KR20150074714A - 돼지유행성 설사 바이러스의 전장 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지유행성 설사 바이러스의 전장 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론에 관한 것이다. 본 발명에 따른 감염성 클론은 병원성 기전 해석, 바이러스 단백질의 기능연구 및 바이러스-숙주 상호작용 등을 포함한 기초 연구뿐 아니라 바이러스 벡터 및 유전자 재조합 차세대 백신 개발을 포함한 응용 연구에 활용될 수 있다.

Description

돼지유행성 설사 바이러스의 전장 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론{Infectious clone comprising full-length nucleotide of porcine epidemic diarrhea virus}

본 발명은 돼지유행성 설사 바이러스의 전장 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론에 관한 것이다.

돼지유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PED virus)는 자돈에서 급성 장염과 수양성 설사를 유발하며 특히 어린 자돈에 있어서는 폐사율이 100%에 달하는 돼지 바이러스성 원인체이다. 현재 국내에서는 이 바이러스성 질병이 전국적으로 발생 보고되고 있으며 매년 국내 양돈 산업에 막대한 경제적 피해를 주고 있는 실정이다. PED 바이러스는 코로나 바이러스과 (Coronaviridae family)에 속하며, 최근에는 돼지 생식기호흡기증후군 (porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)의 원인체인 PRRS 바이러스가 속한 Arteriviridae 과와 함께 Nidovirales 속 (order)으로 분류하고 있다. PED 바이러스는 외피를 가진 단일 가닥, 양성 (positive)-센스 RNA 바이러스로서, 약 28kb 정도 크기의 유전자를 포함하고 있다. PED 바이러스 유전자는 5' 비번역부위(UTR), 적어도 7개의 오픈ORF (open reading frame), 3' UTR 및 폴리-A 꼬리 (tail)로 구성되어 있다. 바이러스 유전자의 약 2/3는 두 개의 ORF la와 lb가 차지하고 있으며, 여기에는 바이러스 유전자의 복제와 전사에 관여하는 비구조적 단백질들(nonstructural proteins; NSP)이 코딩되어 있다. 나머지 ORF 2 내지 ORF 6은 S (spike), G (glycoprotein), O (ORF3), E (envelope), M (membrane) 및 N (nucleocapsid) 단백질들을 코딩하고 있다.

현재 PED는 한국을 비롯한 아시아 지역에서 발병 보고되어 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 입히고 있는 실정이었으나 2013년 미국에서 최초로 PED가 발생하여 자돈인 경우 100 %에 달하는 폐사율을 보이며 20개 주 이상의 양돈 농가를 휩쓸며 경제적으로 타격을 입히고 있다. 하지만 이런 치명적인 질병을 유발하는 병원체로써 PED 바이러스에 대한 연구는 다른 코로나 바이러스에 대한 연구 성과와 비교하였을 때 전 세계적으로 미미한 실정이다. 현재 PED 바이러스에 대한 병원성, 숙주세포와의 상호작용 및 각 구조 단백질의 기능학적 역할을 포함한 바이러스의 분자 생물학적 정보가 불충분한 상태이다. 이에 반해 2003년 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 일명 사스 코로나 바이러스(SARS-CoV)의 발생을 기점으로 코로나바이러스에 대한 연구가 전 세계적으로 다양하게 진행되고 있다. 특히, SARS에 대한 치료제 및 백신 개발에 박차를 가하고 있는 실정이다. 따라서 PED 바이러스는 질병 예방을 위해 전염병 원인체로서 뿐만 아니라, 사스 코로나 바이러스 및 최근 발생한 중동호흡기 코라나 바이러스 (Middle East Respiratory syndrome Coronavirus; MERS-CoV)를 비롯한 인체 코로나 바이러스(human coronavirus)를 연구하는데 있어서, 동물 바이러스 모델로 관심 깊게 연구가 필요한 바이러스 중에 하나이다. 따라서 최근 연구 동향 및 최신 기법을 PED 바이러스의 연구에 접목시킨다면 국내에서는 물론이고 국외에서도 연구 경쟁력이 있을 것으로 판단된다. 현재 국내에서도 PED 바이러스에 대한 연구가 계속 수행되어 오고 있지만 대부분이 바이러스 감염에 대한 병리학적 및 면역학적 반응, 유전학적 분석 및 진단법 개발 등에 대하여 초점이 맞춰져 왔다. 현재까지 발표된 연구들은 PED 바이러스의 분자 기능학적 특성과 바이러스의 병원성 기전을 이해하기에 부족한 실정이다. 최근 바이러스학 연구들을 보면 역유전학 기법 구축 및 이 기술을 적용한 바이러스의 생 주기 (life cycle) 해독을 위한 연구들이 활발하게 진행되어지고 있다. 현재까지 SARS-CoV를 포함한 여러 코로나 바이러스들의 역유전학 기법들이 구축되어왔지만 PED 바이러스를 이용한 역유전학 시스템은 개발되어 있지 않은 실정이다. 따라서 PED 바이러스에 대한 전체염기서열 분석을 포함한 역유전학 기법의 구축 및 그 파생 연구가 시급한 상황이다. 상기 기법의 구축 및 이를 활용한 연구 결과들은 PED 바이러스 연구를 한층 향상시킬 수 있으며, 향후 바이러스에 대한 분자 기능학적 해독의 시간을 단축시킬 것으로 판단된다.

