CN101215552A

CN101215552A - F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途

Info

Publication number: CN101215552A
Application number: CNA2008100580340A
Authority: CN
Inventors: 李琦涵; 梁燕; 马绍辉; 谢忠平; 刘龙丁; 崔平芳; 王丽春; 史长军; 董承红
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2008-01-16
Filing date: 2008-01-16
Publication date: 2008-07-09

Abstract

本发明公开了一种F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途。本发明收集腮腺炎流行地区的患儿咽漱液，利用常规的病毒分离培养方法，采用Vero细胞从腮腺炎患儿咽漱液标本中分离腮腺炎病毒，经常规RT－PCR方法全基因测序后，明确其为当前流行基因型——F基因型之后，将该分离毒种按常规方法适应于人二倍体细胞(KMB17株)并进行蚀斑克隆及减毒传代，得到F基因型腮腺炎减毒毒种——SP－A株。并按国家及WHO相关规程要求对其进行了全面的检定，明确SP－A株具备普通腮腺炎减毒毒种的安全性，并且具有优于普通腮腺炎减毒毒种的免疫效力。适宜作为腮腺炎减毒疫苗研究开发。

Description

F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途

技术领域

本发明涉及腮腺炎减毒活疫苗，更具体地说，本发明涉及将腮腺炎患儿咽漱液标本中分离出腮腺炎病毒，适应于人二倍体细胞(KMB17株)并进行蚀斑克隆及减毒传代，得到的腮腺炎减毒毒种。同时，本发明还涉及该毒种的用途。

背景技术

腮腺炎病毒(mumps virus，MuV)是引起流行性腮腺炎的病原体。腮腺炎病毒属于副黏病毒科，基因组为不分节段的单负链核糖核酸(RNA)，含有大约15500个核苷酸，在两端序列之间按3′-NP-P-M-F-SH-HN-L-5′的顺序排列着编码7种病毒蛋白的基因。其中，SH基因的变异程度是最大的，因此一般选用SH基因作为分型依据。依据SH抗原上核苷酸的差异，腮腺炎病毒可分为A-L共12个基因型。

我国作为一个大量使用腮腺炎减毒活疫苗的地区，其疫苗毒株除来自国外的成品苗外，主要使用国际通用Jeryl-Lynn株培育得到的S79株。因而病毒基因型均属于国外流行的A基因型。随着近年来国内在腮腺炎流行毒株方面的分子流行病学分析的深入，日益增加的资料均表明，目前在我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。国内外的研究资料均表明，虽然不同基因型的腮腺炎减毒活疫苗可针对其它基因型别的腮腺炎病毒产生交叉性抗原护作用，但这种基因型之间的抗原交叉性是有限的，有时即可表现为不能抵抗其它基因型别病毒的感染，从而再次感染腮腺炎病毒。同时，在许多针对该疫苗使用后副反应的分析资料及该病毒的流行病学资料亦提示，某些毒株和基因型具有神经毒性，例如，已报道的资料表明C、D、G、H、I、J基因型具有明确的神经毒性，但F基因型至今尚无报道涉及其神经毒性。因此，从这两个意义上看，针对我国目前腮腺炎流行发病率仍然属于丙类传染病前列的实际情况，分离及研究开发具有主要流行倾向并具有较好免疫原性的F基因型减毒疫苗毒株，具有重要的现实意义。

其次，目前常规使用的S79株及Jeryl-Lynn株减毒活疫苗均为鸡胚细胞上制备，在使用过程中，有引起由于异源性细胞基质所带来过敏反应等副作用的可能。同样，无论从理论上还是应用上看，使用人源性细胞基质(人二倍体细胞)进行适应性传代培养生长而制备的腮腺炎减毒毒种，可以避免采用鸡胚细胞作为细胞基质可能带来的危害，将具有更实际的应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对目前使用的腮腺炎减毒活疫苗基因型(A基因型)与流行株基因型(F基因型)不相匹配的不足之处，提供一种F基因型腮腺炎减毒毒种。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

在对国内多年腮腺炎流行毒株分析的工作基础之上，收集了发生在云南省红河州石屏县牛街镇他腊希望小学学生群体中的腮腺炎流行的患儿咽漱液，利用常规的病毒分离培养方法，采用Vero细胞从腮腺炎患儿咽漱液标本中分离腮腺炎病毒，经常规RT-PCR方法全基因测序后，明确其为当前流行基因型——F基因型。之后将该分离毒种按常规方法适应于人二倍体细胞(KMB17株)并进行蚀斑克隆及减毒传代，得到F基因型腮腺炎减毒毒种——SP-A株。并按国家及WHO相关规程要求对其进行了全面的检定，明确SP-A株具备普通腮腺炎减毒毒种的安全性，并且具有优于普通腮腺炎减毒毒种的免疫效力。适宜作为腮腺炎减毒疫苗研究开发。

