CN106190988A - 猫嵌杯病毒ch‑jl5株灭活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猫嵌杯病毒CH‑JL5株及猫嵌杯病毒CH‑JL5株灭活疫苗，灭活疫苗采用皮下注射，免疫接种操作方便。实验结果表时所述灭活疫苗不会引起FCV毒力增强或导致基因整合，也不会引起猫结膜炎、鼻炎、口腔溃疡或急性死亡，安全无副作用。实验表明，所述猫嵌杯病毒灭活疫苗能诱导猫产生良好的体液免疫和细胞免疫，采用FCV CH‑SH株进行攻毒试验，免疫保护率为96%；采用FCV 2080株进行攻毒试验，免疫保护率为100%；采用FCV USDA株进行攻毒试验，免疫保护率为100%。

Description

猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗

技术领域

本发明属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及猫嵌杯病毒CH-JL5株和猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猫嵌杯病毒（Feline calicivirus，FCV），是一种能够引起猫和所有猫科动物口腔及上呼吸道疾病的病原，是一种多发性、流行性、具有高度传染性的病原，所引起的疾病我们称之为猫传染性-鼻结膜炎。FCV是一种很容易发生变异的一种病毒，不同毒株之间因为变异毒株的存在，其毒力针对不同动物体质其致病力也不同，在临床上，所表现的症状也不一样。单独的FCV感染不会引起猫和猫科动物的死亡，常常和细菌、衣原体、支原体、寄生虫以及其他猫科上呼吸道病毒发生混合感染，这也是导致该病死亡率增高的原因之一。近年来，更是频频出现了高致死性变异强毒株，在意大利、法国和英国已有报道，更有狗感染的病例报道。该病毒在世界各地均被分离得到，最早在1957年，该病毒由Fastier等人第一次在猫科动物身上分离出来；Kadoi也从非洲地区的狮子和老虎的口腔和鼻腔分离出该病毒；在1997年，王祥生、夏咸柱等在我国广西一动物园病死的2只大虎和4只小虎体内成功分离到该病毒；2002年，高玉伟等人在我国上海地区动物园老虎和猎豹的口腔以及分泌物中成功分离到两株病毒。由此可见，该病很久以来一直在全世界各个地区感染着猫科动物，不仅对猫造成一定的危害，对野生保护动物的侵袭更不容忽视，应引起我们的重视。

FCV对猫的感染十分常见，无论是私人养的宠物猫还是在外流浪的野猫。目前，私人宠物猫的圈养条件、宠物医院的卫生条件差、宠物猫与宠物猫的私自接触以及畜主之间的接触都会造成病毒的传播，导致发病和带毒现象。流浪猫的带毒现象也十分普遍，流浪猫相互之间及彼此与食物间的接触，都会造成该病的发生。1岁以下年龄的猫均为易感群体，一般5-85日龄的猫最易发生感染，56-84日龄的猫发病居多，潜伏期为1-7d不等，发病后多数体温升高，可达39.5-40.5℃。引起的上呼吸道症状主要包括咳嗽、流涎、牙龈炎、眼周炎和口腔溃疡，严重时表现跛行、胃肠炎、肺炎等。发病和患病的动物为该病毒的主要传染源，病毒在干燥环境下可存活数周，在寒冷潮湿条件下，由于不同毒株其存活的时间也不同，高密度的圈舍饲养在一定程度上提高了健康动物的感染率。患病动物接触过的用具、笼舍、排出的废物和分泌物都可以直接或间接地传染给健康的猫科动物，导致传播的途径扩大。疫苗接种在一定程度上可以控制该病的蔓延，但不能消除；母源抗体在一定程度上也能控制易感动物的发病，但不是完全都是；而临床上更有一些不发病动物，它是病毒的携带者，不定期向外界排出病毒，引起健康动物感染或成为病毒的携带者。

