CN112961836A - 一株e种bev新强毒株及其分离方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体提供一株新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311保藏号为CCTCC NO:V202098，毒株接种至MDBK细胞培养24h后可见明显的细胞变圆、碎裂、脱落等严重的致细胞病变效应；测定该毒株的滴度为1×10¹⁶ _. ¹TCID₅₀/0.1mL；理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗力，56℃处理或紫外线照射1h可使病毒失去活性；电镜观察该病毒为直径约25～30nm的球形颗粒；测序发现分离株基因组全长7412nt；遗传进化分析显示该分离株属于BEV‑E3型；感染BALB/c小鼠后，剖检表现为器官肿大出血等症状；镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化。对于牛肠道病毒相关疾病的防治，疫苗制备以及模型动物构建等领域具有良好应用前景。

Description

一株E种BEV新强毒株及其分离方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株E种BEV强毒株，具体涉及一株E种BEV强毒株及其分离方法与应用的技术领域。

背景技术

牛肠道病毒感染是由小RNA病毒科肠道病毒属的牛肠道病毒(Bovineenterovirus，BEV)引起的一种临床上以发热、咳嗽、呼吸困难、腹泻和繁殖障碍为主要特征的传染病。根据最新病毒分类，牛肠道病毒与人脊髓灰质炎病毒、人柯萨奇病毒和猪肠道病毒等同属小RNA病毒科肠道病毒属。牛肠道病毒感染符合肠道病毒属病毒感染的普遍规律，即:是一种综合征，可由不同肠道病毒所引起，同一种(型)肠道病毒可以导致不同综合征；牛感染肠道病毒后多数为亚临床表现，有超过90％的感染牛无症状，不易被发现；普遍分布于世界各地，感染广泛存在，并且常引起暴发；在环境中非常稳定，能在环境中存活很长时间。牛肠道病毒的病原性并不明显，但有时会侵犯其他器官而导致临床上出现各种综合征。牛肠道病毒的感染宿主较广，包括牛、羊、马、犬、羊驼等动物。BEV感染在牛群中非常普遍，且常与其他病原体发生混合感染和继发感染，导致牛群出现较高的死亡率，给养牛业造成巨大的经济损失。该病在国内为新发传染病，常与其他病原混合感染，在其发病机理、抗病毒药物与防治等方面缺乏研究。因此，筛选出相关致病毒株，采取有效措施预防和控制BEV感染对养牛业的健康发展至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCC NO:V202098，具有典型新毒株的特点，细胞毒性较强，该毒株的滴度为1×10^16.1TCID₅₀/0.1mL，理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗力，56℃处理或紫外线照射1h可使病毒失去活性，感染BALB/c小鼠后，剖检表现为器官肿大出血等症状；镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化，对于牛肠道病毒的防治，疫苗制备以及模型动物构建等领域具有良好的应用前景。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的目的是提供一株分离自博乐地区某养牛场出现腹泻症状的病牛新鲜粪便样品的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCC NO:V202098及其应用，该病毒具有典型新毒株的特点，理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗力，56℃处理或紫外线照射1h可使病毒失去活性，感染BALB/c小鼠后，剖检表现为器官肿大出血等症状；镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化，对于牛肠道病毒的防治，疫苗制备以及模型动物构建等领域具有良好应用前景。

本发明首先提供一株新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311，2021年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V202098。其全基因组序列如序列如SEQID NO:1所示。以编号为BL311的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311BL311 CCTCCNO:V202098株的基因组总DNA为模板扩增其全基因组序列，进行DNA测序，获取长度为7412nt的全基因组序列(附后见序列表)，将以编号为BL311的新疆分离株新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株CCTCC NO:V202098菌株的全基因组序列与GenBank数据库收录的代表菌株序列进行同源性比对分析，利用DNAMAN软件与GenBank数据库收录的全基因序列HY12(登录号：KF748290)、BJ101(登录号：MG650158)以及SL305(登录号：AF123433)进行序列比对，并绘制BL311分离株的全基因组结构示意图，5’UTR长815nt，3’UTR长70nt，中间的ORF为6528nt，编码2175个氨基酸和一个终止密码子。根据全基因序列与GenBank数据库收录的BEV全基因序列进行Blast分析，建立遗传进化树，该序列与E种肠道病毒与中国吉林省HY12株在同一分支上，同源性为99％，确定BL311分离株为BEV-E3型。

