CN105400744A - 一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用 - Google Patents

一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒(porcine？epidemic？diarrhea？virus)变异毒株及其分离培养方法和应用。所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为CH/ZMDZY/11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC？NO.10893。采用本发明分离的猪流行性腹泻病毒变异毒株可以制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗，该灭活疫苗能有效预防猪流行性腹泻病。本发明为目前猪流行性腹泻病毒变异毒株所造成的猪流行性腹泻疾病提供有效的防制手段。

Description

一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用
一、技术领域：
本发明涉及病毒微生物领域，属于兽用生物制品领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒变异毒株、其分离培养方法和在制备猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中的应用。
二、背景技术：
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)最早于1971年在英国的初生仔猪和育肥猪群中被发现，19世纪80年代，亚洲也报道了PED的发生，并在之后持续流行。随着PED弱毒疫苗和灭活疫苗的广泛使用，在多年内，全世界PED的流行得到了一定的控制。但是2010年底，中国再次暴发了PED，此次流行的PED主要侵害1周龄内仔猪，造成感染仔猪呕吐、腹泻、继而脱水和急性死亡，随后日本、韩国、泰国等亚洲国家以及德国、法国、瑞士、匈牙利、意大利等欧洲国家也相继报道了PED的暴发。2013年4月，美国爱荷华州首例PED被公布，之后一年时间内，快速席卷了美国31个州，造成了养猪业重大的经济损失。
引起PED的元凶PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属α冠状病毒，该病毒属于单股正义RNA病毒，基因组全长约28Kb，至少编码7个开放阅读框，编码顺序为5’UTR-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，病毒粒子直径为130nm(95nm～190nm)，囊膜上有花瓣状纤突，长18nm～23nm，由核心向四周呈放射状。
PEDV的体外分离一直相对困难，Vero细胞的来源、毒株间的差异及培养条件上的一些细节把握均会对PEDV的分离造成影响。本发明在多次成功分离PEDV的经验基础上，总结了一套实用的病毒分离和培养方法，同时，大量的基因组序列测定及进化树分析发现，新出现的流行毒株同传统的如CV777之类的疫苗毒株相比已经发生了较大的变化，使得传统疫苗不能够对新的病毒感染提供足够的保护力，因此，分离新的流行毒株并且在此基础上制备新的疫苗已经迫在眉睫，本发明便是在此背景下应运而生。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：提供一株猪流行性腹泻病毒变异毒株及其分离培养方法和应用。本发明所分离的一株毒株经过序列测定，对S基因和ORF3基因(基因序列详见附件seq1和seq2)的序列比较表明，该变异毒株同国内外早期毒株和经典疫苗株均存在差异，利用该变异毒株制备的灭活疫苗免疫母猪后对所产仔猪能够起到很好的保护作用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供的一株猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)变异毒株，其菌种微生物保藏号为：CGMCCNO.10893。
所述猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)变异毒株的保藏信息如下：
分类命名：猪流行性腹泻病毒；
保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2015年6月18日；
保藏编号：CGMCCNO.10893。
本发明的积极有益效果：
本发明技术方案将为猪流行性腹泻病毒的分离培养提供一种稳定可靠的方法，为目前猪流行性腹泻病毒变异毒株所造成的猪流行性腹泻疾病提供有效的防制手段。
四、附图说明：
