CN106367400A - 一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用，属于病毒微生物技术领域。所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDV CH/GX/2015 /750A，保藏在中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO:V201646。采用本发明分离的猪流行性腹泻病毒变异毒株可以制备防治猪流行性腹泻的灭活疫苗，该灭活疫苗能有效预防猪流行性腹泻病。本发明为目前猪流行性腹泻病毒变异毒株所造成的猪流行性腹泻疾病提供有效的防治手段。

Description

一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离培养方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒微生物技术领域，属于兽用生物制品领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒变异毒株、其分离培养方法和在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）的致病病原。猪流行性腹泻是一种高度传染的猪肠道传染病，该病以急性水样腹泻、呕吐和脱水死亡为主要特征；各种年龄阶段的猪只均易感，对1～2周龄内的哺乳仔猪危害最为严重，病死率可高达90%～100%，给养猪业造成了严重的危害和经济损失。20世纪70年代，英国和比利时各自率先报道了该病的发生，随后该病在加拿大、匈牙利、德国等欧美多个养猪国家相继被报道；20世纪80～90年代，PED开始出现在亚洲一些养猪国家，并且多次反复的发生PED疫情，如日本、韩国和中国均多次报道了PED。2010年以来，PED在我国的猪群中重新出现，且大范围暴发流行，表现为高发病率和高死亡率的哺乳仔猪腹泻（病死率达80%～100%），造成了数百万的哺乳仔猪死亡。2013年5月以来美国猪群暴发PED疫情，并迅速波及到整个美国和相邻的墨西哥、加拿大等国家，在随后的一年内造成约800万的哺乳仔猪死亡，经济损失在9～18亿美元之间。

PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）同属于甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）的成员，为有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28 kb，包括5’端非编码区、3’端非编码区以及至少7个开放阅读框（ORF1a, ORF1b, ORF2~6），分别编码主要结构蛋白：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）、小包膜蛋白（E）和非结构蛋白（复制酶1a、1b、ORF3蛋白）。S蛋白为I型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方面发挥着十分重要的作用。此外，冠状病毒S基因的变异可以引起病毒组织嗜性的改变和病毒毒力的变化。M蛋白在病毒粒子的组装过程中起着重要的作用，其诱导的抗体在有补体存在的情况下具有中和病毒的作用。N蛋白与病毒的基因组RNA结合形成螺旋型的核蛋白，在病毒感染细胞过程中产量最高的蛋白，是病毒诱导机体免疫的主要优势抗原。ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产量，可能与病毒的毒力有关。

在细胞中分离培养PEDV是开发灭活疫苗或者弱毒疫苗用于防控PED的第一步工作，同时病毒的成功分离培养也是开展病毒学研究和免疫学研究的基础。利用细胞培养进行PEDV的分离是比较困难的，病毒分离受到许多因素的影响，如样品的类型、样品中病毒的滴度、样品中的物质及毒株属性等，即使是从临床样品中分离到了病毒但在传代培养的过程可能会逐渐丧失感染性。

发明内容

本发明的目的提供一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离培养方法和应用。本发明分离的猪流行性腹泻病毒变异毒株经过序列测定，表明该变异毒株同国内外早期毒株和经典疫苗株均存在差异，利用该变异毒株制备的灭活疫苗免疫母猪后对所产仔猪能够起到很好的保护作用。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDV CH/GX/2015 /750A，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC） ，菌种保藏编号为CCTCC NO:V201646 。

所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的保藏信息如下：

分类命名：猪流行性腹泻病毒PEDV CH/GX/2015 /750A

保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）

保藏地址：中国 武汉 武汉大学

保藏日期：2016年 8月 17日

所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种猪流行性腹泻病毒的分离方法，具体步骤如下：

1）将腹泻仔猪的粪便或肠道内容物用RT-PCR检测为PEDV阳性的样品用浓度为0.01mol/L，pH为7.2 PBS制成1:10的悬液，涡旋震荡混匀，4℃条件下12000 r/min离心30 min，取上清用0.22μm的滤器进行过滤后接种至Vero细胞；

2）将生长状态良好、融合度在75%-85%的Vero细胞用PBS洗涤两次，后将其用于病毒分离；3） 将1 mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T25细胞瓶中，在5% CO₂、37℃环境中温育90min，每15 min摇动一次；弃去接种物，加入含有100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10 μg/mL胰酶的DMEM培养基；培养3 d~7 d，期间每天观察有无CPE产生；若无CPE产生则在接种7 d后冻融细胞2后，收集细胞和培养液进行下一代的接毒培养，盲传至第10代仍无CPE出现则弃去；若接种的Vero单层细胞有CPE出现，则在90%的细胞有CPE时，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养；收集的每代细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定；其中RT-PCR扩增鉴定的引物序列为PEDV-P5：5’-gaa ata acc agggtc gtg ga-3’和PEDV-P6：5’-gct cac gaa cag cca cat ta-3’。

4）取已长成良好铺满单层的Vero细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次；将分离毒株第5、10、15、20和25代Vero细胞培养物用含有100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10 μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别将10^-1~10^-10稀释度病毒液接种到96孔细胞培养板的1~10列，每个稀释度接种8孔，每孔接种100μL，同时设11、12列为细胞对照，用DMEM培养基为阴性对照；将培养板置于37℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养120 h，逐日观察CPE并记录；病毒滴度按Reed-Muench法计算，以半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）/mL来表示。

一种如以上所述猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明通过在Vero细胞培养基中加入胰酶的方法，从PEDV阳性的53份临床样品中分离到1株PEDV，已在连续25代细胞培养中稳定增殖，出现稳定的典型的CPE，病毒滴度随着代次的增加不断提高并且稳定在至少7.50 log₁₀ TCID₅₀/ mL。获得可以稳定有效生长和增殖的PEDV分离株为病毒学研究和免疫学研究奠定了基础，为PEDV弱毒疫苗或灭活疫苗的开发提供了毒株来源，对该病的防控研究有重大的意义。

本发明验证了在所有的样品类型中，PEDV阳性的肠道内容物可能是病毒分离的最佳材料，先前报道的分离毒株绝大多数是从自然感染或实验接种猪的肠道内容物中分离出来的；粪便样品是病毒分离主要样品来源，但其病毒分离成功率远低于肠道内容物；从血清等样品进行病毒分离的尝试并没有获得成功。

附图说明

图1 是实施例2细胞病变图，其中a是第4代PEDV出现的细胞病变，b是对照细胞形态。

图2是实施例2 PEDV CH/GX/2015 /750A分离毒株不同代次的病毒滴度图，其中P5、P10、P15、P20、P25分别表示第5、10、15、20、25代Vero细胞培养物。

图3是实施例2 PEDV分离毒株的RT-PCR电泳图，其中M：第一泳道为Maker 2000，1-7分别为：第1-5、10、20代Vero细胞培养物RT-PCR产物。

图4 实施例2 PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株与22个参考毒株全基因序列同源性比较。

图5 实施例2 PEDV S蛋白56~165位氨基酸比对。

具体实施方式

实施例1

1.1主要试剂

非洲绿猴肾细胞（Vero）购于武汉大学中国典型培养物保藏中心；细胞培养基DMEM、胰酶购自Life Technologies公司；胎牛血清购于Hyclone公司；胰蛋白示磷酸肉汤（TPB）为Sigma公司产品；OneStep RT-PCR Kit为QIAGEN公司产品；病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒为Axygen生物科技有限公司产品；E.coli DH5α菌种，由本实验室保存。

1.2 腹泻粪便样品、肠道内容物的处理

取RT-PCR检测为PEDV阳性的腹泻仔猪的粪便样品或者肠道内容物，用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）制成1:10的悬液，涡旋震荡混匀，4℃条件下12000 r/min离心30 min，取上清用0.22μm的滤器进行过滤后即可用于接种Vero细胞。