이에 본 발명의 발명자들은 돼지유행성 설사 바이러스에 대한 국내 백신주인 SM98P의 전장 cDNA 서열을 결정하였으며, 이를 이용하여 감염성 클론을 제조합함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus)의 게놈 RNA에 대해 상보적인 DNA (cDNA)의 전장 뉴클레오티드를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 감염성 클론에 이종 뉴클레오티드가 포함된 재조합 벡터를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공함에 있다.

본 발명은 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus)의 게놈 RNA에 대해 상보적인 DNA (cDNA)의 전장 뉴클레오티드 및 이를 포함하는 감염성 클론을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 전장 뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 한다.

상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열은 돼지유행성 설사 바이러스의 백신주인 SM98P 주의 전장 cDNA 서열로서, 상기 전장 cDNA 서열은 돼지유행성 설사 바이러스의 표준주인 CV777 주와 염기서열 상동성이 99.4 %이고, 아미노산 상동성이 99.1 %이다.

또한, 상기 서열의 전장 길이는 27,994 nt로 CV777 주보다 39개 서열이 더 짧고, 총 24개의 뉴클레오타이드 삽입(insertion), 63개의 결실(deletion) 및 68개가 치환(substitution)을 되었으며, 아미노산 서열의 8개의 삽입, 20개의 결실 및 45개의 치환되었다.

또한, CV777 주의 염기서열과 비교하여, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 중 스파이크 단백질 (spike protein)을 코딩하는 ORF (open reading frame)의 N-말단 부분 및 M 단백질을 코딩하는 ORF에서 총 12 nt의 뉴클레오타이드 삽입되었고, 5'UTR에서 5 nt, ORF1a에서 3 nt가 결실되었고, 스파이크 단백질의 ORF의 C-말단 및 ORF3의 개시부위를 포함한 N-말단 범위의 52 nt가 결실되었다. 또한, CV777 주의 아미노산 서열과 비교하여, 본 발명의 서열이 코딩하는 아미노산 서열의 스파이크 단백질의 N-말단과 M 단백질 내 4개의 아미노산이 삽입되었고, ORF1a 내 두 위치에서 각각 한 개의 아미노산 서열의 결실 및 스파이크 단백질 말단에서 7개, ORF3의 개시부분부터 11개의 아미노산 서열의 결실이 있다.

또한, CV777 주와 비교하여, 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 치환은 총 68개이며, 이 중 2곳은 UTR 부위에 존재하고, 45개의 위치에서 아미노산이 치환되었으며, 11곳에서의 아미노산 서열의 치환은 없다.