图1：采集腹泻仔猪小肠内容物的PCR产物电泳检测图；
图1中，M：DL2000DNAMarker；1：CV777细胞毒；2：空白对照；3-7：采集的腹泻仔猪小肠内容物。
图2：间接免疫荧光对病毒的检测图；
图2中，无水乙醇固定，3％BSA封闭，一抗为抗PEDVS蛋白的兔多克隆抗体(1:50稀释)，二抗为FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗兔IgG(1:500稀释)；显示比例200×。
图3：透射电镜对病毒的检测图。
五、具体实施方式：
实施例1：本发明一株猪流行性腹泻病毒变异毒株：
本发明一株猪流行性腹泻病毒变异毒株，毒株命名为CH/ZMDZY/11，于2015年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.10893。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明一株猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离培养方法，详细步骤为：
a、病料的采集与处理：
采集出现水样腹泻仔猪的小肠内容物，用1×PBS缓冲液以1：1的体积比进行稀释，震荡混匀后于10000×g条件下离心10min，取上清，采用0.22μm滤器过滤除菌，所得处理液分装冻存于-70℃，备用。
b、病料的RT-PCR(反转录聚合酶链式扩增反应)检测：
取步骤a所得处理液200μL，采用TRizol法提取RNA；然后建立如下反转录反应体系：5×M-MLVBuffer4μL、dNTP(10mM)1μL、下游引物5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3(25μM)1μL、M-MLV反转录酶(200U·μL-1)0.5μL、RRI(RecombinantRNaseInhibitor)(40U·μL-1)0.5μL、RNA200ng，DEPC(焦碳酸二乙酯)水补足20μL，混匀后置于PCR仪上，反应采用如下程序：42℃处理1h，70℃灭活15min；
反转录后获得的cDNA用下述引物进行PCR，上游引物：5-CTTCCGAGTGTAGTTGAGAT-3，下游引物：5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3，引物定位于PEDV的N基因，扩增产物大小629bp，扩增采用50μL反应体系：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTP(10mM)1μL、上下游引物(25μM)各1μL、Taq聚合酶(5U·μL-1)0.5μL、cDNA100ng，ddH2O补足50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min；同时设立空白对照(以去离子水为空白对照)和CV777毒株阳性对照；
反应结束后，取10μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(结果详见附图1)；检测为PCR阳性的病料，分别进行猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)四种外源病毒的检测，检测结果为阴性的病料进行下一步的病毒分离；
c、猪流行性腹泻病毒的分离传代：
6孔板每孔接种1×106个Vero细胞(ATCCCCL-81)，24h内接种步骤a中除菌分装冻存的处理液，产物依次进行5倍稀释，取5-2-5-4三个稀释度各500μL接种，接种前弃去培养液，用PBS液清洗两遍，同时设置阴性对照孔(采用DMEM培养基为阴性对照)，于37℃、5％CO2培养箱吸附1h后，每孔补加1.5mL维持液(维持液中含0.3％胰蛋白胨磷酸盐肉汤、0.02％酵母提取物和5μg/ml胰酶的1×DMEM培养基)，37℃、5％CO2培养箱培养，24h后，其中一个样品接种稀释度为5-2的孔出现典型的病变，即细胞融合、合胞体形成，继续传代至第10代，仍然出现典型的病变，分离得到一株可稳定传代的PEDV毒株，命名为CH/ZMDZY/11。
本发明猪流行性腹泻病毒变异毒株的间接免疫荧光检测：
6孔板每孔接种1×106个Vero细胞，24h内按感染复数0.1接种上述分离出来的病毒，接种前弃去培养基，采用PBS缓冲液清洗两遍，同时设立不接毒的细胞对照孔(加入DMEM培养基)；于37℃、5％CO2培养箱吸附1h，弃上清，每孔加入与上述步骤c中同样的维持液，24h后在显微镜下观察，接毒细胞发生病变，弃去上清，采用PBS缓冲液洗涤3遍，用-20℃预冷的无水乙醇固定30min，PBS洗涤3次，然后采用3％BSA封闭1h，弃上清，每孔加入500μL的抗PEDVS蛋白的兔多克隆抗体(1:50稀释，3％BSA稀释)，37℃孵育1h后，PBS洗涤3次，每次5min；接着每孔加入500μLFITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗兔IgG(1:500稀释，3％BSA稀释)，37℃孵育30min后，PBS洗涤3次，每次3min；倒置荧光显微镜观察结果。结果显示：阴性对照细胞没有荧光，接毒孔在细胞病变处均有很亮的荧光，进一步证明本发明所分离病毒为猪流行性腹泻病毒，结果详见附图2。
