyr
210215

Claims (5)

1.检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于，是用FITC标记的VP1单克隆抗体，所述的VP1单克隆抗体，是利用E种肠道病毒的VP1蛋白，采用杂交瘤单抗制备技术获得。
2.根据权利要求1所述的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的VP1蛋白其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。
3.根据权利要求2所述的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的VP1蛋白是由碱基序列如序列表SEQIDNO.1所示的E种肠道病毒基因VP1表达的。
4.根据权利要求3所述的检测E种肠道病毒的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的E种肠道病毒基因VP1为人工合成。
5.E种肠道病毒直接免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的免疫荧光试剂为权利要求1所述的免疫荧光试剂。
CN201610014683.5A 2016-01-11 2016-01-11 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒 Pending CN105548550A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610014683.5A CN105548550A (zh) 2016-01-11 2016-01-11 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610014683.5A CN105548550A (zh) 2016-01-11 2016-01-11 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105548550A true CN105548550A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55827881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610014683.5A Pending CN105548550A (zh) 2016-01-11 2016-01-11 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105548550A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105974119A (zh) * 2016-06-21 2016-09-28 吉林大学 G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒
CN105968196A (zh) * 2016-06-21 2016-09-28 吉林大学 G种肠道病毒检测抗体双夹心elisa检测试剂盒
CN110763838A (zh) * 2019-09-23 2020-02-07 华威特（江苏）生物制药有限公司 一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
CN112961836A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 新疆农业大学 一株e种bev新强毒株及其分离方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101187665A (zh) * 2007-12-27 2008-05-28 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种肠道病毒的免疫荧光层析检测试纸及其制备方法
CN102229915A (zh) * 2011-06-22 2011-11-02 浙江大学 Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101187665A (zh) * 2007-12-27 2008-05-28 北京博晖创新光电技术股份有限公司 一种肠道病毒的免疫荧光层析检测试纸及其制备方法
CN102229915A (zh) * 2011-06-22 2011-11-02 浙江大学 Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LISAI ZHU等: "《Identification of a novel Enterovirus E isolates HY12 from cattle with severe respiratory and enteric diseases》", 《PLOS ONE》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105974119A (zh) * 2016-06-21 2016-09-28 吉林大学 G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒
CN105968196A (zh) * 2016-06-21 2016-09-28 吉林大学 G种肠道病毒检测抗体双夹心elisa检测试剂盒
CN105974119B (zh) * 2016-06-21 2018-03-09 吉林大学 G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒
CN105968196B (zh) * 2016-06-21 2020-07-10 吉林大学 G种肠道病毒检测抗体双夹心elisa检测试剂盒
CN110763838A (zh) * 2019-09-23 2020-02-07 华威特（江苏）生物制药有限公司 一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
CN112961836A (zh) * 2021-02-25 2021-06-15 新疆农业大学 一株e种bev新强毒株及其分离方法与应用
CN112961836B (zh) * 2021-02-25 2023-07-04 新疆农业大学 一株e种bev新强毒株及其分离方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104497137B (zh) 非洲猪瘟病毒毒株通用单克隆抗体及制备方法和应用
CN101831407B (zh) 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体
CN101825633B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒的竞争elisa试剂盒
CN105548550A (zh) 检测e种肠道病毒的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
CN101900731A (zh) 一种区别检测猪瘟疫苗免疫与野毒感染抗体的elisa试剂盒及其制备方法
CN101818129A (zh) 一种抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体
CN103436496A (zh) 抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
CN103992988A (zh) 一种杂交瘤细胞株及其产生的抗犬瘟热病病毒n蛋白的单克隆抗体
CN112921005A (zh) 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用
CN101016541A (zh) 一种生产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法
CN105859842A (zh) A型口蹄疫病毒单克隆抗体识别的中和表位及其应用
CN105974119B (zh) G种肠道病毒直接免疫荧光试剂及其试剂盒
CN112194710A (zh) 罗非鱼湖病毒s8基因编码的重组蛋白、由其制备的抗体及应用
CN105348372A (zh) 一种猪伪狂犬病毒的检测方法
CN113740536A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN101748136A (zh) 建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法
CN101781656A (zh) 齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法
CN108872580B (zh) 一种检测新型鹅细小病毒的胶体金试纸条及其制备方法
CN102604993A (zh) 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法
CN113512098B (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用
CN104678097A (zh) 一种用于肺结核诊断的结核分枝杆菌组合抗原
CN113355291A (zh) 抗丝状支原体丝状亚种p0071蛋白的单克隆抗体及其应用
CN105542001A (zh) 检测e种肠道病毒病原的双抗体夹心elisa试剂盒
CN106397546A (zh) 一种o型口蹄疫病毒人工重组抗原及其制备与应用
CN105968196A (zh) G种肠道病毒检测抗体双夹心elisa检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504