进一步的，本发明还提供了新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311BL311CCTCC NO:V202098的分离方法，所述毒株BL311CCTCC NO:V202098采用以下步骤分离获得：

(1)取一部分牛粪便加入3倍体积的灭菌PBS(pH 7.2～7.4)，旋涡振荡混匀，4℃10000rpm离心10min，取上清液至新的离心管后加入双抗，4℃静置4h；

(2)将步骤(1)中制备获得上清液用0.22μm滤膜过滤2次，-80℃保存备用；

(3)待MDBK细胞汇合度为70～80％时，吸弃培养液，将步骤(2)中制备获得的病毒处理液以1:10的比例稀释到无血清的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中孵育2h；

(4)将步骤(3)中培养的细胞吸弃病毒液，加入2～5％含HS的DMEM培养液，继续置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

(5)每隔6h观察步骤(4)中细胞病变情况，待细胞病变或脱落达到50％时，用无菌封口膜将培养皿封口，反复冻融三次，将细胞悬液转移至1.5mL离心管，2000rpm离心5min，收集上清液，冻存于-80℃；

(6)将步骤(5)中制备获得的上清液吸出1mL稀释到4mL DMEM培养液中，继续接种到70～80％细胞中，孵育2h，弃掉病毒液，加入维持液，观察细胞病变，以此方法盲传至15代，即获得稳定的毒株BL311。

进一步的，本发明还提供了新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311 CCTCC NO:V202098在制备用于预防和/或治疗牛肠道病毒感染的相关药物中的应用。

进一步的，本发明还提供了新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311 CCTCC NO:V202098用于模型动物构建中的应用。

所述的模型动物为BALB/c小鼠。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

本发明提供的一株新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311保藏号为CCTCC NO:V202098，毒株接种至MDBK细胞培养24h后可见明显的细胞变圆、碎裂、脱落等致细胞病变效应；测定该毒株的滴度为1×10^16.1TCID₅₀/0.1mL；理化性质检测发现该病毒对乙醚、氯仿等有机溶剂有抵抗力，56℃处理或紫外线照射1h可使病毒失去活性；电镜观察该病毒为直径约25～30nm的球形颗粒；测序发现分离株基因组全长7412nt，开放阅读框为6528nt，编码2175个氨基酸；遗传进化分析显示该分离株与中国吉林省HY12分离株(登录号：KF748290)有较近的亲缘关系，同源性为99％，属于BEV-E3型；感染BALB/c小鼠后，剖检表现为器官肿大出血等症状；镜检可见炎性细胞浸润、出血等变化。本发明提供的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311保藏号为CCTCC NO:V202098对于牛肠道病毒相关疾病的防治，疫苗制备以及模型动物构建等领域具有良好应用前景。

附图说明

图1所示为正常细胞及感染病毒后细胞形态图(20×)。

图2所示为病毒蚀斑图。

图3所示为不同时间的病毒滴度图。

图4所示为不同条件处理后病毒滴度测定图。

图5所示为BEV-BL311分离株形态的电镜观察图(120000×)。

图6所示为BEV-BL311全基因组结构示意图。

图7所示为BEV-BL311分离株与其他BEV分离株全基因组系统进化树分析图。

图8所示为组织解剖检测结果图。

图9所示为病理切片检测结果图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中MDBK细胞为新疆农业大学动物医学学院动物病毒学实验室保存；样品来自新疆博乐地区某养牛场出现腹泻症状的病牛新鲜粪便样品，-80℃冰箱保存。