疫苗接种是对该病的最好预防措施，由于FCV毒株抗原的易变异性，就意味着没有疫苗能中和所有的病毒分离株，因此降低了疫苗的免疫保护作用，甚至出现某些疫苗彻底失效的问题。目前，国外应用范围比较广的FCV疫苗是单价苗，例如F9、FCV-255、F4等都是最常见的单价苗抗原毒株。国内主要使用的是德国勃林格公司产的猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、猫泛白细胞减少症三联灭活疫苗，国产的猫疫苗，除了猫泛白细胞减少症疫苗外，基本是空白，急需国产猫疫苗的研制。灭活疫苗由完整的病毒组成，病毒灭活后，使其致病性丧失或减弱，但是仍然保持病毒的全部或部分免疫原性，接种后病毒抗原可以刺激机体产生免疫应答，达到保护作用。灭活疫苗中的病毒不具有感染性，在体内不能增殖，因此临床应用比较安全；保存方便，无需冻干保存；其它活病原体污染问题较少；生产相对简单。

发明内容

本发明的目的是提供猫嵌杯病毒CH-JL5株和猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗及其制备方法。

猫嵌杯病毒CH-JL5株，它的保藏编号为：CGMCC No.12547。

一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，它是将保藏编号为：CGMCC No.12547的猫嵌杯病毒CH-JL5株，经过灭活后制备的；

所述的灭活是采用甲醛灭活；

一种猫嵌杯病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将F81细胞培养在生长液中，当细胞生长至对数期时，在该细胞中接种FCV，控制温度35-37℃，将F81细胞单层吸附FCV 1-2h；

(2)细胞传代接毒剂量为0.1感染复数（MOI），将吸附了FCV的F81细胞置于细胞维持液中，静止培养；

(3)当上述F81细胞有80％以上出现病变时，盲传13代，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞病毒液；

(4)按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀，用无血清DMEM稀释至10^5.5TCID₅₀/0.1ml，加入体积分数为0.2％的甲醛并不断搅拌，置22℃恒温摇床中(120r/min)灭活48h以上；

(5)将上述步骤中得到的病毒液，按照2%的比例，加入氢氧化铝胶佐剂，充分混合均匀，得到FCV灭活苗。

本发明提供了猫嵌杯病毒CH-JL5株及由其制备的灭活疫苗。本发明所述灭活疫苗采用皮下注射，免疫接种操作方便。实验结果表明所述灭活疫苗不会引起FCV毒力增强或导致基因整合，也不会引起猫结膜炎、鼻炎、口腔溃疡或急性死亡，安全无副作用。此外，所述猫嵌杯病毒灭活疫苗能诱导猫产生良好的体液免疫和细胞免疫，采用FCV CH-SH株进行攻毒试验，免疫保护率为96%；采用FCV 2080株进行攻毒试验，免疫保护率为100%；采用FCVUSDA株进行攻毒试验，免疫保护率为100%。

附图说明

图1 FCV CH-JL5 在F81细胞上培养的结果；其中A为正常的F81细胞，B为被FCV感染的F81细胞；

图2 FCV CH-JL5的电镜检测结果；

图3 FCV CH-JL5 ORF2片段PCR结果（泳道M1为DL15000 Marker，泳道R为PCR产物，泳道M1为DL2000 Marker）；

图4 FCV CH-JL5 ORF2核苷酸的同源性分析；

图5 FCV CH-JL5 ORF2核苷酸的进化树分析；

图6 FCV CH-JL5 ORF2氨基酸的同源性分析；

图7 FCV CH-JL5 ORF2氨基酸的进化树分析。

具体实施方式

实施例1 猫嵌杯病毒CH-JL5株的分离和鉴定

一、猫嵌杯病毒CH-JL5株的分离

1、2013年5月，用口腔棉拭子采集吉林省临床疑似病猫的口腔唾液；

2、样品的处理：猫口腔棉拭子加500μL PBS缓冲液溶解5min，3000r/min离心10min，将棉拭子弃去，混匀分出250μL备用；

3、病毒的分离培养：样品3000r/min离心15min，取上清加入等量的DMEM营养液，用0.22μm滤器过滤除菌，接种F81单层细胞，置37℃5%CO₂培养箱中培养，盲传至第2代出现明显病变，传至第5代时细胞病变稳定，表现为细胞圆缩，呈葡萄串样，最后完全脱落。