1.3 病毒的分离与鉴定

取生长状态良好、融合度在75%-85%的Vero细胞用于病毒分离。接毒之前，Vero细胞用PBS洗涤两次。将1 mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T25细胞瓶中，在5% CO₂、37℃环境中温育90 min，每15 min摇动一次。弃去接种物，加入含有100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10 μg/mL胰酶的DMEM培养基。培养3 d~7 d，期间每天观察有无细胞病变（CPE）产生。若无CPE产生则在接种7 d后冻融细胞2次后，收集细胞和培养液进行下一代的接毒培养，盲传至第10代仍无CPE出现则弃去。若接种的Vero单层细胞有CPE出现，则在90%的细胞有CPE时，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养。收集的每代细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定。

1.4 病毒滴度测定（TCID50）测定

取已长成良好铺满单层的Vero细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次。将分离毒株第5、10、15、20和25代Vero细胞培养物用含有100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10 μg/mL胰酶的无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别将10^-1~10^-10稀释度病毒液接种到96孔细胞培养板的1~10列，每个稀释度接种8孔，每孔接种100μL，同时设11、12列为细胞对照。将培养板置于37℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养120 h，逐日观察CPE并记录。病毒滴度按Reed-Muench法计算，以半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）/mL来表示。

1.5 PEDV分离毒株RT-PCR鉴定

参考AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒操作步骤提取PEDV分离株细胞培养物的病毒核酸，具体方法如下：取200 uL PEDV分离株 Vero细胞培养物，转入1.5 mL离心管中，加200 uLBuffer V-L，漩涡振荡混合均匀，静置5 min，加75 uL Buffer V-N，漩涡振荡混合均匀，12,000×g离心5 min，将上清转移到新的2 mL 离心管（试剂盒内提供）中，加300 uL 异丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6-8次，混合均匀，将制备管至于2 mL 离心管（试剂盒内提供）中，将混合液移入制备管中，6,000 ×g 离心1 min，弃滤液，将制备管置回到2 mL 离心管中，加入500 uL Buffer W1A，室温静置1 min，12,000×g离心1 min，弃滤液，将制备管置回到2 mL 离心管中，加800 uL Buffer W2，12,000×g离心1 min，将制备管置回到2 mL 离心管中，12,000×g离心1 min，将制备管置于洁净的1.5 mL 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加40-60 uL Buffer TE（nuclease-free），室温静置1 min，12,000×g离心1min 洗脱RNA。对分离到的PEDV病毒的基因进行RT-PCR扩增鉴定，用于RT-PCR扩增的引物序列为PEDV-P5：5’-gaa ata acc agg gtc gtg ga-3’和PEDV-P6：5’-gct cac gaa cag ccacat ta-3’。同时参照该方法对细胞培养物进行传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等猪肠道病毒检测。

1.6 PEDV分离毒株全基因序列的测定

利用下一代测序技术通过Illumina MiSeq 250PE/300PE平台对分离毒株的第5代病毒进行全基因组序列的测定（苏州金维智生物科技有限公司）。简单来说，首先提取分离毒株P5病毒的总RNA，并将RNA转录成cDNA；将cDNA打断约为500 bp大小的片段，然后将打断形成的粘性末端修复为平末端，再通过3’端加碱基A，使得DNA片段能与3’端带有T碱基的接头连接，用电泳回收目的片段连接产物，再使用PCR扩增两端带有接头的DNA片段，最后用检验合格的文库进行cluster制备和测序。测序数据经过处理后获得PF data，经过去接头、去低质量，获得高质量数据，用质控后的reads和参考基因组CV777（NC_003436）或者AH2012（KC210145）进行比对，然后用比对上参考基因组的数据进行基因组的组装。

1.7 病毒全基因序列的分析

将下一代测序获得的序列进行拼接组装，获得PEDV CH/GX/2015/750A株的基因组全长序列。用MegAlign对其全基因组核苷酸序列和S基因核苷酸序列及其推导的编码氨基酸序列，与GenBank获得的22株PEDV参考毒株的全基因序列进行比对分析，利用MEGA 6.06软件N-J法绘制遗传进化树，参考毒株名称、登录号详见进化树图。

实施例2

2.1 病毒分离

将53份RT-PCR检测为PEDV阳性样品上清液经0.22μm的滤器过滤除菌处理后，接种到生长状态良好的Vero单层细胞，并在培养液加入浓度为10 μg/mL胰酶，成功的分离到1株PEDV，命名为PEDV CH/GX/2015/750A株。该分离毒株盲传到第3代在接毒3 d后出现局灶性的CPE，表现为细胞融合、合胞体的形成及细胞脱落；随着培养代次的增加，CPE出现的时间不断提前，第4代在接毒36小时左右出现特征性CPE，第五代之后接毒24小时内即可看到典型的CPE。该分离毒株可以稳定有效地在细胞培养中增殖，现已在Vero细胞连续传代25代。细胞病变如图所示，表现为细胞折光度降低、细胞肿大、细胞融合及合胞体的形成（图1），而对照细胞表现为正常的形态。

2.2 病毒滴度测定（TCID50）

对PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株的第5、10、15、20、25代Vero细胞培养物，测定病毒滴度。结果显示，PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株第5、10、15、20、25代Vero细胞培养物的TCID₅₀/ mL分别为10^6.29、10^6.88、10^7.29、10^7.50和10^7.61，病毒滴度随着病毒培养代次的增加而逐渐提高且趋于稳定（图2）。

2.3 PEDV分离毒株RT-PCR鉴定

采用RT-PCR方法对PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株的第1-5、10、20代Vero细胞培养物进行鉴定，结果显示各代次细胞培养物PEDV均为阳性，并且1-4代病毒液的电泳条带亮度逐渐增强之后趋于稳定（图3），说明病毒在细胞传代培养中得到了大量增殖。RT-PCR检测分离到的PEDV病毒中传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等肠道病毒均为阴性。

2.4 PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株全基因序列

将下一代测序技术测序得到的原始序列，基于过滤后的数据和参考病毒基因组比对，并提取比对的数据，然后使用Velvet（version1.2.10）软件进行基因组组装，最终拼接出病毒全基因序列。PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株全基因长度为28 038 bp，不包括polyA尾巴。基因组的结构为：5’UTR-ORF1a/1b-Spike-ORF3-E-M-N-3’UTR，5’UTR长度为292 bp，3’UTR长度为334 bp，7个开放阅读框的长度分别为：12 354 bp，8 022 bp，4 161 bp，675 bp，231 bp，681 bp和1 326 bp。与其它的冠状病毒一样，在PEDV基因组ORF1a和ORF1b重叠区域12610~12616 bp有一段滑动序列TTTAAAC，紧接着是假节结构（核糖体框架移位信号），它们被认为是复制酶pp1ab翻译所必需的分子结构。核糖体框架移位信号通过在滑动序列末端的-1 RNA移位方式来实现复制酶pp1ab的翻译，因此推测编码复制酶pp1ab的核苷酸位在基因组中的位置为293~12616、12616~20637。

2.5 全基因组序列分析

PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株全基因组序列与GenBank数据库中的国内外22个参考毒株的全基因序列进行比对，核苷酸同源性为96.8%~99.8%（图4）。本研究分离毒株与中国近年流行的PEDV毒株的核苷酸同源性为98.2%~99.8%，其中与YC2014株同源性最高，核苷酸同源性为99.8%，其次与PEDV-WS株核苷酸同源性为99.7%。与近年美洲、欧洲和亚洲其它国家流行毒株的核苷酸同源性为98.6%~99.2%。与2010年之前的经典毒株的核苷酸同源性为96.8%~97.4%，其中与CV777同源性最低为96.8%，与我国的早期毒株CH/S株同源性为97.3%。