본 발명의 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론은, 상기 뉴클레오티드 서열의 5` 말단에 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 발현 프로모터; cDNA의 전장 뉴클레오티드 서열의 3` 말단에 리소자임 절단 부위 (lysozyme cleavage site), 소의 성장 호르몬의 종결자 및 폴리 아데닐화 부위가 위치하는 것을 특징으로 하고, 상기 감염성 클론은 세균 인공 염색체 (BAC) 내에서 클로닝되는 것을 특징으로 하다.

본 발명의 "세균 인공 염색체"는 F 인자의 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 소위 F 플라스미드라고 불리는 서열을 함유하는 플라스미드는 300 kb 이상의 길이를 가진 이종 서열을 낮은 카피 개수로 안정하게 유지할 수 있다. 각각의 BAC는 당업계에 잘 알려져 있고 (Shizuya et al., 1992), 본 발명에서 BAC은 pBelo-BACII임이 바람직하다.

또한, 본 발명은 감염성 클론에 이종 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 돼지유행성 설사 바이러스의 전장 서열에서 유래된 것이 아니라면, "이종 뉴클레오티드 서열"로서 정의할 수 있다. 따라서, "이종 뉴클레오티드" 서열은 관심의 대상이 되는 임의의 유전자일 수 있고, 본 발명의 클론 내로 삽입될 수 있다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은 임의의 감염물질에서 유래된 항원으로서 인식되는 하나 또는 여러 개의 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있고, 임의의 감염물질에 대한 보호를 제공하는 항체 또는 감염물질의 복제를 저해하는 하나 이상의 분자를 코딩하는 이종 뉴클레오티드일 수 있고, 구체적인 예로, 면역조절제, 사이토킨, 면역증강제 및/또는 항염증성 화합물을 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 돼지유행성 설사 바이러스의 ORF3 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 이종 뉴클레오티드는 역유전학적 기법으로 사용하기 위한 표지 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드일 수 있고, 바람직하게는 형광단백질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 녹색 형광 단백질일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어로서 "보호를 제공하는"은 세포성 반응을 증강시키는 물질(인터루킨, 인터페론 등), 세포 괴사 인자 및 감염물질에 의해 유발되는 감염으로부터 동물을 보호하는 유사한 물질에 의해 유도되는 것과 같은 적당한 메커니즘에 의해 본 발명의 벡터에 의해 일어난 면역 반응일 수 있다.

본 발명에서 "동물"이라는 용어에 포함되는 것은 임의의 종의 모든 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유류이다.

본 발명의 "감염물질(infectious agent)"은 임의의 바이러스, 세균, 진균, 기생충 또는 동물을 감염시킬 수 있고 이것이 병을 일으킬 수 있는 기타 감염물질을 포함한다.

본 발명은 상기 벡터를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 백신 조성물 내의 벡터는 하나 이상의 감염물질에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 하나 이상의 항원을 발현할 수 있고, 하나 이상의 감염물질에 대하여 보호를 제공하는 하나 이상의 항체를 발현할 수 있고, 1가 또는 다가일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상이한 인간, 돼지, 개 및 고양이 감염물질에 대하여 인간, 돼지, 개 및 고양이를 보호할 수 있는 1가 백신이 제공될 수 있으며, 돼지에 대한 감염물질에 대한 1가 백신은 본질적으로 하기 돼지 병원균의 항원을 발현하는 벡터를 포함한다. 상기 돼지 병원균은 바실러스 플레우로뉴모니아, 악티노바실러스 수이스, 헤모필러스 파라수이스, 포킨 파르보바이러스, 렙토스피라, 에스케리키아 콜리, 에리시펠로트릭스 루시오파티아, 파스테우렐라 물토키다, 보르데텔라 브론키셉티카, 세르풀리나 하이디오센테리아, 마이코플라스마 하이오뉴모니아, 돼지유행성 설사 바이러스(PEDV), 돼지의 호흡기 코르나바이러스, 로타바이러스, 또는 돼지의 호흡기 및 생식기 증후군, 오제스키(Aujeszky) 질병(슈도라비스), 돼지 인플루엔자, 또는 전염성 위장염을 일으키는 병원균을 포함한다. 바람직하게는 상기 항원은 돼지유행성 설사 바이러스의 ORF3 단백질일 수 있다.