本发明还提供了上述F基因型腮腺炎减毒毒种——SP-A株的基因序列，该序列具有序列表所述的核苷酸序列。

附图说明

图1是分离毒株基因序列的系统分析。

图2是所述的第4代以后的病毒已适应于KMB₁₇细胞，接种5-6天后出现典型病变效果的图。其中，A为分离毒株在KMB-17细胞上的病变情况，B为KMB-17细胞对照。

图3是不同代次，不同免疫剂量病毒免疫后的中和抗体反应情况。

具体实施方式

在下面的实施例中，将结合附图对本发明作具体详细的描述，但这并不是对本发明保护范围的限制。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

实施例1

——咽漱液标本的采集

在患者感染的7～14天之内，使用咽拭子收取腮腺炎患者口腔颊壁粘膜的分泌物及咽漱液，悬于pH7.2无菌磷酸盐溶液中。将该收集物经4℃保存运输，在24小时内保证其存活；若置于-20℃，可保持病毒在3个月内存活。

*本发明所描述的腮腺炎病毒的分离方法为常规传统的腮腺炎病毒分离方法，可适用于任意腮腺炎患者的病毒分离，为常用的经典病毒分离方法。从任意一例腮腺炎患者中均可分离到腮腺炎病毒，所属基因型可能不同，但由于国内流行基因型为F型，因而分离到的腮腺炎病毒应以F基因型为主。所有分离到的任意腮腺炎病毒基因型都具有如下生物学特征：

a.在被感染者出现症状的7-14天之内，腮腺炎病毒均在患者的口腔大量存在。因此使用咽拭子收取口腔颊壁粘膜的分泌物(悬于无菌磷酸盐溶液(pH7.2)中)及口腔漱液(其为磷酸盐平衡液(pH7.2))均可获取。同时，该收集物经4℃保存运输，在24小时内保证存活；若置于-20℃，可保持病毒在3个月内存活。

b.各种基因型的腮腺炎病毒在从患者口腔分离后，按上述方法保存移至实验室，经过孔径为0.2μm的除菌滤器除菌后，均可用于细胞培养物上增殖。所有基因型的腮腺炎病毒均具有在Vero细胞、人胚肺细胞等细胞上适应生长的生物学特性，并可以在这些细胞上稳定传代生长。一般经3-5代的传代生长，即可达到10^5.0CCID50/ml的产量。并通常在接种量达10^3.0CCID50/ml/25cm²细胞生长物时，可在7-8天之内出现典型的细胞病变(表现为细胞变圆、折光性增强、肿胀、坏死等)。

实施例2

——采用Vero细胞分离培养腮腺炎病毒

将收集的腮腺炎患者咽漱液经过孔径为0.2μm的除菌滤器除菌后，接种于Vero细胞。具体操作如下：采用0.25％胰酶-0.01％EDTA消化已形成单层的P148代Vero细胞，待细胞经消化形成单个后，以DMEM-8％BCS重悬细胞，稀释至10^5.0细胞/ml。按2*10^5.0细胞/瓶接种小方瓶，37℃培养3-4天后，将腮腺炎患儿咽漱液接种于细胞单层，37℃吸附30分钟，随后加入含1％小牛血清的DMEM培养液，37℃培养并观察细胞病变(表现为细胞变圆、折光性增强、肿胀、坏死等)。

至7～8天出现细胞病变后，收获培养物后继续同法接种Vero细胞传代至第5代。微量滴定表明，在1～5代病毒传代过程中，病毒的滴度范围在4.2-5.2log CCID₅₀之间。呈上升趋势。

实施例3

——病毒全基因测序确定基因型

采用常规RT-PCR方法进行逆转录、CDNA质粒构建。具体方法如下：Vero细胞上培养的第2代病毒基因组的核酸按Qiagen标准试剂盒说明书进行。病毒基因RNA逆转录使用华美公司RT-PCR试剂盒，按说明书操作。并根据腮腺炎病毒基因序列设计合成19个交叉片段的引物，并分段以RT-PCR方法获得19个CDNA基因片段，克隆入PMD18-T载体中，并逐一测序。得到所分离毒株的全基因序列(基因库登录号为DQ649478)(见图-1)。之后使用VectorNT16.0软件对所分离腮腺炎病毒的SH基因及旁侧核苷酸序列进行分析，并与国内上海地区分离株(Wsh1和Wsh2基因登录号分别为Z77160和Z81005)、兰州地区分离株(Wlz1、Wlz2、Wlz3基因登录号分别为Z77158，Z77161，Z77159)和英国分离株(UK99-102×13、UK99-190基因登录号分别为AY380065、AY380068)的序列作同源性分析。其结果明确显示，所分离毒株与上述这些分离株均属于F基因型，如图1所示，为国内流行基因型。