2.6 S基因序列及推导氨基酸序列分析

PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株S基因全长与我国近年的流行毒株AH2012、YC2014、CH/FJND-3以及美国优势流行毒株MN、IA1等一样，均为4161 bp。PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株S基因序列与GenBank数据库中的国内外22个参考毒株的S基因序列进行比对，核苷酸同源性为93.8%~99.8%。本研究分离毒株S基因与中国近年流行的PEDV毒株的核苷酸同源性为97.7%~99.6%，其中与YC2014株同源性最高，核苷酸同源性为99.6%，其次与PEDV-WS株核苷酸同源性为99.4%。与近年美洲、欧洲和亚洲其它国家流行毒株的核苷酸同源性为96.6%~99.1%。与2010年之前的经典毒株的核苷酸同源性为93.8%~95.0%，其中与我国的早期毒株CH/S株同源性最低为93.8%，与CV777同源性为94.1%。

分离毒株S基因与CV777、DR13、CH/S等经典毒株以及Iwoa106、15V010/BEL/2015、OH851等欧美国家流行的S INDEL毒株的S基因相比，在S基因的N’端存在15个核苷酸的插入和6个核苷酸的缺失，具体位置为174-175位核苷酸之间插入CAGGGTGTTAAT，413~414位核苷酸之间插入TGA，483~484位核苷酸之间缺失CAGGAT。与经典毒株和S INDEL毒株相比，分离毒株S基因编码的蛋白质在58~59位氨基酸之间插入QGVN，139~140位氨基酸之间插入N，161~162位氨基酸之间缺失DG（图5）。分离毒株S基因推导的氨基酸与经典毒株、S INDEL毒株的氨基酸同源性为93.4%~96.4%，与我国近年的流行毒株AH2012、YC2014、CH/FJND-3以及美国优势流行毒株MN、IA1的氨基酸同源性为96.8%~99.9%。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120>一株猪流行性腹泻病毒的变异毒株及其分离方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 28038

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acttaaagag attttctatc tacggatagt tagctctttt tctagactct tgtctactca attcaactaa acgaaatttt 80

gtccttccgg ccgcatgtct atgctgctgg aagctgacgt gaaatttcat taggtttgct taagtagcca tcgcaagtgc 160

tgtgctgtcc tctagttcct ggctggcgtt ccgtcgcctt ctacatacta gacaaacagc cttcctccgg ttccgtctgg 240

gggttgcgtg gataactagt tccgtctagt ttgaaaccag taactgtcgg ctatggctag caaccaagtc acattggctt 320

ttgccaatga tgcagaaatt tcagcttttg gcttttgcac tgctagtgaa gccgtctcat actattctga ggccgccgct 400

agtgggttta tgcaatgccg tttcgtgtcc ttcgatctcg ctgacactgt tgagggattg cttcccgaag actatgtcat 480

ggtggtggtc ggcactacca agcttagtgc gtatgtggac acttttggta gccgccccag aaacatttgt ggttggctgt 560

tattctctaa ctgtaattac ttcctcgaag agttagagct cacttttggt cgtcgtggtg gtaacatcgt gccagttgac 640

caatacatgt gtggcgctga cgggaaacct gttcttcagg aatccgagtg ggagtataca gacttttttg ctgactccga 720

agacggtcaa ctcaacattg ctgggatcac ttatgtgaag gcctggattg tagagcgatc ggacgtctct tatgcgagtc 800

agaatttaac atctattaag tctattactt actgttcaac ctatgagcat acttttcctg atggtactgc catgaaggtt 880

gcacgtactc caaagattaa gaagactgtt gtcttgtctg agccacttgc tactatctac agggaaattg gttctccttt 960

tgtggataat gggagcgatg ctcgttctat cattaagaga ccagtgttcc tccacgcttt tgttaagtgt aagtgtggta 1040

gttatcattg gactgttggt gattggactt cctatgtctc cacttgctgt ggctttaagt gtaagccagt ccttgtggct 1120

tcatgctctg ctacgcctgg ttctgttgtg gttacgcgcg ctggtgctgg cactggtgtt aagtattaca acaacatgtt 1200

cctgcgccat gtggcagaca ttgatgggtt ggcattctgg cgaattctta aggtgcagtc caaagacgat ctcgcttgct 1280

ctggtaaatt ccttgaacac catgaggaag gtttcacaga tccttgctac tttttgaatg actcgagcat tgctactaag 1360

ctcaagtttg acatccttag tggcaagttt tctgatgaag tcaaacaagc tatctttgct ggtcatgttg ttgttggcag 1440

tgcgctcgtt gacattgttg acgatgcact gggacagcct tggtttatac gtaagcttgg tgaccttgca agtgcagctt 1520

gggagcagct taaggctgtc gttagaggcc ttaacctcct gtctgatgag gtcgtgctct ttggcaaaag acttagctgt 1600

gccactctta gtatcgttaa cggtgttttt gagtttatcg ccgaagtgcc agagaagttg gctgcggctg ttacagtttt 1680

tgtcaacttc ttgaatgagc tttttgagtc tgcctgtgac tgcttaaagg tcggaggtaa aacctttaac aaggttggct 1760

cctatgttct ttttgacaac gcattggtta agcttgtcaa ggcaaaagtt cgcggcccac gacaggcagg tgtttgtgaa 1840

gttcgttaca caagccttgt tattgggagt actaccaagg tggtttccaa gcgcgttgaa aatgccaatg tgaatctcgt 1920

tgttgttgac gaggatgtga ccctcaacac cactggtcgt acagttgttg ttgacggact tgcattcttc gagagtgacg 2000

ggttttacag acatcttgct gatgctgacg ttgtcattga acatcctgtt tataagtctg cttgtgagct caagccagtt 2080

tttgagtgtg acccaatacc tgattttcct atgcctgtgg ccgctagtgt tgcagagctt tgtgtgcaaa ctgatctgtt 2160

gcttaaaaat tacaacactc cttataaaac ttacagctgc gttgtgagag gtgataagtg ttgcatcact tgcaccttac 2240

atatcacagc accaagttat atggaggatg ctgctaattt tgtagacctc tgtaccagga acattggtac tgctggtttt 2320

catgagtttt acattacggc ccatgaacaa caggatctgc aagggttcgt aaccacttgt tgcacgatgt caggttttga 2400

gtgttttatg cctataatcc cacagtgtcc agcagtgctt gaagagattg atggtggtag catctggcgg tcttttatca 2480

ctggtcttaa tacaatgtgg gatttttgca agcatcttaa agtcagcttt ggactagatg gcattgttgt cactgtagca 2560

cgcaaattta aacgacttgg tgctctcttg gcagaaatgt ataacactta cctttcaact gtggtggaaa acttggtact 2640

ggccggtgtt agcttcaagt attatgccac cagtgtccca aaaattgttt tgggctgttg ttttcacagt gttaaaagtg 2720

ttcttgtaag tgccttccag attcctgtcc aggcaggcat tgagaagttt aaagtcttcc ttaactgtgt tcaccctgtt 2800

gtaccacgcg tcatcgaaac ttcttttgtg gaattagaag agacgacatt taaaccacca gcactcaatg gtagtattgc 2880

tattgttgat ggttttgctt tctattatga tggaacacta tactatccca ccgatggtaa tagtgttgtg cctatctgtt 2960

ttaagaagaa gggtggtggt gatgtcaaat tctctgatga agtctctgtt agaaccattg acccagttta taaggtctcc 3040

cttgaatttg agttcgagtc tgagactatt atggctgtgc ttaataaggc tgttggtaat cgtatcaagg ttacaggtgg 3120

ttgggacgat gttgttgagt atatcaacgt tgccattgag gttcttaaag atcatatcga tgtgcctaag tactacatct 3200

atgatgagga aggtggcacc gatcctaatc tgaccgtaat ggtttctcag tggccgttga atgatgacac gatctcacag 3280