또한, 개의 감염물질에 대한 1가 백신은 하기 개 병원균의 항원을 발현하는 발현 벡터를 포함할 수 있다 상기 개 병원균은 개 헤르페스 바이러스, 제1형 및 제2형 개 아데노바이러스, 제1형 및 제2형 개 코로나바이러스, 개 파라인플루엔자 바이러스, 개 인플루엔자 바이러스, 디스템(distemper) 바이러스, 공수병 바이러스, 레트로바이러스 및 개 칼리시바이러스를 포함한다.

또한, 고양이의 감염물질에 대한 1가 백신은 하기 고양이 병원균의 항원을 발현하는 벡터를 포함할 수 있다. 상기 고양이의 병원균은 고양이 칼리시바이러스, 고양이 면역결핍증 바이러스, 고양이 헤르페스 바이러스, 고양이 판류코페니아(panleukopenia) 바이러스, 고양이 레오바이러스, 고양이 로타바이러스, 고양이 코로나바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 공수병 바이러스, 고양이 클라미디아 시티아키(Chlamydia psittaci) 및 고양이 백혈병 바이러스를 포함한다.

본 발명의 벡터는 감염물질, 예를 들어 전술한 바와 같은 돼지의, 개의 또는 고양이의 감염물질에 대한 보호를 제공하는 항체를 발현할 수 있다. 특정 실시예에 있어서, 벡터는 재조합 모노클로날 항체 또는 인간 및 돼지 로타바이러스에 대한 중화 항체를 발현할 수 있다. 상기 모노클로날 항체는 이소형태의 IgG1 또는 IgA(여기서, 면역글로불린의 불변부는 돼지 기원임)로 발현된다.

본 발명의 백신 조성물은 부형제로서, 생리학적 식염수 또는 기타 유사한 염수 용액과 같은 희석제가 사용될 수 있다. 또한, 이들 백신은 알루미늄 히드록사이드, 쿠일A, 알루미나겔의 현탁액 등과 같은 수성 백신 및 미네랄 오일, 글리세라이드, 지방산 유도체 및 이들의 화합물과 같은 유성 백신의 제제 중에 통상적으로 사용되는 것들로부터의 아쥬반트를 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 세포 응답-증강(CRP) 물질, 즉 헬퍼 T 세포(Th2)의 하위군, 예를 들어 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, 감마-IFN(감마-인터페론), 세포 괴사 인자, 및 백신화된 동물에서 이론적으로 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있는 유사한 물질을 증강시키는 물질이다. 이들 물질은 수성 또는 유성 아쥬반트와 함께 백신 조성물 중에 사용될 수 있다. 세포성 반응을 면역하거나 조절하는 다른 유형의 아쥬반트, 예를 들어 MDP(뮤라밀 디펩티드), ISCOM(면역자극제 복합체) 또는 리포좀이 사용될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 동물에게 경구적으로, 비강 내로, 피하 내로, 경피 내로, 복강 내로, 근육 내로, 또는 에어로졸로 투여될 수 있다.

본 발명은 하나 또는 다양한 감염물질에 대항하여 동물, 특히 돼지, 개 및 고양이를 면역화하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 본 발명에 의해 제공된 재조합 시스템의 면역학적으로 유효한 양을 함유하는 백신을 경구적으로, 비강 내로, 피하 내로, 경피 내로, 복강 내로, 근육 내로 또는 에어로졸로 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 동물을 감염시키는 감염물질에 대하여 신생아 동물을 보호하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 임신 기간 전에 또는 임신 기간 동안 모태에 또는 이들의 자손에게 본 발명에 따라 제공된 것의 백신을 경구, 비강, 피하, 피내, 복강내, 근육내 또는 에어로졸 투여(또는 이들의 조합 투여)하는 것으로 이루어진다.