本发明猪流行性腹泻病毒变异毒株的电镜检测：
T25细胞培养瓶接种2×106个Vero细胞，24h内按感染复数0.1接种病毒，接种24h后在显微镜下观察，病变达到80％，细胞刮刀刮下细胞层，收集到1.5mLEP管中，反复冻融3次，10000×g离心30分钟，取上清用3％磷酸钨负染，透射电镜检测，透射电镜为日本电子株式会社产品，型号为JEOLJEM-1400，结果可清晰观察到球形的病毒粒子，大小约100-200nm，病毒外周具有纤突，也就是所谓的“冠”，为典型的冠状病毒特征(详见附图3)。
本发明猪流行性腹泻病毒变异毒株(CH/ZMDZY/11)的全基因组序列测定及其分析：
1)序列测定：
利用17对引物(详见表1)扩增了病毒的全基因组，扩增体系50μL：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTP(10mM)1μL、上下游引物(25μM)各1μL、Taq聚合酶(5U·μL-1)0.5μL、cDNA100ng，ddH2O补足50μL；程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸5min，分别用胶回收纯化试剂盒回收目的片段，克隆到pMD18-T载体上，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
表1PEDV全基因组扩增用引物信息
2)序列分析：
将本发明CH/ZMDZY/11毒株的S基因(核苷酸序列为SEQIDNO:1)和ORF3基因(核苷酸序列为SEQIDNO:2)两个基因分别同Genebank中其它来源于美国、中国以及经典的毒株相应基因利用MEGA6.06软件进行对比、遗传进化分析。结果表明：本发明毒株的S基因与中国早期流行毒株和经典疫苗株均存在差异；ORF3基因与经典疫苗株，经典疫苗株的ORF3有49bp的缺失，表明本发明毒株为猪流行性腹泻病毒变异株。
实施例2：猪流行性腹泻病毒变异株CH/ZMDZY/11灭活疫苗的制备及应用：
1)猪流行性腹泻病毒变异株CH/ZMDZY/11灭活疫苗的制备：
病毒培养：病毒培养采用VERO细胞，待细胞生长覆盖率达90％时，优选感染复数为0.1接种病毒，优选病毒维持液为含0.3％胰蛋白胨磷酸盐肉汤、0.02％酵母提取物和5μg/ml胰酶的1×DMEM培养基，37℃培养，当细胞病变达到80％时收获病毒液，于-70℃和室温反复冻融三次，10000×g离心10分钟，去掉细胞碎片，取上清冻存于-70℃。
病毒液的灭活：在病毒含量合格的病毒液中(优选≥107.0PFU/mL)加入甲醛，使甲醛的终浓度达到0.3％(体积浓度)，于37℃作用24小时，其间每隔2小时摇匀一次，灭活结束后加入终浓度为0.3％(质量体积比)硫代硫酸钠溶液充分混匀，用来中和甲醛，获得灭活的病毒液。
灭活检验：取灭活后的病毒液用病毒维持液10倍稀释，接种VERO细胞(6孔板)，每孔接种500μL，同时设立阴性对照孔(采用病毒维持液作为阴性对照)，37℃吸附1h后补加1mL维持液，37℃、5％CO2下培养，观察细胞病变，盲传3代，未出现细胞病变，表明灭活完全。
制备含猪流行性腹泻病毒变异株CH/ZMDZY/11的疫苗组合物：
水相：上述所得灭活的病毒液。
油相：注射用白油和司本-80按照体积比92：6混合，然后加入终浓度(质量体积比)2％的硬脂酸铝，混匀后高压灭菌。
乳化：按照体积比2：1将油相和水相进行混合并乳化，制备灭活疫苗。乳化质量能够达到国家规定的质量标准。
2)猪流行性腹泻病毒变异株CH/ZMDZY/11灭活疫苗的免疫效力试验：
试验方法：
试验动物及分组：试验共选用8头PEDV抗原和抗体均为阴性的妊娠母猪，试验按表2中所设计进行。
表2试验动物分组情况
攻毒保护试验：免疫母猪所产仔猪7天时进行攻毒，攻毒前仔猪均采食母乳，每头母猪所产仔猪各选用5头，每头仔猪口服PEDV流行毒株CH/ZMDZY/11病毒液(107.0PFU/mL)各2mL，同时随机从所产仔猪中选取5头作为空白对照，攻毒后连续观察一周，记录仔猪腹泻、呕吐及死亡症状。
试验结果：试验结果见表3。结果显示所制备灭活疫苗免疫母猪所产仔猪对于PEDV流行毒的感染均有一定的抵抗力，其中高剂量组组1的效果尤为明显，对于仔猪的保护率能够达到100％，中剂量组组2也具有90％的保护率，低剂量组组3保护力稍低，为70％，此数据可以为该灭活疫苗的临床使用起到一定的指导意义。