gatctgcttg atgtggaaat tgttactgat gcaccaattg atttcgaggg tgatgaagta gactcctctg accctgataa 3360

ggtggcagat gtggctaact ctgagcctga ggatgatggt cctaatgtag ctcctgaaac aaatgtagag tctgaagttg 3440

aggaagttgc cgcaaccttg tcctttatta aagatacacc ttccacagtt actaaggatc cttttgcttt tgactttgca 3520

agctatggag gacttaaggt tttaagacaa tctcgtaaca actgctgggt tacttctacc ttggtgcagc tacaattgct 3600

tggcatcgtt gatgaccctg caatggagct ttttagtgct ggtagagttg gtccaatggt tcgcaaatgc tatgagtcac 3680

aaaaggctat cttgggatct ttgggtgatg tgtcggcttg cctagagtct ctgactaagg acctacacac acttaagatt 3760

acctgttctg tagtctgtgg ttgtggtact ggtgaacgta tctatgaggg ttgtgctttt cgtatgacgc caactttgga 3840

accgttccca tatggtgctt gtgctcagtg tgctcaagtt ttgatgcaca cttttaaaag tattgttggc accggcatct 3920

tttgtcgaga tactactgct ctctccttgg attctttggt tgtaaaacct ctttgtgcgg ctgcttttat aggcaaggat 4000

agtggtcatt atgtcactaa cttttatgat gctgctatgg ctattgatgg ttatggtcgt catcagataa agtatgacac 4080

actgaacact atttgtgtta aagacgttaa ttggacagca ccttttgtcc cagacgttga gcctgtattg gagcctgttg 4160

tcaaaccgtt ctattcttat aagaatgttg atttttacca aggagatttt agtgaccttg ttaaacttcc atgtgacttt 4240

gttgttaatg ctgcaaatga gaatttgtct cacggtggcg gcatagcaaa ggccattgat gtttatacca agggcatgct 4320

gcagaagtgc tcaaatgatt acattaaagc acacggttcc attaaagttg gacgtggtgt catgttggag gcattaggtc 4400

ttaaggtctt taatgttgtt ggtccacgta agggtaagca tgcacctgag cttcttgtta aggcttataa gtccgttttt 4480

gctaattcag gtgttgctct tacacctttg attagtgttg gaatttttag tgttcctttg gaagaatctt tatctgcttt 4560

tcttgcatgt gttggtgatc gccactgtaa gtgcttttgt tatagtgaca aagagcgcga ggcgatcatt aattacatgg 4640

atggcttggt agatgctatt ttcaaagatg cgcttgttga tactactccc gtccaggaag atgttcaaca agtttcacaa 4720

aaaccagttt tgcctaattt tgaacctttc aggattgaag gtgctcatgc tttctatgag tgtaaccctg aaggtttgat 4800

gtccttaggt gctgacaagc tggtgttgtt tacaaattcc actttggatt tttgtagcgt tggtaagtgt cttaacaatg 4880

tgaccggcgg tgcattgctt gaagccataa atgtatttaa aaagagtaac aaaacagtgc ctgctggcaa ctgtgttact 4960

tttgagtgtg cagatatgat ttctattact atggtagtat tgccagctga tggtgatgct aattatgaca aaaattatgc 5040

acgcgccgtc gtcaaggtat ctaagcttaa aggcaagtta ttgcttgctg ttggtgatgc cacgttgtat tccaagttgt 5120

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gtcactgagg atacacgtag tgttaaggct gttaaagtag aatccactgt tacttatgga caacaaattg gaccttgtct 5280

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attcacatta tggttttgat aaggctggtg agttccacat gctagaccat actgggtttg cctttcctag tgaagttgtt 5440

aacggtaggc gtgtgcttaa aaccacagat aataactgtt gggttaatgt tacatgttta caattacagt ttgctagatt 5520

taggttccag tcagcaggtc tacaggctat gtgggagtcc tattgtactg gtgatgttgc tatgtttgtg cattggttgt 5600

actggcttac tggtgttgac aaaggtcagc ctagtgattc agaaaatgca cttaacatgt tgtccaagta cattgtttct 5680

gctggttctg tcactattga acgtgtcacg catgacggct gttgttgtag taagcgtgtt gtcactgcac cagttgtgaa 5760

tgctagcgta ttgaagcttg gcgtcgagga tggtctttgt ccacatggtc ttaactacat tgacaaagtt gttgtagtta 5840

aaggtactac aattgttgtc aatgttggaa aacctgtagt ggcaccatca cacctctttc ttaagggtgt ttcctacaca 5920

acattcctag ataatggtaa cggtgttgtc ggccattata ctgtttttga tcatgacact ggtatggtgc atgatggaga 6000

tgcttttgta ccgggtgatc tcaatgtatc tcctgttaca aatgttgtcg tctcagagca gactgctgtt gtgattaaag 6080

accctgtgaa gaaagtagag ttagacgcta caaagctgtt agacactatg aattatgcat cggaaagatt cttttccttt 6160

ggtgatttta tgtcacgtaa tttaattaca gtgtttttgt acatccttag cattttgggt ctctgtttta gggcctttcg 6240

taaaagggat gttaaagttc tagctggtgt accccaacgt actggtatta tattgcgtaa aagtgtgcgc tataatgcaa 6320

aggcgttggg tgtcttcttc aagctaaaac tttattggtt caaagttctt ggtaagttta gtttgggtat ttatgcattg 6400

tatgcattac tattcatgac aatacgcttt acacctatag gtggccctgt ttgtgatgat gttgttgctg gttatgctaa 6480

ttctagtttt gacaagaatg agtattgcaa cagtgttatt tgtaaggtct gtctctatgg gtaccaggaa ctttcggact 6560

tttctcacac acaggtagta tggcaacacc ttagagaccc gttaattggt aatgtgatgc ctttctttta tttggcattt 6640

ctggcaattt ttgggggtgt ttatgtaaag gctattactc tctattttat tttccagtac cttaacattc ttggtgtgtt 6720

tttgggccta caacagtcca tttggttttt gcagcttgtg ccttttgatg tctttggtga cgagatcgtc gtctttttca 6800

tcgttacacg cgtattgatg ttccttaagc atgttttcct tggctgcgat aaggcatctt gtgtggcttg ctctaagagt 6880

gctcgcctta agcgcgttcc tgtccagact atttttcagg gtactagcaa atccttctac gtacatgcca atggtggttc 6960

taagttctgt aagaagcaca atttcttttg tttaaattgt gattcttatg gtccaggctg cacttttatt aatgacgtca 7040

ttgcaactga agttggtaat gttgtcaaac ttaatgtgca accgacaggt cctgccacta ttcttattga caaggttgaa 7120

ttcagtaatg gtttttacta tctttatagt ggtgacacat tttggaagta caactttgac ataacagata gcaaatacac 7200

ttgcaaagaa tcacttaaaa attgtagcat aatcacagac tttattgttt ttaacaataa tggttccaat gtaaatcagg 7280

ttaagaatgc atgtgtttat ttttcacaga tgctttgtaa acctgttaag ttagtggact cagcgttgtt ggccagtttg 7360

tctgttgatt ttggtgcaag cttacatagt gcttttgtta gtgtgttgtc gaatagtttt ggcaaagatc tgtcaagttg 7440

taatgacatg caggattgca agagcacatt gggttttgat gatgtaccat tggatacctt taatgttgct gttgctgagg 7520

ctcatcgtta cgatgtcctc ttgactgaca tgtcgttcaa caattttacc accagttatg caaaaccaga ggaaaaactt 7600

cccgtccatg acattgccac gtgtatgcgt gtaggtgcca agattgttaa tcataacgtt cttgtcaagg atagtatacc 7680

tgtggtgtgg cttgtacgtg atttcattgc cctttcggaa gaaactagga agtacattat ccgtacgact aaagttaagg 7760

gtataacctt catgttgacc tttaatgatt gtcgtatgca tactaccata cctactgttt gcattgcaaa taagaagggt 7840