本发明中采用的试剂有：TRIzol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒(CW2569M)购自北京康为世纪生物科技有限公司；马血清HS、Trypsin及高糖DMEM、青-链霉素均购自BI试剂公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)、Taq PCR MasterMix(KT201)购自天根生化科技(北京)有限公司；DL 2000DNAMarker(3427Q)购自宝日医生物技术；低熔点琼脂糖、0.33％中性红染液购自Sigma公司；0.2％磷钨酸购自Hitachi公司；超滤离心管(100KDa)、0.22μm、0.45μm滤器购自Merck Millipore公司。所述试剂、材料均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和仪器均为本领域常见的设备。

本发明中所采用的仪器为：PCR仪(C1000)、电泳凝胶成像仪(Gel Doc XR⁺)购自Bio-Rad公司；制冰机购自日本三洋公司；低温高速离心机、移液器等购自德国Eppendorf公司；细胞培养箱购自Glaxy公司；YJ-875医用净化工作台购自苏州净化设备公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；透射电子显微镜(HT7700)购自Hitachi公司。

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例一：病毒株的分离鉴定

1、样品处理

取一部分牛粪便加入3倍体积的灭菌PBS(pH 7.2～7.4)，旋涡振荡混匀。4℃10000rpm离心10min，取上清液至新的离心管后加入双抗，4℃静置4h后，用0.22μm滤膜过滤2次，-80℃保存备用。

2、病毒的分离培养

待MDBK细胞汇合度为70～80％时，吸弃培养液；将病毒处理液以1:10的比例稀释到无血清的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中孵育2h；吸弃病毒液，加入2～5％含HS的DMEM培养液，继续置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；每隔6h观察细胞病变情况，待细胞病变或脱落达到50％时，用无菌封口膜将培养皿封口，反复冻融三次，将细胞悬液转移至1.5mL离心管，2000rpm离心5min，收集上清液；冻存于-80℃；吸出1mL稀释到4mLDMEM培养液中，继续接种到70～80％细胞中，孵育2h，弃掉病毒液，加入维持液，观察细胞病变，以此方法盲传至15代。

将盲传15代的分离病毒株接种于MDBK细胞进行增殖培养并观察细胞形态是否改变，设立阴性对照组；分别于病毒接种后12、24、36h时观察细胞形态变化。结果发现，病毒接种24h时，MDBK细胞出现病变，表现为变圆、碎裂和脱落等现象，如附图1所示。

实施例二：蚀斑纯化试验

基于上述实施例一，待MDBK细胞汇合度为85～95％时，吸弃培养液，用PBS冲洗2次；将盲传至15代的病毒用DMEM做10^-1～10^-16梯度稀释后，接种于6孔板中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱孵育2h，使病毒充分吸附，吸弃病毒液。将DMEM培养液与2％低熔点琼脂糖以相同比例混合后加入到细胞培养板中，轻轻摇晃使其平铺在细胞表面，厚度约为1.5～2mm。4℃冰箱放置10～15min，凝固后倒置于培养箱中。观察细胞病变，待10^-12～10^-14稀释度的孔中有50％细胞病变，加入终浓度为0.1g/L的中性红染色液与无菌低熔点琼脂糖、DMEM培养液的混合液，4℃冰箱待其凝固，于37℃培养箱中放置1～2h，肉眼可观察明显的乳白色或透明的病毒蚀斑。选择密度小且较为清晰的蚀斑，做好标记，挑取蚀斑，置于装有DMEM培养液的1.5mL离心管中，反复冻融3次后，置-80℃冰箱保存。将上述蚀斑病毒液取500μL，RT-PCR鉴定后，选取阳性病毒液，进行下一轮的蚀斑纯化，如此反复操作5代后得到纯化的病毒。

以2％低熔点琼脂糖作为覆盖物，使用蚀斑纯化方法对分离的病毒进行纯化，经过终浓度为0.1g/L中性红染色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞不着色，形成不染色区域，在低熔点琼脂糖上可见透明或乳白色的病毒蚀斑，测定结果如附图2所示。