表3攻毒保护试验情况

Claims (6)

1.一株猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)变异毒株，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒变异毒株命名为CH/ZMDZY/11，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNO.10893。
2.一株猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括以下步骤：
a、病料的采集与处理：
采集出现水样腹泻仔猪的小肠内容物，用1×PBS缓冲液以1：1的体积比进行稀释，震荡混匀后于10000×g条件下离心10min，取上清，采用0.22μm滤器过滤除菌，所得处理液分装冻存于-70℃，备用。
b、病料的RT-PCR检测即反转录聚合酶链式扩增反应检测：
取步骤a所得处理液200μL，采用TRizol法提取RNA；然后建立如下反转录反应体系：5×M-MLVBuffer4μL、dNTP(10mM)1μL、下游引物5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3(25μM)1μL、M-MLV反转录酶(200U·μL-1)0.5μL、RRI(RecombinantRNaseInhibitor)(40U·μL-1)0.5μL、RNA200ng，焦碳酸二乙酯DEPC水补足20μL，混匀后置于PCR仪上，反应采用如下程序：42℃处理1h，70℃灭活15min；
反转录后获得的cDNA用下述引物进行PCR，上游引物：5-CTTCCGAGTGTAGTTGAGAT-3，下游引物：5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3，引物定位于PEDV的N基因，扩增产物大小629bp，扩增采用50μL反应体系：10×Buffer(含Mg2+)5μL、dNTP(10mM)1μL、上下游引物(25μM)各1μL、Taq聚合酶(5U·μL-1)0.5μL、cDNA100ng，ddH2O补足；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min；同时设立空白对照和CV777毒株阳性对照；
反应结束后，取10μLPCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；检测为PCR阳性的病料，分别进行猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪伪狂犬病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV2和猪瘟病毒CSFV四种外源病毒的检测，检测结果为阴性的病料进行下一步的病毒分离；
c、猪流行性腹泻病毒的分离传代：
6孔板每孔接种1×106个Vero细胞(ATCCCCL-81)，24h内接种步骤a中除菌分装冻存的处理液，产物依次进行5倍稀释，取5-2-5-4三个稀释度各500μL接种，接种前弃去培养液，用PBS液清洗两遍，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO2培养箱吸附1h后，每孔补加1.5mL维持液，37℃、5％CO2培养箱培养，24h后，其中一个样品接种稀释度为5-2的孔出现典型的病变，即细胞融合、合胞体形成，继续传代至第10代，仍然出现典型的病变，分离得到一株可稳定传代的PEDV毒株，命名为CH/ZMDZY/11。
3.根据权利要求2所述的一株猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离培养方法，其特征在于，步骤b中所述空白对照采用去离子水为空白对照。
4.根据权利要求2所述的一株猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离培养方法，其特征在于，步骤c中所述维持液：含0.3％胰蛋白胨磷酸盐肉汤、0.02％酵母提取物和5μg/ml胰酶的1×DMEM培养基。
5.根据权利要求2所述的一株猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离培养方法，其特征在于，步骤c中所述同时设置阴性对照孔，所述阴性对照采用DMEM培养基为阴性对照。
6.一种权利要求1所述猪流行性腹泻病毒变异毒株在制备防治猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用。
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