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cttttgacaa tccacttagt tgtgtgcata atgtctttag taacttcgac cagtggcatg atgccaagtt tggtttcacc 8080

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ttatttagct ggtaaaacac ttgtttttgc tattaacacc atttttggta catctggttt gtgctttgat gctagtggcg 8240

ttgctgataa gggcgcttgc atttttaatt cggcttgcac cacattatct ggtttgggtg gaactgctgt ctactgttat 8320

aagaatggtc tagttgaagg tgctaaactt tatagtgagt tggcacctca tagctactat aaaatggtag atggtaatgc 8400

tgtgtcttta cctgaaatta tctcacgcgg ctttggcatc cgtactatcc gtacaaaggc tatgacctac tgtcgcgttg 8480

gccagtgtgt gcaatctgca gaaggtgttt gttttggcgc cgatagattc tttgtctata atgcagaatc tggttctgac 8560

tttgtttgtg gcacaggtct ctttacattg ttgatgaacg ttattagtgt tttttccaag acagtaccag taactgtgtt 8640

gtctggtcaa atacttttta attgcattat tgcttttgct gctgttgcgg tgtgtttctt atttacaaag tttaagcgca 8720

tgttcggtga tatgtctgtt ggcgttttca ctgtcggtgc ttgtactttg ttgaacaatg tttcctacat tgtaacacag 8800

aacacacttg gcatgttggg ctatgcaact ttgtactttt tgtgcactaa aggtgttaga tatatgtgga tttggcattt 8880

gggatttttg atctcatata tacttattgc accatggtgg gttttgatgg tttatgcctt ttcagccatt tttgagttta 8960

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gcaggtacat ttgtgcttga catgcatgcc tatgagagac ttgccaactc tatctcaact gaaaaactgc gtcagtatgc 9120

tagtacctac aataagtaca agtattattc aggcagtgct tcagaggctg attacaggct tgcttgtttt gcccatttgg 9200

ccaaggctat gatggattat gcttctaatc acaacgacac gttatacaca ccacccactg tgagttacaa ttcaactcta 9280

caggctggct tgcgtaagat ggcacaacca tctggtgttg ttgagaagtg catagttcgt gtttgctatg gtaatatggc 9360

tcttaatggc ctatggcttg gtgatactgt tatgtgccca cgccatgtta tagcgtctag tactactagc actatagatt 9440

atgactatgc cctttctgtt ttacgcctcc acaacttctc catttcatct ggtaatgttt tcctaggtgt tgtgggtgta 9520

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accgggtgaa tcttttaata tcttggcgtg ctatgatggt gctgcagctg gtgtttacgg tgttaacatg cgctctaatt 9680

acactattag aggctcgttc attaatggcg cttgtggttc acctggttat aacattaaca atggtaccgt tgagttttgc 9760

tatttacacc agcttgaact tggttcaggc tgtcatgttg gtagcgactt agatggtgtt atgtatggtg gttatgagga 9840

ccaacctact ttgcaagttg aaggcgctag tagtctgttt acagagaatg tgttggcatt tctttatgca gcactcatta 9920

atggttctac ctggtggctt agttcttcta ggattgctgt agacaggttt aatgagtggg ctgttcataa tggtatgaca 10000

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ctctgattgt tacatcttgc attaatttgg catttgatgt tgaagtctac aactatttgg cagagcattt tgattaccat 10480

gtttctctca tgggttttaa tgcacaaggt cttgttaaca tctttgtctg ctttgttgtt accattttac acggcacata 10560

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acgctagtga cattcttagt tgtgctatga cactatttgc tagtgtgact ggcaactggt tcgttggtgc tgtttgttat 10720

aaagctgctg tttatatggc cttgagattt cctacttttg tggctatttt tggtgatatt aagagtgtta tgttctgtta 10800

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tcactacttc tgtctgccaa attgattggt attggtggtg agcggaatat taagatttct tccgttcagt ctaaactgac 11040

tgatattaag tgtagtaacg ttgtgctttt aggctgtctc tctagcatga atgtctcagc aaattcaaca gaatgggcct 11120

attgtgttga cttgcataac aagatcaact tgtgtaatga cccagaaaaa gcgcaggaaa tgctacttgc tttgttggca 11200

tttttcctta gtaagaatag tgcttttggt ttagatgact tattggaatc ctattttaat gacaatagta tgttgcagag 11280

tgttgcatct acttatgtcg gtttgccttc ttatgtcatt tatgaaaatg cacgccaaca gtatgaagat gctgttaata 11360

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actcagcgta agcttgatag aatggctgag caggctgcag cacagatgta taaagaggca agagcagtta ataggaagtc 11520

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acttggcaaa ggatggggtt gtacctctgt ctgtcatacc ggcagtcagt gctactaagc ttaacattgt tacttctgat 11680

atcgattctt ataatcgtat ccagcgtgag ggatgtgtcc actacgctgg taccatttgg aatataattg atatcaagga 11760

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gtgagcgtat tgtcaagctc cagaataatg aaattattcc tggtaagctg aagcagcgct ccattaaggc agaaggagat 11920

ggcatagttg gagaaggtaa ggcactttac aataatgagg gtggacgtac ttttatgtat gctttcatct cggacaaacc 12000

ggacctgcgt gtagttaagt gggagttcga tggtggttgt aacactattg agctagaacc accacgtaag ttcttggtgg 12080

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tttcgctgtg gatcctgcta agacctacat cgatgctgtc aaaagtggtc acaaaccagt aggtaactgt gttaagatgt 12320

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tccgtgtgtc tatattgtag agcacatgtt gagcatccat ctatggatgg tttttgcaga ctgaaaggca agtacgtaca 12480

ggttccacta ggtacagtgg atcctatacg ttttgtactt gagaatgacg tttgcaaggt ttgtggttgt tggctggcta 12560

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gactagagcc ctgtaacggt actgatacac aacatgtgta tcgtgctttt gacatctaca acaaggatgt tgcttgtcta 12720

ggtaaattcc tcaaggtgaa ctgtgttcgc ctgaagaatt tggataagca tgatgcattc tatgttgtca aaagatgtac 12800

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cttggaagga tggtcgtgct atctatggta acgtttgtag aaaggatctt accgagtata ctatgatgga tttgtgttac 12960

gctttacgta actttgatga aaacaattgt gatgttctta agagcatttt aattaaggta ggcgcttgtg aggagtccta 13040

cttcaataat aaagtctggt ttgaccctgt tgaaaatgaa gacattcatc gtgtctatgc attgttaggt accattgttt 13120

cacgtgctat gcttaaatgc gttaagttct gtgatgcaat ggttgaacaa ggtatagttg gtgttgtcac attagataat 13200

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atattactct tatatgatgc ctgttatggg tatgactaat tgccttgcta gtgagtgttt tgttaagagt gatatatttg 13360

gtgaggattt caagtcatat gacctgctgg aatatgattt cacggagcat aagacagcac tcttcaacaa gtatttcaag 13440

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ctacagctgg ttatcatttt aaacagttag gtatagtttg gaacaatgac ctcaacttac actctagcag gctctctatt 13680

aacgaactac tccagttttg tagtgatcct gcattgctta tagcatcatc accagccctt gttgatcagc gtactgtttg 13760

cttttcagtt gcagcgctag gtacaggtat gactaaccag actgttaaac ctggccattt caataaggag ttttatgact 13840

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catgatttta ggctctaagc acaccacatg ctgcagttcc actgaccgct ttttcaggtt gtgcaatgaa ttggctcaag 14560

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tatgcaaact cagttttcaa tatcttccaa gcagtaagtg ccaatgttaa caaacttctt agtgttgaca gcaatgtctg 14720