본 발명에 따른 감염성 클론은 병원성 기전 해석, 바이러스 단백질의 기능연구 및 바이러스-숙주 상호작용 등을 포함한 기초 연구뿐 아니라 바이러스 벡터 및 유전자 재조합 차세대 백신 개발을 포함한 응용 연구에 활용될 수 있다.

도 1은 돼지유행성 설사 바이러스 백신주인 SM98P와 표준주인 CV777 주 사이의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 차이점을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 돼지유행성 설사 바이러스의 감염성 클론 제조의 개략도를 나타낸 도이다 (CMV: 사이토메갈로 바이러스의 프로모터; Rz: 리보자임 절단 부위; BGH (소의 성장 호르몬 종결자); BGH (폴리아데닐화 부위))
도 3은 본 발명의 감염성 클론의 7개 유전자 영역 (도 3의 A), PED 전장 cDNA 서열 및 벡터(도 3의 B)를 전기영동한 결과이다.
도 4는 본 발명의 감염성 클론을 베로 세포에 형질도입 후, 면역염색법 또는 RT-PCR을 통하여 감염성 여부를 확인한 도이다. (도 4의 A: PEDV의 N 단백질의 특이적 단일 항체를 이용하여 면역염색법을 수행한 결과; 도 4의 B: 감염성 클론에 SacII를 처리한 후, 전기영동한 결과)
도 5는 본 발명의 감염성 클론에 GFP 단백질을 삽입한 후, GFP 단백질 발현을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] PED ( porcine epidemic diarrhea virus ) 바이러스 전체 유전자를 포함하는 cDNA 클론 구축 및 염기서열 분석

PED 바이러스 전체 유전자 서열 분석 및 cDNA 클론 구축을 위하여, PED 바이러스의 7개 유전자에서 중첩 (overlapping) 영역을 나누어 증폭하였다. 우선, PED 바이러스 원형 균주 (prototype strain)인 CV777의 전체염기서열(Accession no. AF353511)을 바탕으로 약 28kb 바이러스 전체 유전자를 포함하는 7개의 중첩 (overlapping)된 cDNA 조각들을 증폭하기 위하여, 특이적인 제한효소 부위를 포함하는 표 1의 유전자-특이적 프라이머 세트 (gene-specific primer set)를 제작하였다. PED 바이러스 감염성 클론 (infectious clone)의 기본 균주 (parental strain)로 PED 바이러스 국내 백신주인 SM98P를 선택하였고, 베로(Vero) 세포에서 플라크 분리 (plaque purification)를 통하여 바이러스를 획득한 후, 다시 베로 세포에서 2회 계대를 하였다. 스톡 (stock)에서 상기 바이러스의 RNA (viral RNA)를 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 추출하였고, 상기 추출된 바이러스 RNA를 주형으로 7개의 PEDV cDNA를 역전사 효소 (Expanded Reverse Transcriptase; Roche)를 이용하여 합성하였다. 이들 각각의 cDNA를 DNA 중합효소 (KOD XL DNA polymerase; Novagen)를 이용하여 PED 바이러스 전체 유전자를 포함하는 7개의 중첩 유전자 단편에 대하여 PCR을 수행하였다. 이 후, 각각의 PCR 산물을 TOPO XL PCR cloning Kit (Invitrogen)을 이용하여 T/A 클로닝을 실시하였다. TOPO XL 플라스미드에 존재하는 벡터-특이적 프라이머 (vector-specific primer)로 각각의 클론들의 삽입 여부를 확인하였다. 이 후, PEDV 유전자 특이 프라이머를 제작하여 각각의 cDNA의 단편들의 염기서열 분석을 통해 PEDV 전체길이 유전자의 염기서열을 완성하였다. 이의 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 이 후, 기존에 확인된 PED 바이러스 원형 균주인 CV777과 전체 염기서열을 비교 분석하여 유전학적 특성을 규명하였다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.