二、猫嵌杯病毒CH-JL5株的鉴定

1、电镜观察:取出现明显病变的病毒培养物上清接种于长成单层的F81细胞，传代3次，细胞培养物3000r/min离心10min，取上清以0.5%的磷钨酸负染，电镜观察。发现病毒粒子呈球形，无囊膜，符合FCV的形态特征；

2、样品RNA的提取及反转录:参照RNA提取试剂盒的说明书提取上述制备液中的病毒RNA，再参照全式金北京生物技术有限公司的反转录试剂盒说明书进行反转录操作；

3、病毒RNA的提取及RT-PCR扩增参照RNA提取试剂盒提取总RNA，进行RT-PCR反应，引物序列为：

F:5´-CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA-3´，

R:5´-CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG-3´，PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸2min，进行30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，取2μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。所扩增的PCR片断大小为2100bp，与预期大小相符。克隆测序后获得全长2100nt的核苷酸序列，经分析ORF2的开放阅读框全长为2007nt；

4、目的基因克隆测序:RT-PCR扩增的目的片段纯化回收后与pMD18-T载体连接、转化至感受态细胞、筛选阳性克隆。将菌液PCR鉴定的阳性克隆菌液送往Invitrogen公司测序、拼接。应用DNAStar软件对其核苷酸序列进行分析、比较。将该分离株ORF2的核苷酸序列与GenBank中255株（妙三多<猫苗>，勃林格）等具有代表性参考毒株的同源性分析结果表明，该毒株与255株核酸同源性为76.7%，氨基酸同源性为85.6%，进化树分析结果表明，该毒株与255等疫苗株不处于同一分支，证明该毒株是FCV的一个新分离的变异株，命名为CH-JL5株。对CH-JL5株的全基因序列对比分析后发现，ORF1从20到5311，ORF2从5314到7320，ORF3从7317到7637，在3′非编码区44-73位上比其他分离株（HRB-SS、12Q087-1、12Q087-5除外）多了29个碱基。ORF2基因的核苷酸和氨基酸进化分析表明，FCV CH-JL5株单独位于一个分支上。结果见说明书附图1-7。

将分离的猫嵌杯病毒CH-JL5株送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为：CGMCC No.12547 ，分类命名是：猫嵌杯病毒Feline calicivirus；保藏时间：2016年6月1日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例2 猫嵌杯病毒灭活疫苗的制备方法

1、F81细胞复苏：从液氮罐中取出安瓿或冷冻管，迅速放入37℃水浴锅中，并不时摇动，在1-2min内使其完全融化；

2、F81细胞培养：在无菌条件下取出细胞，1000r/min速度下离心5min，弃去上层液，沿管壁加1ml 10%DMEM，不吹起细胞；再加入1ml 10% DMEM，吹匀细胞。将细胞液加入T25细胞培养瓶中，在细胞培养瓶中加入5-6ml 10% DMEM，轻轻混匀置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，每天观察2次；

3、FCV病毒扩增：采用感染复数（MOI）确定病毒接种量，将FCV分别稀释MOI为0.1、0.01、0.001后接种F81细胞，比较几个感染量的病毒滴度，发现当MOI为0.1时病毒滴度最高，病变时间也合适。最终以0.1MOI进行FCV细胞传代。用含8%新生牛血清的MEM培养液培养F81细胞，待细胞长成单层时，以0.1MOI将FCV接种到细胞瓶中，于37℃温箱中孵育1h，补液后将细胞瓶置于37℃温箱中继续培养，观察细胞病变；

4、FCV病毒的收获：当细胞病变达到80%以上时，收获细胞液，反复冻融3次，离心后分装冻存于-70℃冰箱中，用于后续滴度实验以及灭活疫苗；

5、病毒滴度测定：FCV CH-JL2株在P3时达到滴度高峰，P5后滴度略有下降，稳定在10^-9.8 TCID50/ml和10^-10.2 TCID₅₀/ml。将FCV CH-JL2株F5代病毒TCID₅₀用无血清DMEM稀释至10^5.5TCID₅₀/0.1mL；