实施例三：病毒滴度测定

将纯化后的病毒接种至MDBK细胞培养板中，病毒感染后分别于12、24、36h收取细胞和病毒液，反复冻融3次后测定病毒滴度；将上述病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-18梯度稀释；分别接种至MDBK汇合度达到80％的96孔板上，以DMEM做阴性对照；孵育2h后加入含2％HS的培养液。记录第3～5日病变孔数并按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

将盲传15代的分离病毒株接种于MDBK细胞进行增殖培养，使用Reed-Muench方法测定BL311分离株的病毒滴度。如图3-3所示，病毒感染24h后，BL311分离株的病毒滴度由10^7.5TCID₅₀/0.1mL增长为10^14.7TCID₅₀/0.1mL，表明BEV感染MDBK细胞24h后复制显著增加，且此分离株毒力较强(**P<0.01)，测定结果如附图3所示。

实施例四：理化性质鉴定

基于上述实施例一，对毒株的理化性质进行测定，测定分离毒株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸性条件、碱性条件、温度、紫外线的敏感程度，分别使用25％乙醚、25％氯仿、0.25％胰蛋白酶、pH 3.0酸性条件、pH 10.0碱性条件、温度、紫外线对分离毒株进行处理，依照上述条件测定病毒滴度。

其中，乙醚敏感性试验测定方法为：将纯化病毒液反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清病毒液2mL至两个离心管中，分别加入500μL乙醚溶液和DMEM培养液，充分混匀后，置于细胞培养箱中培养2h，8000rpm离心20min，吸弃上层乙醚，置于4℃冰箱过夜；将病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-10梯度稀释，接种至96孔细胞培养板，培养箱孵育2h后加入200μL含2％HS的DMEM培养液；第3～5d计算TCID₅₀。

其中，氯仿敏感性试验测定方法为：将纯化病毒液反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清病毒液2mL至两个离心管中，分别加入500μL氯仿溶液和DMEM培养液(对照组)，充分混匀后，置于细胞培养箱中培养2h，8000rpm离心20min，吸弃氯仿，置于4℃冰箱过夜；将病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-10梯度稀释，接种至96孔细胞培养板，培养箱孵育2h后加入200μL含2％HS的DMEM培养液；第3～5d计算TCID₅₀。

其中，耐酸碱敏感性试验测定方法为：将纯化病毒液反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清病毒液2mL至3个离心管中，其中一管用1％HCl溶液将pH调至3.0，一管用10％NaOH溶液将pH值调至10.0，一管加入DMEM培养液(对照组)；置于细胞培养箱中作用2h，然后再用1％HCl溶液和10％NaOH溶液将pH调至7.2～7.4左右；将病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-10梯度稀释，接种至96孔细胞培养板，培养箱孵育2h后加入200μL含2％HS的DMEM培养液；第3～5d计算TCID₅₀。

其中，温度敏感性试验测定方法为：将纯化病毒液反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清病毒液2mL至两个离心管中，置于56℃水浴锅孵育1h，另一管37℃孵育(对照组)；将病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-8梯度稀释，接种至96孔细胞培养板，培养箱孵育2h后加入200μL含2％HS的DMEM培养液；第3～5d计算TCID₅₀。

其中，紫外线敏感性试验测定方法为：将纯化病毒液反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清病毒液2mL至两个离心管中，置于紫外线环境1h，另一管37℃孵育(对照组)；将病毒液进行10^-1、10^-2、10^-3、…、10^-8梯度稀释，接种至96孔细胞培养板，培养箱孵育2h后加入200μL含2％HS的DMEM培养液；第3～5d计算TCID₅₀。

通过乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸/碱性条件、高温条件、紫外线等条件处理病毒测定分离毒株的理化性质。结果如表1所显示，乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸、碱、高温、紫外线处理后病毒滴度由10¹⁶TCID₅₀/0.1mL降至2×10^6.5TCID₅₀/0.1mL以下，差异显著(**P<0.01)，表明分离毒株对乙醚、氯仿等有机溶剂有轻微抵抗作用，对胰蛋白酶较耐受，56℃处理1h病毒、紫外线照射1h可使其失活，参见附图4。