Primer name	Nucleotide sequences (5'-3')
PEDV-1F-PacI-1-Fwd	TTAATTAAACTTAAAAAGATTTTCTATCTACGG
PEDV-1F-MluI-6812-Rev	ACGCGTGTAACGATGAAAAAGACGACG
PEDV-2F-MluI-6812-Fwd	ACGCGTATTGATGTTCATTAAGCATGTTTGCC
PEDV-2F-AvrII-9506-Rev	CCTAGGAAAACATTCCCAGATGAAATGGAG
PEDV-3F-AvrII-9506-Fwd	CCTAGGTGTTGTGAGTGCAACTATGCGAGGTGC
PEDV-3F-AvrII-16889-Rev	CCTAGGATTTTTAGCCAAAAACATACGCACAACATCC
PEDV-4F-AvrII-16889-Fwd	CCTAGGTGGTCAAAGGCTGTTTTCATTTCCCC
PEDV-4F-SgfI-20640-Rev	GCGATCGCATTTGTTTACGTTGACCAAATGATTAG
PEDV-5F-SgfI-20640-Fwd	GCGATCGCTAATTTACTTCTGGTTGCTC
PEDV-5F-SacII-25307-Rev	CCGCGGATAGCTAGATACAAGTCAATGTTACTAACG
PEDV-6F-SacII-25307-Fwd	CCGCGGGCGGCAAGAAGCTGACCTAC
PEDV-6F-AsuII-27181-Rev	TTCGAAGTGGCCCTGGATTTGTTCTTCTTAGG
PEDV-7F-AsuII-27181-Fwd	TTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCC
PEDV-7F-pA-28033-Rev	GCGCGCTCCGGAT(30)GTGTATCCATATCAACACCGTCAGG

도 1에 나타난 바와 같이, 국내 PED 바이러스 분리주인 SM98P와 CV777의 염기서열 및 아미노산 서열의 상동성은 각각 99.4%, 99.1% 임을 확인하였다. SM98P의 전체 염기서열 길이는 27,994 뉴클레오티드(nt)이고, CV777의 전체 염기서열 길이는 28,033 nt 이므로, 39 nt가 더 짧은 것으로 확인하였다. 총 24개의 뉴클레오타이드 삽입(insertion)과 63개의 결실(deletion), 68개의 치환(substitution)을 확인하였고, 아미노산 수준에서도 아미노산 서열의 8개의 삽입, 20개의 결실 및 45개의 치환을 확인하였다. 보다 구체적으로, 스파이크 단백질 (spike protein)을 코딩하는 ORF (open reading frame)의 N-말단 쪽 부분과 M 단백질을 코딩하는 ORF에서 총 12 nt의 뉴클레오타이드 삽입을 확인하였으며, 5'UTR에서 5 nt, ORF1a에서 3 nt가 결실되었음을 확인하여 상기 두 위치에서 결실을 확인하였다. 또한, 가장 특징적으로 스파이크 단백질의 ORF의 C-말단과 ORF3의 개시부위를 포함한 N-말단 범위의 52 nt가 결실되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 ORF3 단백질의 바이러스 감염성에는 필수적인 것이 아님을 나타낸다.

아미노산 수준에서는 스파이크 단백질의 N-말단과 M 단백질 내에서 4개의 아미노산이 삽입되었고, ORF1a에서 1개씩의 두 위치에서의 결실과 스파이크 단백질 말단의 7개, ORF3의 개시부분부터 11개의 결실을 확인하였다.

또한 염기서열의 치환은 총 68개에서 확인되었으며 이중 2곳은 UTR 부위에 존재하며 45개의 위치에서 아미노산이 치환되었으며, 11곳에서의 아미노산의 치환은 확인되지 않았다.