6、FCV的灭活及灭活检验：加入体积分数为0.2％的甲醛并不断搅拌，置22℃恒温摇床中(120r/min)灭活48h以上。取灭活后的病毒500μl接种对数生长期的F81细胞，盲传2代，如无病毒生长，即为灭活彻底的FCV；

7、FCV灭活疫苗：取灭活彻底的FCV病毒液，按照2%的比例，加入氢氧化铝胶佐剂(哈药集团生物疫苗有限公司)，置4℃处理2d。然后进行无菌检验、安全检验及攻毒保护试验，全部合格者，即为FCV灭活苗。

实施例3、无菌检验及安全实验

抽取少量上述FCV灭活苗接种于葡萄糖蛋白胨汤(GP)、硫乙醇酸盐培养基(TG)、酪胨琼脂(GA)，按常规方法检测有无细菌生长。若无细菌生长，则在无菌室中按总量的万分之一加入硫柳汞钠，然后按每瓶10mL进行分装、加塞、封盖、贴签后置4℃冰箱保存备用。将15只45-60日龄实验猫随机分为3组，分别接种FPV灭活疫苗0.5ml、1ml、2ml，5只阴性对照猫不注苗，但与注苗猫同室饲养，注苗15d内逐日观察临床表现。

结果表明：制备的细胞培养灭活疫苗经细菌学检查，无任何细菌生长。接种该疫苗的15只猫及对照猫均没有明显的临床变化，食欲、精神、体温及排便正常。每组随机安乐处死2只，切开注射部位皮肤观察注射局部病理变化，接种部位皮下无异常，注射部位肌肉呈深褐色，玉米粒大小，与周围肌肉组织相区别，注射部位未见炎症反应。幼猫继续观察180d，发育良好。说明疫苗对不同年龄猫具有较好的安全性。

实施例4、FCV灭活疫苗免疫猫引发体液免疫反应

实验猫分组情况：试验前适应环境5d并采集咽拭子和结膜拭子，混合于无菌PBS中，4℃12000r/min离心5min。按照文献（Coyne K P等，2006）的方法，采用巢式RT-PCR方法检测实验猫携带FCV情况。引物序列见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，拟扩增核苷酸片段大小为467bp。按照Simply P总RNA提取试剂盒说明书（BioFlux公司）分别提取猫拭子RNA，反转录后进行巢式PCR扩增。同时，按照FCV间接ELISA试剂盒（Norgen公司）说明书方法检测猫FCV。将检测结果均为阴性的家猫随机分为实验组和对照组，每组10只，隔离饲养。

灭活疫苗的制备：将FCV CH-JL5株F5代病毒TCID₅₀用无血清DMEM稀释至10^5.5/0.1ml，加入体积分数为0.2％的甲醛并不断搅拌，置22℃恒温摇床中(120r/min)灭活48h以上。取灭活后的病毒500μl接种对数生长期的F81细胞，盲传2代，如无病毒生长，即为灭活彻底的FCV。取灭活彻底的FCV病毒液分别和氢氧化铝佐剂按2:98比例充分混合均匀，制备成FCV灭活苗。滴于烧杯水面上，静置5min，观察有无扩散现象。取乳化后的FCV灭活苗0.5ml于1.5ml离心管中，5000r/min离心5min，观察有无分层现象。既不扩散也不分层的疫苗，即为FCV灭活苗。

试验组猫分别皮下接种1.0mL相应灭活疫苗，对照组皮下接种等量F81细胞培养液，首免2周后进行二免。

IgG抗体测定：分别于免疫0 d，免疫后第7d、14d、21d静脉采血，分离血清，参照FCVELISA诊断试剂盒使用说明书，通过测定标记酶的OD₄₅₀值检测IGg抗体含量。结果见表2。