表1：病毒理化特性结果

注：同列数据后标不同大写字母者表示差异极显著(P＜0.01)。

实施例五：透射电镜试验测定毒株形态

基于上述实施例一中分离获得毒株，通过电镜确定分离株的形态与大小，将浓缩病毒液吸附于铜网后经2％磷钨酸负染，置于透射电镜下观察，可见直径约25～30nm的圆球形病毒颗粒(黑色箭头所指)，如附图5所示。

实施例六：病毒核苷酸分析

基于上述实施例一中分离获得毒株，对样品总RNA进行提取，反转录获得cDNA送至深圳市惠通生物科技有限公司完成核酸片段化、文库构建、桥式PCR及Illumina测序。其中片段化采用的仪器为Covaris M220，文库构建使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit，桥式PCR使用TruSeq PE ClusterKit，Illumina测序使用Truseq SBS Kit。

采用Illumina测序技术完成毒株的基因组扫描测序，构建了IlluminaPE文库，对获得的测序数据进行质控后利用生物信息学分析手段完成毒株的全基因组扫描，得到BEV的全基因组序列，全长7412nt。利用DNAMAN软件与GenBank数据库收录的全基因序列HY12(登录号：KF748290)、BJ101(登录号：MG650158)以及SL305(登录号：AF123433)进行序列比对，并绘制BL311分离株的全基因组结构示意图，如图附图6所示，5’UTR长815nt，3’UTR长70nt，中间的ORF为6528nt，编码2175个氨基酸和一个终止密码子。

根据全基因序列与GenBank数据库收录的BEV全基因序列进行Blast分析，建立遗传进化树，该序列与E种肠道病毒与中国吉林省HY12株在同一分支上，同源性为99％，确定BL311分离株为BEV-E3型，如附图7所示。

实施例七：小鼠致病性试验

基于上述实施一中筛选获得的毒株，选取4～5月龄健康BALB/c小鼠8只，随机分成对照组和试验组两个组别；实验组使用胰岛素注射器通过尾静脉注射10¹⁶TCID₅₀/只的病毒液，对照组通过尾静脉注射等体积的DMEM；每隔2天注射一次，共注射5次。接种后的小鼠在相同饲养条件、不同的饲养笼中饲养。

将病毒尾静脉注射BALB/c小鼠5次后，取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及十二指肠，观察其病理变化发现：脾脏和心脏不同程度肿大，有散在的出血点，质地变脆，边缘钝圆，无光泽；心脏心肌肥大，血管不明显，心包和心外膜有纤维性肥厚和浑浊，心肌纤维变性、坏死；肾脏边缘变脆、趋向于透明；小肠有轻微肿胀，如附图8所示。

取部分病变组织制作石蜡切片，H&E染色后观察其病理变化可看到：肝脏、脾脏、肺脏、心脏和十二指肠病变较明显，脾脏红髓部分出血较严重；肺脏肺泡轻微扩张，肺泡壁增厚且有明显的出血；小肠绒毛萎缩变短，但有代偿性增宽；心脏心肌纤维肥厚、间质增宽，说明心肌肿大；肝脏血管扩张显著，且血管内有大量淤血，周围可见淋巴细胞浸润，少量肝细胞坏死；肾皮质、肾小管周围有少量出血。如附图9所示。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 一株E种BEV新强毒株及其分离方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7412

<212> DNA

<213> 牛肠道病毒BEV新疆分离株 BL311(Bovine enterovirus)

<400> 1

gaaaaacagc ctgggggttg tacccacccc tggggcccac gcggcgccag tactctggtt 60

cgcttagaac ctttgtacgc ctgtttttcc ctcccttaaa taaattaaga tctctaccga 120

tgtggggagt aatccgactc cgcaccgata cgtcgcacca gcagaccggt tcgcttagga 180

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cagagatctt cattcctggc cgtgttaaca acctcctgga gattgcgcaa gttgaatcca 1920