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gactatgcat cacttggtta tgttgctgat cttaacgcat tcaaggctgt tttgtattac cagaacaatg tcttcatgag 14960

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ctttttctgt cacacttttg gaagattcta ctgctaaatt ctgggatgag agcttttatg ccaacatgta tgagaaatct 15360

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ttgttatcat ataacgaaga acaccaaatt tcaaatcggt gagtttgtgt ttgagaaggc agaatatgat aatgatgctg 16000

taacatataa aactaccgcc acaacaaaac ttgttcctgg catggttttt gtgcttacct cacataatgt tcagccattg 16080

cgcgcaccga ccattgctaa tcaagaacgt tattccacta tacataagtt gcatcctgct tttaacatac ctgaagctta 16160

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ctcactgtgt tatagggcta ggtttgtact atccaggtgc acgtatagtg tttacagctt gttctcatgc agcggtcgat 16320

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caacgttgtc actcaacgca tgtgtgccct taagcctgat gttttcttgc acaagtgtta tcgctgtcct gctgagatag 16720

tgcgtactgt gtctgagatg gtctatgaaa accaattcat tcctgtgcac ccagatagca agcagtgttt taaaatcttt 16800

tgcaagggta atgttcaggt tgacaatggt tcaagtatta atcgcaggca attggatgtt gtgcgtatgt ttttggctaa 16880

aaatccgagg tggtcaaagg ctgtttttat ttctccttat aacagccaga attatgttgc cagccgcatg ctaggtttac 16960

aaattcagac agttgactca tcccagggta gtgagtatga ctatgtcatt tacacacaaa cttcagatac tgcccatgcc 17040

tgtaatgtta acaggtttaa tgttgccatc acaagagcta agaaaggcat attatgtata atgtgcgata ggtccctttt 17120

tgatgtgctt aaattctttg agcttaaatt gtctgatttg caggctaatg agggttgtgg tctttttaaa gactgtagca 17200

gaggtgatga tctgttgcca ccatctcacg ctaacacctt catgtcttta gcggacaatt ttaagactga tcaagatctt 17280

gctgttcaaa taggtgttaa tggacccatt aaatatgagc atgttatctc gtttatgggt ttccgttttg atatcaacat 17360

acccaaccat catactctct tttgcacacg cgactttgcc atgcgtaatg ttagaggttg gttaggtttt gacgttgaag 17440

gagcacatgt tgttggctct aacgtcggta caaatgtccc attgcaatta gggttttcta acggtgttga ttttgttgtc 17520

agacctgaag gttgcgttgt aacagagtct ggtgactaca ttaaacccgt cagagctcgt gctccaccag gggaacaatt 17600

cgcacacctt ttgcctctac ttaaacgcgg ccaaccatgg gatgttgtcc gcaaacgtat agtgcagatg tgtagtgact 17680

acctggccaa cctatcagac atactaattt ttgtgttgtg ggctggtggt ttggagttga caactatgcg ttattttgtc 17760

aagattggac caagtaagag ttgtgattgt ggtaaggttg ctacttgtta caatagtgcg ctgcatacgt actgttgttt 17840

caaacatgcc cttggttgtg attatctgta taacccatac tgtattgata tacagcagtg gggatacaag ggatcactta 17920

gccttaacca ccatgagcat tgtaatgtac atagaaacga gcatgtggct tctggtgatg ccataatgac tcgctgtctg 18000

gccatacatg attgctttgt caagaacgtt gactggtcca tcacataccc atttattggt aatgaggctg ttattaataa 18080

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atcctaaggg catcagatgt gccgtaacgg atgctaagtg gttttgcttt gacaagaatc ctactaattc taatgtcaag 18240

acattggagt atgactatat aacacatggc caatttgatg ggttgtgctt gttttggaat tgcaatgtag acatgtatcc 18320

agaattttct gtggtctgtc gttttgatac tcgctgtagg tcaccactca acttggaggg ttgtaatggt ggttcactgt 18400

atgttaataa tcatgcattc catacaccgg cttttgacaa gcgtgctttt gctaagttga agccaatgcc atttttcttt 18480

tatgatgata ctgagtgtga caagttacag gactccataa actatgttcc tcttagggct agtaactgca ttactaaatg 18560

taatgttggt ggagctgtct gtagtaagca ttgtgctatg tatcatagct atgttaatgc ttacaacact tttacgtcgg 18640

cgggctttac tatttgggtg cctacttcgt ttgacaccta taatctgtgg cagacattta gtaacaattt gcaaggtctt 18720

gagaacattg ctttcaatgt cgtaaagaaa ggatcttttg ttggtgccga aggtgaactt cctgtagctg tggttaatga 18800

caaagtgctc gttagagatg gtactgttga tactcttgtt tttacaaaca agacatcact acccactaac gtagcttttg 18880

agttgtatgc caagcgtaag gtaggactca ccccacccat tacgatccta cgtaacttgg gtgtagtttg tacatctaag 18960

tgtgtcattt gggactatga agccgaacgt ccacttacta cttttacaaa ggatgtttgt aaatataccg actttgaggg 19040

tgacgtctgt acactctttg ataacagcat tgttggttca ttagagcgat tctctatgac ccaaaatgct gtgcttatgt 19120

cacttacagc cgttaaaaag cttactggca taaagttaac ttatggttat cttaatggtg ccccagttaa cacacatgaa 19200

gataaacctt ttacttggta tatttacact aggaagaacg gcaaattcga ggactatcct gatggctatt ttacccaagg 19280

tagaacaacc gctgatttta gccctcgtag cgatatggaa aaggacttcc taagtatgga tatgggtctg tttattaaca 19360

agtacggact tgaagattac ggctttgagc acgttgtgta tggtgatgtt tcaaaaacca cccttggtgg tttacatcta 19440

ctaatttcgc aggtgcgtct gtcctgtatg ggtgtgctta aaatagacga gtttgtgtct agtaatgata gcacgttaaa 19520

gtcctgtact gttacatatg ctgataaccc tagtagtaag atggtttgca cgtatatgga tctcctgctt gacgattttg 19600

tcagcattct taaatcgttg gatttgagcg ttgtatctaa agttcatgaa gttatggtcg attgtaaaat gtggaggtgg 19680

atgttgtggt gtaaggatca taaactccag acattttatc cgcaacttca ggccagtgaa tggaagtgtg gttattccat 19760

gccttctatt tacaagatac aacgtatgtg tttagaacct tgcaatctct ataactatgg cgctggtatt aagttacctg 19860

atggcattat gtttaacgta gttaaataca cacagctttg tcaatatctc aacagcacca caatgtgtgt accccatcac 19920

atgcgtgtgc tacatcttgg tgctggctcc gataagggtg ttgcacctgg cacggctgtc ttacgacgtt ggttgccact 20000

ggatgccatt atagttgaca atgatagtgt ggattacgtt agcgatgctg attatagtgt tacaggagat tgctctacct 20080

tatacctgtc agataagttt gacttagtta tatctgatat gtatgacggt aagattaaaa gttgtgatgg ggagaacgtg 20160

tctaaagaag gcttctttcc ctatattaat ggtgtcatca ctgaaaagtt ggcacttggt ggtactgtgg ctattaaggt 20240

gacggagttt agttggaata agaagttgta tgaactcatt cagaagtttg agtattggac aatgttctgt accagtgtta 20320

acacgtcatc gtcagaggca tttttaattg gtgttcacta tttaggtgat tttgcaagtg gcgctgttat tgacggcaac 20400

actatgcatg ccaattatat cttctggcgt aattccacaa ttatgactat gtcttacaat agtgtacttg atttaagcaa 20480

gttcaattgt aagcataagg ctacagttgt tattaattta aaggattcat ccattagtga tgttgtgtta ggtttgttga 20560