注：同列数据进行比较，a代表差异显著（P<0.05），A代表差异极显著（P<0.01）。

结果表明：免疫0d和7d实验组和对照组血清IgG水平差异均不显著（P>0.05）；免疫14d，实验组IgG水平显著高于对照组，差异显著（P<0.05）；免疫21d，实验组IgG水平显著高于对照组，差异极显著（P<0.01）。这表明本发明所述FCV灭活疫苗免疫后，可诱导猫机体产生较高的体液免疫反应。

实施例5、FCV灭活疫苗免疫猫引发的细胞免疫反应

1、T淋巴细胞增殖试验

分别于免疫0d，免疫后第7d、14d、21d静脉采抗凝血1ml，小心加到等体积淋巴细胞分离液上，2000 r/min，离心15min，吸取中间白色细胞层，无血清DMEM洗3次后，重悬在少量培养液中并计数。用PBS溶液将细胞数稀释至5.0×10⁶/ml, 用MTT法测定外周血淋巴细胞的增殖情况。向48孔板加入淋巴细胞，80μL/孔，再加入ConA，20μL/孔，每样作4个重复，于37℃、5%CO₂培养，在培养44h时，每孔加20μL MTT(5㎎/ml)，再继续培养4h。向各孔加100μL DMSO，振荡5 min，酶标仪读OD₅₇₀值。结果见表3。

注：同列数据进行比较，A代表与对照组差异极显著（P＜0.01）。

结果可知，免疫0d，免疫组协同ConA刺激外周血淋巴细胞增殖OD₅₇₀值显著高于对照组（P<0.01）；免疫7d，免疫组OD₅₇₀值显著高于对照组（P<0.05）,且差异显著；免疫21d，免疫组OD₅₇₀值显著高于对照组，且差异极显著（P＜0.01）。

2、CD4⁺和CD8⁺含量测定

分别于免疫0d，免疫后第7d、14d、21d静脉采血，首先准备1×10⁶-2×10⁶cell/ml，加入1μL anti-CD4-PE和1μL anti-CD3-FITC,4℃孵育30min，用cell-staining buffer洗涤2次，1500转，5min，200μLPBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，分选CD4⁺T细胞。检测CD8⁺时，用的是anti-CD8-PE，方法相同，结果见表4。

结果发现，免疫14d之后，外周血中的CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺百分含量明显增加。

3、IFN-γ含量测定

分别于免疫0d，免疫后第7d、14d、21d静脉采血，分离血清，按照IFN-γELISA诊断试剂盒说明书检测血清中IFN-γ含量，结果见表5。

注：a代表差异显著（P<0.05）。

结果表明，T淋巴细胞分泌的IFN-γ含量明显增加，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。

实施例6 保护率实验

1、疫苗

⑴供试疫苗：CH-JL5灭活苗，利用FCV CH-JL5株做抗原，按实施例2中的方法制备的疫苗；

⑵对照疫苗：由于市场上没有FCV灭活疫苗，分别利用FCV CH-JL1、CH-JL4、255株做抗原，按实施例2中的方法制备了灭活疫苗，即CH-JL1灭活苗、CH-JL4灭活苗、255株灭活苗。商品化疫苗选用“妙三多”猫疫苗（猫鼻气管炎、嵌杯病毒、泛白细胞减少症三联灭活疫苗），勃林格殷格翰动物保健（美国）有限公司。

⑶空白对照：为氢氧化铝胶。

2、试验方法

⑴利用FCV CH-SH株进行攻毒试验

FCV CH-SH株为从猎豹体内分离到的病毒，由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠。试验分为供试疫苗组、对照疫苗组和空白对照组，将180只45-60日龄的猫随机分成6组，每组30只，用本发明所述供试疫苗、对照疫苗和氢氧化铝胶分别于0d和14d进行2次免疫，每只背部肌肉注射1.0ml。二免后的第15d、30d、60d、120d、180d、240d分别用10^-9.8-10^-10.2 TCID₅₀/ml FCV CH-SH病毒进行攻击保护试验，每次用猫5只，均为滴鼻接种，每次1ml，每次攻毒后观察猫的发病情况，即体温是否升高（≥39.5℃），是否出现咳嗽、流涎、牙龈炎、眼周炎和口腔溃疡等，7d后利用巢式PCR对攻毒猫进行病毒检测，结果见表6。