ttgtcgaagc caacaacagg accggtgtga caggagttga gcgttacgtg atcccagtta 1980

gtgtacagga tgcgcttgat gcgcaaattt acgccctgaa gttagagctt ggcggcagtg 2040

gaccactttc ctccaccctc cttgggacct tggcgaagca ttacacccag tggagtggct 2100

cagtggagat cacgtgtatg ttcacaggca cgtttatgac cactggtaaa gtacttctag 2160

cttacactcc accgggaggt gacatgccta ggaatagaga ggaggcgatg ctgggaacac 2220

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cgtcccactt caggggcgtt agcagtgatg acacgttgaa ttaccaatac tatgcagcgg 2340

gtcacgttac catatggtat cagacaaaca tggtgattcc gccaggcttc ccgaacacgg 2400

cgggcattat catgatggtg gcagcccaac cgaatttctc cttccgtatt cagaaggaca 2460

gggaggacat gacacaaaca gcagtcctgc agaatgatcc aggcaagttg ctcaaggatg 2520

ccattgacaa acaggtggcc ggcgctctcg tcgctggcac taccacctcc acccacacag 2580

tagccacaga tagcacgccc gcactccagg cagccgagac gggggcgacg tcaactgcta 2640

gagacgagag catgatagaa acacgcacgg ttgtaccaac acatgggata cacgaaacca 2700

gcgtagagag cttctttggt cgctcctccc tagttggtat gccccttcta gcaactggct 2760

ctagtgtgac ctattggcgc atcgacttca gggagttcgt ccagttgagg gctaaaatgt 2820

catggttcac ctacatgcgc tttgacgtag agttcacaat cattgctaca agctcgacgg 2880

ggcaaaacgt caccactgaa cagcacacca cttaccaagt aatgtatgtg ccccctggtg 2940

cacccgtacc cagcaaccaa gactcctttc agtggcagtc ggggtgcaat ccatcagtgt 3000

tcgcagacac cgacggtccg ccagcccaat tctctgtacc attcatgagc tcggcaaacg 3060

cctattcaac agtctatgac ggctatgcgc ggttcatgga tactgaacca gacaggtatg 3120

gcattctccc aagtaacttt ctaggtttta tgtacttcag gacccttgaa gatgcagccc 3180

atcaggtgag gttccgcatt tacgcgaaaa tcaagcacac cagctgctgg attccacgcg 3240

cacccaggca ggctccatac aaaaagaggt acaatctagt gtttagtgga gatacagaca 3300

ggatatgtgc agaccgagcc agcctcacat catacgggcc ttttggccaa caacaagggg 3360

ccgcgtacgt tggatcctac aaaattgtca acaggcatct cgcaacctac acagactggg 3420

agaacgaggt ttggcaatca taccataggg acttacttgt cactagagtt gacgcacatg 3480

gctccgacac cattgccagg tgcaattgta ggtctggtgt gtactactgc aagtctagga 3540

ataaacacta cccaattgtg gtcactcccc cttctatttt caagattgaa gccaatgact 3600

actacccaga aagaatgcag acccatatcc tactaggaat tggatttgct gaacctggcg 3660

actgtggcgg cctgctccgc tgtgaacatg gtgtcatggg tattctcaca gttggaggtg 3720

gtgatcttgt tgggttcgct gacattcgcg acctactttg gattgaggat gacgcaatgg 3780

aacaaggtat cacagattac gtccaacagc tgggcaatgc ctttggagcc gggttcaccg 3840

ctgagatcgc caattatacc aaccaactca gggatatgct agtgggttct gactctgttg 3900

tggagaaaat catcaggtcc ctagtcagac tcgtctcagc actggtaata gtggtccgaa 3960

accaccagga cctagtaaca gtcggggcca cccttgcact ccttgggtgt gagggttccc 4020

cgtggaaatg gctgaagaga aaagtttgcc aaatcctcgg gattaacatg gcagaaaggc 4080

aatcagacaa ttggatgaag aagtttacgg aaatgtgcaa tgcctttcga ggccttgatt 4140