[ 실시예 2] PED 바이러스의 전체 서열을 포함하는 감염성 클론의 제조

PED 바이러스의 전체 서열을 포함하는 감염성 클론을 제조하기 위하여, 국내 PED 바이러스 분리주인 SM98P를 주형으로 표 1의 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 총 7개의 조각을 생성하였다(도 3의 (A) 참조). 각각의 cDNA는 Prime script 1^st strand cDNA synthesis kit(Takara)를 이용하여 합성하였으며, KOD XL DNA polymerase(novagen)를 이용하여 PCR 조각을 생성하였다. PCR 조건은 제조사의 메뉴얼에 따랐으며, 각각의 프라이머 세트의 용해 온도에 따라 어닐링 온도를 조정하였다. 각각의 조각의 5' 말단과 3' 말단에 제한효소 사이트를 추가하여 발현 벡터인 pBelo BAC II에 순차적으로 클로닝을 수행하였다. pBelo BAC II 는 BAC (bacterial artificial chromosome system)를 이용하는 벡터로서 PED 바이러스의 전체 서열의 cDNA의 클로닝 이 후, 숙주 동물세포에서 원활한 플라스미드 형질도입 및 전사를 위하여, 링커 DNA를 이용하여 제한효소 사이트를 삽입하고 5' 말단에 진핵세포의 CMV 프로모터 (eukaryotic CMV promoter), 3' 말단에 리소자임절단 부위 (lysozyme cleavage site) 및 소의 성장 호르몬의 종결자 (bovine growth hormone terminator)를 부착하였다. PED 바이러스 전체 유전자에 존재하는 효소 사이트를 선별하여 제한효소를 선택하였고, Sgf I 및 Sac II는 침묵 돌연변이가 있는 염기서열로 치환하여 유전적 마커로서 이용할 수 있게 하였다. 각각의 PCR 조각은 TOPO XL PCR cloning kit를 이용하여 TA-클로닝 후 서열분석을 수행하였고 변형된 pBelo-BACII 에 서브클로닝하여 단일 클론을 구축하였다(도 2 참조). 상기 구축된 단일 클론의 플라스미드를 Large construct kit(Qiuagen)를 이용하여 추출한 후, Pac I과 Aus II 제한효소를 이용하여 28kb 의 전장 PED 바이러스의 게놈 cDNA 및 9kb의 벡터 DNA로 분리된 밴드를 확인하였다(도 3의 B 참조). 전기영동은 0.7% 아가로오즈 겔을 이용하여 50V로 4시간 로딩하였으며 로딩 마커는 Lambda Mix Marker(Fermentas)를 이용하였다. 본 발명의 PED 바이러스 전장 cDNA 클론의 구조를 도 2에 나타내었고, 본 발명의 cDNA 클론의 7개 유전자 영역 (도 3의 A), PED 전장 cDNA 및 벡터 (도 3의 B)를 전기영동한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 감염성 PED 바이러스의 전장 cDNA 클론을 제조하였음을 확인하였다.

[ 실시예 3] PED 바이러스 전체 길이 cDNA 클론의 감염성 확인.

1. 면역염색법을 이용한 PED 바이러스 cDNA 클론의 감염성 확인

상기 실시예 2에서 제조된 PED 바이러스 전체 길이 클론이 실제로 표적 세포에서 감염성이 있는지를 확인하기 위하여, PED 바이러스의 감수성 세포주인 베로 세포에 플라스미드를 리포펙타민 (lipofectamine 2000)을 이용하여 형질도입을 수행하였다. 형질도입 후, 상층액을 3번의 블라인드 계대 (blind passage)를 거친 후, 베로 세포에서 PEDV의 N 단백질의 특이적 단일 항체를 이용하여 면역염색법을 수행하였다. 이의 결과를 도 4의 A에 나타내었다.

도 4의 A에 나타난 바와 같이, PED 바이러스의 N 단백질의 발현을 확인하여 클론된 바이러스의 복제를 확인하였다.

2. RT - PCR 을 이용한 PED 바이러스 cDNA 클론의 감염성 확인

감염성 바이러스가 부모 바이러스 (parental virus) 유래가 아닌 본 발명의 실시예 2의 cDNA 클론임을 확인하기 위하여, 유전적 마커를 이용하였다. 부모 바이러스와 클론된 바이러스를 계대하여 접종한 후, 바이러스 RNA를 각각의 감염된 세포의 상층액에서 QIAmp viral RNA mini kit (Qiuagen) 통해 추출하여 DNase I 처리한 후, 이를 이용하여 RT-PCR을 통해, 1,037 bp의 PCR 조각을 증폭하였다. 각각의 PCR 산물을 SacII를 처리한 후, 전기영동하여 이의 결과를 도 4의 B에 나타내었다.