实验结果表明，本发明所述FCV灭活疫苗对猫抗FCV CH-SH株的保护期为6个月，免疫保护率为96%，免疫保护率高于对照疫苗组；

注：分母为所检样品或攻毒总数，分子为阳性或发病数。

⑵利用FCV 2080株进行攻毒试验

FCV 2080株为标准株，由本实验室保存。试验分为供试疫苗组、对照疫苗组和空白对照组，将180只45-60日龄的猫随机分成6组，每组30只，用本发明所述供试疫苗、对照疫苗和氢氧化铝胶分别于0d和14d进行2次免疫，每只背部肌肉注射1.0ml。二免后的第15d、30d、60d、120d、180d、240d分别用10^-9.8-10^-10.2 TCID₅₀/ml FCV 2080病毒进行攻击保护试验，每次用猫5只，均为滴鼻接种，每次1ml病毒稀释液，每次攻毒后观察猫的发病情况，即体温是否升高（≥39.5℃），是否出现咳嗽、流涎、牙龈炎、眼周炎和口腔溃疡等，7d后利用巢式PCR对攻毒猫进行病毒检测，结果见表7。

实验结果表明，本发明所述FCV灭活疫苗对猫抗FCV2080株的保护期为6个月，免疫保护率为100%，免疫保护率高于对照疫苗组。

表 7 攻毒保护实验结果

注：分母为所检样品或攻毒总数，分子为阳性或发病数。

⑶利用FCV USDA株进行攻毒试验

试验分为供试疫苗组、对照疫苗组和空白对照组，将180只45-60日龄的猫随机分成6组，每组30只，用本发明所述供试疫苗、对照疫苗和氢氧化铝胶分别于0d和14d进行2次免疫，每只背部肌肉注射1.0ml。二免后的第15d、30d、60d、120d、180d、240d分别用10^-9.8-10^-10.2 TCID₅₀/ml FCV USDA病毒进行攻击保护试验，每次用猫5只，均为滴鼻接种，每次1ml病毒稀释液，每次攻毒后观察猫的发病情况，即体温是否升高（≥39.5℃），是否出现咳嗽、流涎、牙龈炎、眼周炎和口腔溃疡等，7d后利用巢式PCR对攻毒猫进行病毒检测，结果见表8。

实验结果表明，本发明所述FCV灭活疫苗对猫抗FCV USDA株的保护期为6个月，免疫保护率为100%，免疫保护率高于对照疫苗组。

表 8 攻毒保护实验结果

注：分母为所检样品或攻毒总数，分子为阳性或发病数。

综上所述，本发明所述FCV灭活疫苗对猫抗FCV CH-SH株的保护期为6个月，免疫保护率为96%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 长春西诺生物科技有限公司；吉林农业大学。