ggatcgcagc caaaatatcg aaatttatcg attggctcaa acagaaaatc ctacccgagc 4200

tgaaggaaag ggcggagttt gtgaagcacc tcaaacaact ccccttacta gaggctcaag 4260

tcaatacgtt ggagcattcc tcagctagcc aagagaaaca ggagcagcta tttggaaaca 4320

ttcaatacct ggctcaccat tgcagaaaga atgcaccact ctacgcagct gaagccaagc 4380

gcgtttacca cctggagaag cgtgtgctcg gcgccatgca gttcaagacc aagaatcgca 4440

ttgaacccgt ttgtgcgctc atacacggct cccctggcac tggcaaatcg cttgccacca 4500

tgattgtggg tagaaagctg gcagagtacg agggctcgga tgtctactct ctcccacccg 4560

accccgacca ctttgacggt tatcagcagc aagctgttgt ggtgatggac gatcttttac 4620

agaaccccga tgggaaggat atgaccctat tttgccagat ggtgtcaaca gctccattta 4680

ccgtgcccat ggcggcacta gaggacaaag gaaagctctt cacttcaaag tttgtcctgg 4740

cctccactaa cgccgggcag gtcaccccac ctactgtggc tgactataaa gcattacaaa 4800

ggagattttt ctttgattgt gatatagaag tacaaaagga ctacagaaga aatggtacca 4860

cactagatgt tgcgaaggca actgaaacat gtgaggactg ctcccccgtc aacttcaaga 4920

agtgcatgcc cctaatctgt ggtaaggccc tccagctcaa gtcgcgtaag ggcgatggga 4980

tgaggtacag cttggacacc ctgatcagcg aacttcgtcg tgagagcaac cgccgctaca 5040

acatcggcaa cgttctcgag gctttgttcc agggtcctgt tagctacaag cctctgagaa 5100

ttgaagttat tgaggaggag ccggcccctt cagccatcag tgacttgctc caggcagtgg 5160

acaatgagga agtgagagaa tattgcagat caaaagggtg gatagttgag gaaaaagtca 5220

ctgaacttaa gctggagcgc aatgtcaacc gtgcccttgc agtgatccag agtgtgtcac 5280

tcattgccgc tgttgcagga actatctaca tagtgtaccg cctattttca ggcatgcagg 5340

gcccttactc tggcataggc actaactacg ccaccaagaa accagttgtg aggcaagtgc 5400

agacccaagg acccttattt gactttggag tctcgttgtt gaaaaggaac attaggtcag 5460

tcaaaaccgg cactggcgag ttcaccgctc ttggggtcta cgatacaatc attgtcctac 5520

cacgtcacgc aatgcccggg aaaacagttg agatgaatgg cagggagatt gaggttcttg 5580

acgcttatga cttgaatgac aaaacagaca cctcgcttga attgactatt gtcaaactga 5640

aaatgaatga gaagttcagg gacattaggg cgatgattcc agaccaaatt actgattata 5700

atgaagcaat tgtggtagtc aacacatcct attatcccca actctttatg cccgttgggc 5760

gcgtcaagga ttatggcttc cttaatctcg caggcagacc cacccacaga gtcttgatgt 5820

acgagtttcc caccaaggcg ggccaatgtg gtggagtggt agtcagcatg ggtaaaattg 5880

ttggcatcca cgttgggggc aacggtgcgc aaggatttgc cgcctccctc ctgcgcaggt 5940

atttcactgc tgaacaagga caaatagagt acattgagaa gagcaaagat gcaggctacc 6000

cagtaatcaa tgcacccact caaacgaagc ttgagcctag tgttttcttt gatgttttcc 6060

ctggagtgaa ggaaccagcc gtcctccaca agaaggataa gaggcttgaa accaattttg 6120

aggaggccct attttcaaag tacattggga atgtgcagag agacatgcca gaggagctgc 6180

tcattgcaat tgaccactac tcagagcagt taaagatgtt aaatattgac cctcggccca 6240

tttcaatgga ggatgcaatc tacggtacag aagggctcga ggcgctggac ctgggtacta 6300

gcgcaggcta cccttatgtg gctatgggca ttaaaaagag agacatcctg aacaaagaga 6360