实施例4

——病毒在KMB₁₇细胞上的适应传代

将上述第5代的腮腺炎病毒收获物接种于KMB₁₇细胞。采用0.25％胰酶-0.01％EDTA消化已形成单层的KMB₁₇细胞，并以DMEM-8％BCS重悬细胞，按10^6.0细胞/小方瓶接种，37℃静止培养至形成致密细胞单层后，接种原Vero细胞收获的病毒液1ml(约为10³-10⁴CCID50/ml)，37℃继续培养。首代仅在8-10天后出现少量不明显的细胞变圆情况，待至第4代以后，病毒已适应于KMB₁₇细胞，接种5-6天后即可出现典型病变(见图-2)。其感染性滴度为5.0logCCID₅₀/ml左右。

实施例5

——病毒的克隆纯化

在KMB₁₇细胞上已适应传代到第5代的腮腺炎病毒收获液，稀释至10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，接种于已形成单层的KMB₁₇细胞(六孔板)，37℃吸附30分钟，加入DMEM-1％BCS，48小时后去除培养液，加入含0.8％琼脂-DMEM，待琼脂固化后，反置培养于37℃。3天后于镜下观察蚀斑形成情况，并标记相应区域后，用巴氏管吸取蚀斑块，置于1.5ml离心管中，加入0.5mlDMEM培养液，吹打使琼脂块破碎后，随即接种于KMB₁₇细胞单层细胞(24孔板)，37℃培养7-8天。待细胞完全病变后，收获病毒，同法再行一次纯化过程，收获病毒继续接种于KMB₁₇生长传代。

实施例6

——减毒毒种的制备

将上述克隆纯化后的病毒继续在KMB₁₇细胞上连续传代至30代。从而得到适应于KMB17细胞生长的F基因型腮腺炎减毒毒种，命名为SP-A株。随后对相关代次的病毒收获物按常规方法进行减毒性状、免疫原性、安全性的全面分析，并与现行使用的A基因型腮腺炎减毒活疫苗进行比较。

实施例7

——病毒减毒性状观察

选取减毒适应传代至15、20、30代病毒进行致腮腺炎发病能力的观察分析。各代次病毒按4.5logCCID50/100ul/侧剂量直接注射恒河猴腮腺，每代次实验组用猴2只。同时，使用该病毒在Vero细胞上扩增至第二代的病毒做为野毒株对照。注射病毒后，逐日观察动物体温，临床体征等情况，并于第11天时，活体取动物腮腺组织进行病理检查。

结果可见，Vero细胞上的第二代病毒组在进行了腮腺致病性实验之后，实验动物出现了体温升高，一般状况较差，腮腺肿大等腮腺炎病毒感染相关的临床症状体征，并且腮腺病理检查也表现为淋巴细胞大量浸润，体现了腮腺炎病毒感染的指征。15、20、30代三个代次实验组在进行了腮腺致病性实验之后，实验动物体温、一般状况均无异常，也无腮腺肿大症状，腮腺病理检查表现为每组各有一只实验猴一侧腮腺腺泡间见少量淋巴细胞浸润，余无异常，这应为注射刺激后的局部反应；综合以上实验资料可见，SP-A株传代至第15代次，病毒已无致腮腺炎发病能力。

实施例8

——不同代次减毒株免疫原性分析

选取第20、25、30代的病毒收获物，每代次设置3.5、4.5、5.5logCCID50/ml三个剂量，每个剂量皮下注射3只恒河猴(体重3kg±0.5kg，年龄2-3岁，公母各半)，同时使用麻-腮联合疫苗(购自北京所，其腮腺炎疫苗滴度按规程为＞4.2logCCID50)做为阳性对照，注射同样恒河猴2只，阴性对照3只注射DMEM 0.5ml。免疫后2、4、8、12周取血分离血清进行中和抗体测定以确定体液免疫效应，如图3所示。结果表明，第20代及第25代组的中和效价优于第30代组及麻-腮疫苗组，即具有比现行的A基因型鸡胚细胞生产的腮腺炎减毒活疫苗更好的免疫效果。