agaatggtaa gttgctagtg cgtaataatg acgccatttg tggtttttct aatcatttgg tcaacgtaaa caaatgaagt 20640

ctttaactta cttctggttg ttcttaccag tactttcaac acttagccta ccacaagatg tcaccaggtg ctcagctaac 20720

actaatttta ggcggttctt ttcaaaattt aatgttcagg cgcctgcagt tgttgtactg ggcggttatc tacctattgg 20800

tgaaaaccag ggtgttaatt caacttggta ctgtgctggc caacatccaa ctgctagtgg cgttcatggt atctttctta 20880

gccatattag aggtggtcat ggctttgaga ttggcatttc gcaagagcct tttgacccta gtggttacca gctttattta 20960

cataaggcta ctaatggtaa cactaatgct actgcgcgat tgcgcatttg ccagtttccc agcattaaaa cattgggccc 21040

cactgctgat aacgatgtta caacaggtcg taactgccta tttaacaaag ccatcccagc tcatatgagt gaacatagtg 21120

ttgtcggcat aacatgggat aatgatcgtg tcactgtctt ttctgacaag atctatcatt tttattttaa aaatgattgg 21200

tcccgtgttg cgacaaagtg ttacaacagt ggaggttgtg ctatgcaata tgtttacgaa cccacttact acatgcttaa 21280

tgttactagt gctggtgagg atggtatttc ttatcaaccc tgtacagcta attgcattgg ttatgctgcc aatgtatttg 21360

ctactgagcc caatggccac ataccagaag gttttagttt taataattgg tttcttttgt ccaatgattc cactttggtg 21440

catggtaagg tggtttccaa ccaaccattg ttggtcaatt gtcttttggc catgcctaag atttatggac taggccaatt 21520

tttctccttc aatcaaacga tcgatggtgt ttgtaatgga gctgctgtgc agcgtgcacc agaggctctg aggtttaata 21600

ttaatgacac ctctgtcatt cttgctgaag gctcaattgt acttcacact gctttaggaa caaatctttc ttttgtttgc 21680

agtaattctt caaatcctca tttagctacc ttcaccatac ctctgggtgc tatccaagta ccctattatt gttttcttaa 21760

agtggatact tacaactcca ctgtttataa atttttggct gttttacctc ctaccgtcag ggaaattgtc atcaccaagt 21840

atggtgatgt ttatgtcaat gggtttggat acttgcatct cggtttgttg gatgctgtca caattaattt cactggtcat 21920

ggcactgacg atgatgtttc tggtttttgg accatagcat cgactaattt tgttgatgca ctcatcgaag ttcaaggaac 22000

tgccattcag cgtattcttt attgtgatga tcctgttagc caactcaagt gttctcaggt tgcttttgac cttgacgatg 22080

gtttttaccc tatttcttct agaaaccttc tgagtcatga acagccaatt tcttttgtta ctccgccatc atttaatgat 22160

cattcttttg ttaacattac tgtctctgct tcctttggtg gtcatagtgg tgccaacctt attgcatctg acactactat 22240

caatgggttt agttctttct gtgttgacac tagacaattt accatttcac tgttttataa cgttacaaac agttatggtt 22320

atgtgtctaa atcacaggac agtaattgcc ctttcacctt gcaatctgtt aatgattacc tgtcttttag caaattttgt 22400

gtttccacca gccttttggc tagtgcctgt accatagatc tttttggtta ccctgagttt ggtagtggtg ttaagtttac 22480

gtccctttac tttcaattca caaagggtga gttgattact ggcacgccta aaccacttga aggtgtcacg gacgtttctt 22560

ttatgactct agatgtgtgt accaagtata ctatctatgg ctttaaaggt gagggtatca ttacccttac aaattctagc 22640

tttttggcag gtgtttatta cacatctgat tctggacagt tgttagcctt taagaatgtc actagtggtg ctgtttattc 22720

tgttacgcca tgttcttttt cagagcaggc tgcatatgtt gatgatgata tagtgggtgt tatttctagt ttgtctagct 22800

ccacttttaa cagtactagg gagttgcctg gtttctttta ccattctaat gatggctcta attgtacaga gcctgtgttg 22880

gtgtatagta acataggtgt ttgtaaatct ggcagtattg gctacgtccc atctcagtct ggccaagtca agattgcacc 22960

tacggttact gggaatatca gtattcccac caactttagt atgagtatta ggacagaata tttacagctt tacaacacgc 23040

ctgttagtgt tgattgtgcc acatatgttt gtaatggtaa ctctcgttgt aaacaattac tcacccagta cactgcagca 23120

tgtaagacca tagagtcagc attacaactc agcgctaggc ttgagtctgt tgaagttaac tctatgctta ctatttctga 23200

agaggctcta cagttagcca ccattagttc gtttaatggt gatggatata attttactaa tgtgctgggt gtttctgtgt 23280

atgatcctgc aagtggcagg gtggtacaaa aaaggtcttt tattgaagac ctgcttttta ataaagtggt tactaatggc 23360

cttggtactg ttgatgaaga ctataagcgc tgttctaatg gtcgctctgt ggcagatcta gtctgtgcac agtattactc 23440

tggtgtcatg gtactacctg gtgttgttga cgctgagaag cttcacatgt atagtgcgtc tctcatcggt ggtatggtgc 23520

taggaggttt tacttctgca gcggcattgc cttttagcta tgctgttcaa gctagactca attatcttgc tctacagacg 23600

gatgttctac agcggaacca acaattgctt gctgagtctt ttaactctgc tattggtaat ataacttcag cctttgagag 23680

tgttaaagag gctattagtc aaacttccaa gggtttgaac actgtggctc atgcgcttac taaggttcaa gaggttgtta 23760

actcgcaggg tgcagctttg actcaactta ccgtacagct gcaacacaat ttccaagcca tttctagttc tattgatgac 23840

atttactctc gactggacat tctttcagcc gatgttcagg ttgaccgtct catcaccggc agattatcag cacttaatgc 23920

ttttgttgct caaaccctca ctaagtatac tgaggttcag gctagcagga agctagcaca gcaaaaggtt aatgagtgcg 24000

ttaaatcgca atctcagcgt tatggttttt gtggtggtga tggcgagcac attttctctc tggtacaggc agcacctcag 24080

ggcctgctgt ttttacatac agtacttgta ccgggtgact ttgtagatgt tattgccatc gctggcttat gcgttaacga 24160

tgaaattgcc ttgactctac gtgagcctgg cttagtcttg tttacgcatg aacttcaaaa tcatactgcg acggaatatt 24240

ttgtttcatc gcgacgtatg tttgaaccta gaaaacctac cgttagtgat tttgttcaaa ttgagagttg tgtggtcacc 24320

tatgtcaatt tgactagaga ccaactacca gatgtaatcc cagattacat cgatgttaac aaaacacttg atgagatttt 24400

agcttctctg cccaatagaa ctggtccaag tcttccttta gatgttttta atgccactta tcttaatctc actggtgaaa 24480

ttgcagattt agagcagcgt tcagagtctc tccgtaatac tacagaggag ctccaaagtc ttatatataa tatcaacaac 24560

acactagttg accttgagtg gctcaaccga gttgagacat atatcaagtg gccgtggtgg gtttggttga ttattttcat 24640

tgttctcatc tttgttgtgt cattactagt gttctgctgc atttccacgg gttgttgtgg atgctgcggc tgttgctgtg 24720

cttgtttttc aggttgttgt aggggtccta gacttcaacc ttacgaagtt tttgaaaagg tccacgtgca gtgatgtttc 24800

ttggactttt tcaatacacg attgacacag ttgtcaaaga tgtctcaaag tctgctaact tgtctttgga tgctgtccaa 24880

gagttggagc tcaatgtagt tccaattaga caagcttcaa atgtgacggg ttttcttttc accagtgttt ttatctactt 24960