<120> 猫嵌杯病毒CH-JL5株灭活疫苗

<160> 1

<210> 1

<211> 1

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

atgtgctcaa cctgcgctaa cgtgcttaaa tactatgatt gggaccccca ctttaacctg 60

gtgatagacc caaataaatt tctttctgtg ggtttctgtg acaaacctct cttatgttgt 120

tatcctgaat tgcttcctga atttggcacc gtgtgggact gcaatcaatc cccacttcaa 180

atttacctgg agtcaatcct tggcgatgat gagtgggcac acacgcacga ggccattgac 240

cctgtcgtgc ctccaatgca ctggagtgct gctgggaaga tattccagcc gcatcctggt 300

gtattgatgc accacctcat tggccaagtt gcaaaaggct gggaccctaa tctgccacag 360

ttcagactgg aagcagatga tggttcagtc accgctcctg agcaaggtac ccctgttggg 420

ggagttattg ctgagccaag ttcacaaatg gctgcagctg ccgacatggc aactggaaaa 480

agtgttgact ctgagtggga agcattcttc tctttccata ctagtgttaa ttggagcaca 540

tctgaaaccc aagggaagat tcttttcaaa caatctttgg gacccctact aaatccttat 600

cttgaacacc tctcaaaact atatgttgct tggtctggct ctgttgatgt taggttttct 660

atctctggat ctggtgtttt tgggggaaag cttgcggcaa ttgtagtgcc accaggaatt 720

gatcctgtgc agagtacttc aatgttgcaa taccctcatg ttctatttga tgcccgtcaa 780

gtagaacctg taatcttttc tatccctgac cttaggagta cactttacca cctaatggct 840

gacacagata ctacatcttt agtgattatg gtttataatg atttgattaa cccctatgct 900

aatgattcta attcctcggg atgtattgtg gccgtagaaa ctaaacctgg acccgatttc 960

agattccacc tcttgaaacc accagggtct atgctcacac atggttctgt cccttctgac 1020

ctaattccca agtcctcttc tctatggatt ggaaaccgcc actggactga cattacagaa 1080

tttgtaattc gaccatttgt cttccaggcc aaccgccatt ttgatttcaa ccaggaaacg 1140

gctggctgga gcactcccag attccgaccc atgactgtaa ctgtaagtca gaaaaatggg 1200

gagaaattag gtattggagt ggccactgac tacattgtac ctggaattcc tgatggatgg 1260

ccggacacaa caataccaga ggaattgacg ccggctggtg attatgccat tacatcttca 1320

aacggtaatg acattacaac actagctgac tacaattccg cggacgtcat caagaataac 1380

accaatttca gggggatgta catctgtgga tcactccaac gtgcttgggg tgacaagaaa 1440

atttcaaaca ctgctttcat tacaattggc gatgttgaag gaagtaaaat caaacccagc 1500

agtgtgatta gtcaggctaa gattgcaatt ttccaagaca accacgtcaa ccacgacgtt 1560

cagacatctg atattacata tgctcttctt ggatacactg gaattggtga ggaggctatt 1620

ggtgctacta gggaccgtgt ggctcgaatt agcatccttc ctgaaactgg tgcccgtggc 1680

ggcaatcacc caatcttcta taaaaattca atgaagcttg gttatgtaat taaatctatt 1740

gatgtcttta attctcaaat cttacacact tcaagacaac tatctctcaa taactatctg 1800

ttagctcctg attcttttgc tgtttatcgt atcactgatt caaatggttc atggtttgac 1860

ataggtattg atcatgatgg attttctttt gttggtgtgt ctaatatacc taagttggtg 1920

tttccactta cttcctccta catgggaatt caattggcaa aaattcgcct tgcctctaac 1980

attaggagta tgatgactaa aatatga 2007

Claims (4)

1.猫嵌杯病毒CH-JL5株，其特征在于：它的保藏编号为：CGMCC No.12547。

2.一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，其特征在于：它是将保藏编号为：CGMCC No.12547的猫嵌杯病毒CH-JL5株，经过灭活后制备的。

3.根据权利要求2所述的一种猫嵌杯病毒灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活是采用甲醛灭活。

4.一种猫嵌杯病毒灭活疫苗的制备方法，它包括以下步骤：

1)将F81细胞培养在生长液中，当细胞生长至对数期时，在该细胞中接种FCV，控制温度35-37℃，将F81细胞单层吸附FCV 1-2h；

2)细胞传代接毒剂量为0.1感染复数，将吸附了FCV的F81细胞置于细胞维持液中，静止培养；

3)当上述F81细胞有80％以上出现病变时，盲传13代，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞病毒液；

4)按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀，用无血清DMEM稀释至10^5.5TCID₅₀/0.1ml；加入体积分数为0.2％的甲醛并不断搅拌，置22℃恒温摇床中120r/min灭活48h以上；

5)将上述步骤中得到的毒液，按照2%的比例，加入氢氧化铝胶佐剂，充分混合均匀，得到FCV灭活苗。