筛选腮腺炎抗体阴性的恒河猴进行免疫原性分析，于免疫后2、4、8周取血分离血清进行中和抗体效价的检测。图中数值均为GMT±SD。如图3所示：各组动物的中和抗体效价均随着免疫后时间的延长而呈增高趋势；在3个代次的实验组及麻-腮疫苗组中，第20代及第25代组的中和效价优于第30代组及麻-腮疫苗组；而在每个代次组的3个剂量组中，均表现为随着剂量的增高，中和抗体效价亦呈增高趋势。

实施例9

——病毒安全性分析

采用猴体神经毒力方法，选取第20及25代病毒收获物，微量法测定病毒滴度后，按5.2logCCID50/0.5ml/侧剂量脑内注射恒河猴，每只猴分注射左右侧注射，每代次病毒使用10只恒河猴，阴性对照组2只恒河猴，按生物制品规程要求进行操作。注射后逐日观察实验猴神经反射体征。取脑各部位组织、进行病理检查。检查内容主要针对炎细胞分布情况和神经元有否损伤。

结果可见，全部实验猴均无麻痹、嗜睡、昏迷、惊厥、上下肢震颤等神经系统症状。脑部各组织病理检查也无神经细胞损伤。因而，SP-A毒株不具有损伤神经细胞的毒力效应，为安全有效的腮腺炎减毒毒株。

实施例10

——病毒基因序列比较

将KMB₁₇细胞上的25代、Vero细胞上的第2代分离病毒的SH基因及其旁侧序列进行比较，结果见表1。虽然至今为止，尚无相关文献报道可由明确的基因序列变化决定腮腺炎病毒的减毒代次。但从序列比较结果而言，还是可见有5个位点发生了基因序列的改变。因而本实验与以上三个实验(病毒减毒性状观察、不同代次减毒株免疫原性分析、病毒安全性分析)共同作为验证腮腺炎减毒毒种的指征。

表1.腮腺炎病毒基因序列比较

病毒代次	SH基因
	SH基因					6180	6297	6370	6415	6483
	Vero2代KMB17 25代	TA	AG	GA	CT	6180	6297	6370	6415	6483	GA

实施例11

——三级种子代次的确定和种子库的建立

根据《中国药典》三部通则“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”要求，将在KMB₁₇细胞上克隆纯化后，并继续传代至第18代的腮腺炎病毒做为F基因型腮腺炎减毒活疫苗原始毒种，名为SP-A株。第20代病毒做为主种子库，第24代病毒做为工作种子分别建库。三级种子库均按《腮腺炎减毒活疫苗(SP-A株)制造及检定规程》(草案)的要求进行全面检定，冻存于-70℃冰箱。优势比较结果如表2所示。

表2.优势比较：

	流行基因型	细胞基质	免疫原性	安全性
	流行基因型	细胞基质	免疫原性	安全性	SP-A株现行使用株	是(F基因型)否(A基因型)	人二倍体细胞鸡胚细胞(异源性)	优良	安全安全

根据《中国药典》的要求检测明确SP-A株具备普通腮腺炎减毒毒种的安全性，并且其具有优于优于目前国内使用的腮腺炎减毒毒种的免疫效力，适宜作为腮腺炎减毒疫苗研究开发的新型毒种。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国医学科学院医学生物学研究所

<120>F基因型腮腺炎减毒毒种SP-A株SH基因及旁侧序列

<130>1

<140>20071227

<141>2007-12-27

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>455

<212>DNA

<213>Mumps virus

<400>1

tcaacacaat atcaagtagt gtcgatgatc tcatcaggta ctaatcctaa cattgtgatt 60

cttcctacat tgagaaaaga tttagaaaaa aaccaaatta agaatgaagc tcctggggtc 120

gtaacgtctc gtgaccctgc cgttgcacta tgccggcaat ccaccctccc ttctacctaa 180

catttctatt gctaattctt cttcatctga tcataacttt gtatgtctgg attatgttaa 240

ccattactca cgagactgcg gtgcaacatg cagcattgta ccagagatcc ctctttcgtt 300

ggagtttcga tcactcactc tagaacgatc tccaacccgg acaagtccca atccatcatg 360

ggaggacaag ctgcattcaa atgatgctgc tcaatcatga gacataaaga aaaaagcagg 420

ccagaacaaa ctcaggatca caatacaaca cagaa 455

Claims

1.一种F基因型腮腺炎减毒毒种，其特征在于：该毒种具有序列表所述的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的F基因型腮腺炎减毒毒种在制备腮腺炎减毒疫苗中的应用。