ctttgcactg tttaaagcgt cttccttgag gcgcaattat attatgttgg cagcgcgttt tgctgtcatt gttctttatt 25040

gcccactttt atattattgt ggtgcatttt tagatgcaac tattatttgt tgcacactta ttggcaggct ttgtttagtc 25120

tgcttttact cctggcgcta taaaaatgcg ctctttatta tttttaatac tacgacactt tctttcctca atggtaaagc 25200

agcttattat gacggcaaat ccattgtgat tttagaaggt ggtgaccatt acatcacttt tggcaactct tttgttgctt 25280

ttgttagtag catcgacttg tatctagcta tacgtgggcg gcaagaagct gatctacagc tgttgcgaac tgttgagctt 25360

cttgatggca agaagcttta tgtcttttcg caacatcaaa ttgttggcat tactaatgct gcatttgact caattcaact 25440

agacgagtat gctacaatta gtgaatgata atggtctagt agttaatgtt atactttggc ttttcgtact ctttttcctg 25520

cttattataa gcattacttt cgtccaattg gttaatctgt gcttcacttg tcaccggttg tgtaatagcg cagtttacac 25600

acctataggg cgtttgtata gagtttataa gtcttacatg caaatagacc ccctccctag tactgttatt gacgtataaa 25680

cgaaatatgt ctaacggttc tattcccgtt gatgaggtga ttcaacacct tagaaactgg aatttcacat ggaatatcat 25760

actgacgata ctacttgtag tgcttcagta tggccattac aagtactctg cgttcttgta tggtgtcaag atggctattc 25840

tatggatact ttggcctctt gtgttagcac tgtcactttt tgatgcatgg gctagctttc aggtcaattg ggtctttttt 25920

gctttcagca tccttatggc ttgcatcact cttatgctgt ggataatgta ctttgttaat agcattcggt tgtggcgcag 26000

gacacattct tggtggtctt tcaatcctga aacagacgcg cttctcacta cttctgtgat gggccgacag gtctgcattc 26080

cagtgcttgg agcaccaact ggtgtaacgc taacactcct tagtggtaca ttgcttgtag agggctataa ggttgctact 26160

ggcgtacagg taagtcaatt acctaatttc gtcacagtcg ccaaggccac tacaacaatt gtctacggac gtgttggtcg 26240

ttcagttaat gcttcatctg gcactggttg ggccttctat gtccggtcca aacacggcga ctactcagct gtgagtaatc 26320

cgagttcggt tctcacagat agtgagaaag tgcttcattt agtctaaaca gaaactttat ggcttctgtc agttttcagg 26400

atcgtggccg caaacgggtg ccattatccc tctatgcccc tcttagggtt actaatgaca aacccctttc taaggtactt 26480

gcaaataatg ctgtacccac taataaagga aataaggacc agcaaattgg atactggaat gagcaaattc gctggcgcat 26560

gcgccgtggt gagcgaattg aacaaccttc caattggcat ttctactacc tcggaacagg acctcacgcc gacctccgct 26640

ataggactcg tactgagggt gttttctggg ttgctaaaga aggcgcaaag actgaaccca ctaacctggg tgtcagaaag 26720

gcgtctgaaa agccaatcat tccaaatttc tctcaacagc ttcccagcgt agttgagatt gttgaaccta acacacctcc 26800

tacttcacgt gcaaattcac gtagcaggag ccgtggtaat ggcaacaaca ggtccagatc tccaagtaac aacagaggca 26880

ataaccagtc ccgcggtaat tcacagaatc gtggaaataa ccagggtcgt ggagcttctc agaacagagg aggcaataat 26960

aataacaata acaagtctcg taaccagtcc aagaacagaa accagtcaaa tgaccgtggt ggtgtaacat cacgcgatga 27040

tctggtggct gctgtcaagg atgcccttaa atctttgggc attggcgaaa accctgacaa gcttaagcaa cagcagaagc 27120

ccaaacagga aaggtctgac agcagcggca aaaatacacc taagaagaac aaatccagag ccacttcgaa agaatgtgac 27200

cttaaagaca tcccagagtg gaggagaatt cccaagggcg aaaatagcgt agcagcttgc ttcggaccca ggggaggctt 27280

caaaaatttt ggagatgcgg aatttgtcga aaaaggtgtt gatgcctcag gctatgccca gatcgccagt ttagcaccaa 27360

atgttgcagc attgctcttt ggtggtaatg tggctgttcg tgagctagcg gactcttacg agattacata caattataaa 27440

atgactgtgc caaagtctga tccaaatgta gagcttcttg tttcacaggt ggatgcattt aaaactggga atgcaaaacc 27520

ccagagaaag aaggaaaaga agaacaagcg tgaaaccacg cagcagctga atgaagatgc catctacgat gatgtgggtt 27600

tgccatctga ttcgactcat gacaatttgg aatgggacac agctgttgac ggtggtgaca cggccgttga aatcatcaac 27680

gagatcttcg atacaggaaa ttaaacaatg tttgactggc ttatcctggc tatgttccag ggtagtgcca ttacactgtt 27760

attactgagt gtttttctag cgacttggct gctgggctat ggctttgccc tctaactagc ggtcttggtc ttgcacacaa 27840

cggtaagcca gtggtaatgt cagtgcaaga aggatattac catagcactg tcacgagggg aacgcagtac cttttcatct 27920

aaacctttgc acgagtaatc aaagatccgc ttgacgagcc tatatggaag agcgtgccag gtatttgact caaggactgt 28000

tagtaactga agacctgacg gtgttgatat ggatacac 28038

Claims (9)

1.一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为PEDV CH/GX/2015 /750A，保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），菌种保藏编号为CCTCC NO:V201646。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒变异毒株，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒变异毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）将腹泻仔猪的粪便或肠道内容物检测为PEDV阳性的样品用PBS制成1:10的悬液，涡旋震荡混匀，4℃条件下12000 r/min离心30 min，取上清用0.22μm的滤器进行过滤后接种至Vero细胞；

2）将生长状态良好、融合度在75%-85%的Vero细胞用PBS洗涤两次，后将其用于病毒分离；3） 将1 mL经过滤的PEDV阳性悬液加到T25细胞瓶中，在5% CO₂、37℃环境中温育90min，每15 min摇动一次；弃去接种物，加入DMEM培养基；培养3 d~7 d，期间每天观察有无CPE产生；接种的Vero单层细胞有CPE出现时，在90%的细胞有CPE时，将细胞冻融2次后收集细胞和培养液并继续传代培养；收集的每代细胞培养物进行RT-PCR扩增鉴定；

4）取已长成良好铺满单层的Vero细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次；将分离毒株第5、10、15、20和25代Vero细胞培养物用无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别将10^-1~10^-10稀释度病毒液接种到96孔细胞培养板的1~10列，每个稀释度接种8孔，每孔接种100μL，同时设11、12列为细胞对照；将培养板置于37℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养120 h，逐日观察CPE并记录；病毒滴度按Reed-Muench法计算，以半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）/mL来表示。

4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，所述步骤1）中腹泻仔猪的粪便或肠道内容物检测采用RT-PCR检测。

5. 根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，所述步骤1）中PBS的浓度为0.01 mol/L，pH为7.2。

6.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，所述步骤3）和4）中DMEM培养基含有100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、0.3%胰蛋白示磷酸肉汤及10 μg/mL胰酶。

7.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，所述步骤3）中RT-PCR扩增鉴定的引物序列为PEDV-P5：5’-gaa ata acc agg gtc gtg ga-3’和PEDV-P6：5’-gct cac gaa cag cca cat ta-3’。

8.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的分离方法，其特征在于，所述的步骤4）中细胞对照采用DMEM培养基为阴性对照。

9.一种权利要求1所述猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。