ctagggatgt tactaagatg caagaatgca tcgataagta tggcttgaat ctgcccatgg 6420

ttacctatgt taaggatgag ctgagagccc ctgataagat aaagaaaggg aagagtcgcc 6480

tcattgaagc atcgagccta aatgattctg tggcaatgag atgctacttt ggcaacctct 6540

ataaggcttt tcacacgaac ccaggcacta tctccgggtg tgccgtcggt tgtgatcccg 6600

aaaccttctg gagtaagatc ccagtgatga tggatgggga gcttttcggc ttcgattata 6660

cagcctatga tgctagcctg agtcctatgt ggttccacgc tttggctgaa gtgctcagaa 6720

ggattggatt tgtggaatgc aagcatttca ttgatcagct ctgctgcagt caccatcttt 6780

acatggacaa acattattat gtggtcggtg gtatgccctc cggatgctcc ggcacttcca 6840

ttttcaactc catgataaat aacttgatca tccgcacgct ggtcctaaca gtatataaga 6900

acatcgattt ggatgatcta aagataatag cctacgggga tgatgttctc gcatcttacc 6960

cgtttgagat tgatgctagt cttctagcag aggccgggaa aagcttcggc ctaattatga 7020

ctccgcccga caagtccgcg gagtttgtta aactgacctg ggataacgtg acctttttga 7080

agagaaggtt tgtacgcgat gtgcgctacc ccttccttgt tcatccggtc atggacatgt 7140

ctaacatcca tgagtccatt cgttggacca aagaccccag acacactgaa gaccatgtac 7200

gctcactatg cctgttggct tggcattgtg gtgaaaaaga gtacaatgag tttatcacta 7260

agattcgctc cgttccggtc gggagagcct tgcacctacc ttcattcaag gcgctcgaga 7320

ggaagtggta cgattctttt tgaaattgcc aacttgatga tccggtttaa tcagcttcaa 7380

attggcctga atacacccac cggatggggt gt 7412

Claims (6)

1.一种新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311，其特征在于，所述病毒株的保藏编号为CCTCCNO:V202098。

2.如权利要求1所述的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311，其特征在于，所述的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311NO:V202098的全基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.如权利要求1所述的新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCCNO:V202098的分离方法，其特征在于，所述新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCCNO:V202098采用以下步骤分离获得：

(1)取一部分牛粪便加入3倍体积的灭菌PBS(pH7.2～7.4)，旋涡振荡混匀，4℃10000rpm离心10min，取上清液至新的离心管后加入双抗，4℃静置4h；

(2)将步骤(1)中制备获得上清液用0.22μm滤膜过滤2次，-80℃保存备用；

(3)待MDBK细胞汇合度为70～80％时，吸弃培养液，将步骤(2)中制备获得的病毒处理液以1:10的比例稀释到无血清的DMEM培养液中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中孵育2h；

(4)将步骤(3)中培养的细胞吸弃病毒液，加入2～5％含HS的DMEM培养液，继续置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；

(5)每隔6h观察步骤(4)中细胞病变情况，待细胞病变或脱落达到50％时，用无菌封口膜将培养皿封口，反复冻融三次，将细胞悬液转移至1.5mL离心管，2000rpm离心5min，收集上清液，冻存于-80℃；

(6)将步骤(5)中制备获得的上清液吸出1mL稀释到4mL DMEM培养液中，继续接种到70～80％细胞中，孵育2h，弃掉病毒液，加入维持液，观察细胞病变，以此方法盲传至15代，即获得稳定的毒株BL311。

4.如权利要求1所述新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCCNO:V202098在制备用于预防和/或治疗牛肠道病毒感染的相关药物中的应用。

5.如权利要求1所述新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCCNO:V202098用于模型动物构建中的应用。

6.如权利要求5所述新强毒株牛肠道病毒BEV新疆分离株BL311CCTCCNO:V202098用于模型动物构建中的应用，其特征在于，所述的模型动物为BALB/c小鼠。

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