도 4의 B에 나타난 바와 같이, 유전적 마커의 PCR 증폭산물 만이 Sac II에 의해 분해됨을 확인하여 실제 cDNA 클론에서 회복된 클론된 바이러스임을 확인하였으며 구축되어진 PED 바이러스 전체길이 cDNA 클론이 감염성이 존재함을 확인하였다.

[ 실시예 4] 외래 GFP 단백질 발현 재조합 클론 및 바이러스의 감염성 확인

실시예 2의 PED 바이러스 감염성 cDNA 클론을 이용한 역 유전학 기법이 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 효과적인 바이러스 벡터로서 가능성을 제시하기 위하여, GFP 단백질 유전자 발현을 유도하는 재조합 변이 클론을 제작하였다. 이를 위해 세포 적응주인 SM98P의 결손된 ORF3 부위에 GFP 유전자가 삽입된 클론(pBelo BACII-PEDV-GFP)을 제조하였고, 이를 베로 세포주에 형질도입하여 GFP를 발현하는 바이러스의 감염성을 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 상기 제조된 PED 바이러스 역유전학 기법은 향후 다른 바이러스 유래 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터뿐만 아니라 재조합 백신 개발에도 효과적으로 활용될 것으로 판단된다.

[ 실시예 5] 야외 바이러스 유래 ORF3 단백질을 발현하는 재조합 클론의 제조.

실시예 1에서 SM98P 바이러스 전체 염기서열 분석 결과 ORF3 부위의 결손을 확인하였다. 그러나, 야외 바이러스에서는 상기 ORF3 부위가 완전하게 보존되어 있는 것으로 염기서열 분석 결과 확인되었으며, ORF3 단백질이 PED 바이러스의 병원성에 관련이 있을 것으로 판단되었다. 상기 가설을 확인하기 위하여, 결손된 ORF3 유전자 부위를 복구하였다. 보다 구체적으로, 야외 바이러스에서 유래된 ORF3 유전자를 역유전학 기법을 이용하여 구축되어진 PED 바이러스 감염성 cDNA 클론에 도입하여 야생형 ORF3 발현 재조합 클론을 제작하였다. 상기, ORF3가 복구된 재조합 클론의 감염성 및 증식성을 in vitro 상에서 표적 세포주인 베로세포에서 증식을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Infectious clone comprising full-length nucleotide of porcine epidemic diarrhea virus <130> p-123 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> It is a SM98 clone`s full DNA sequence <400> 1 ggatccttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 60 tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 120 accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 180 aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc 240 agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 300 gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 360 ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 420 tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 480 tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 540 gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 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gatgcggtgg gctctatgaa gctt 28944

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 돼지 유행성 설사 바이러스 (porcine epidemic diarrhea virus)의 게놈 RNA에 대해 상보적인 DNA (cDNA)의 전장 뉴클레오티드.
2. 제 1항의 뉴클레오티드를 포함하는 감염성 클론.
3. 제 2항에 있어서, 상기 감염성 클론은 뉴클레오티드 서열의 5` 말단에 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 발현 프로모터; cDNA의 전장 뉴클레오티드 서열의 3` 말단에 리소자임 절단 부위 (lysozyme cleavage site), 소의 성장 호르몬의 종결자 및 폴리 아데닐화 부위가 위치하는 것을 특징으로 하는, 감염성 클론.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 감염성 클론은 세균 인공 염색체 (BAC) 내에서 클로닝되는 것을 특징으로 하는, 감염성 클론.
5. 제 2항에 따른 감염성 클론에 이종 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제 5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드는 감염물질에 대하여 면역 반응을 일으키기는 항원 또는 감염물질에 대한 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
7. 제 5항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드는 형광단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 돼지유행성 설사 바이러스의 ORF3 (open reading frame 3)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
8. 제 5항 내지 제 7항의 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
   
   
   
   
   
   

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