CN101117627A

CN101117627A - 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN101117627A
Application number: CNA2007100030473A
Authority: CN
Inventors: 冯力; 陈建飞; 时洪艳; 佟有恩; 孙东波
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2008-02-06
Anticipated expiration: 2027-02-01
Also published as: CN101117627B

Abstract

本发明公开了猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应片。本发明弱毒疫苗株的微生物保藏号是：CCTCC－V200608。本发明弱毒疫苗株安全性好，对于猪流行性腹泻病毒具有良好的免疫保护率。本发明弱毒株可应用于可应用于制备成防治猪流行性腹泻病毒的单苗或联苗(活或灭活疫苗)等，也可制备成诊断猪流行性腹泻病毒的诊断试剂。

Description

猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及弱毒疫苗株，尤其涉及猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是一种急性、高度接触性的传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。

本病70年代初首先发现于英国和比利时。1976年，暴发了类似TGE的急性腹泻，已排除了TGEV作为病原的可能，也不是其它已知肠致病性病原，Wood把这次暴发的腹泻称为腹泻II型，以便与70年代初发生的腹泻(称为I型)区别。1978年Pensaert等发现一种类冠状病毒的病原与II型腹泻暴发有关。实验表明I型和II型腹泻的发生是由相同的冠状病毒引起的，即猪流行性腹泻病毒(Porcine EpidemicDiarrhea Virus，PEDV)故把这种腹泻称为猪流行性腹泻。

1973年先后在我国上海、辽宁、吉林、黑龙江、四川等地分离到TGE和PED病毒抗原。

TGE和PED在病毒抗原形态，临床症状，流行病学极其相似，唯免疫学和血清学相互没有交叉反应。PED是独立的猪的急性肠道传染病。

病猪是主要的传染源，流行主要发生在冬季，也有发生于夏季或春秋季节。病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，PEDV随粪便排出后，污染周围环境、车辆、衣服、鞋、用具等而散播传染。PEDV主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口途径自然感染。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤以哺乳仔猪受害最为严重，母猪发病率为15-90％。PED单一发生或PED和TGE混合感染发病。

病猪表现呕吐，迅速腹泻脱水，腹泻粪便呈水样，黄色或灰黄色，体温基本正常，仔猪频死前体温下降。呕吐多是发生在吃食和吃奶之后。中猪、肥猪和成猪常成精神委顿、厌食和持续3-7天的腹泻，恢复后容易造成生长发育不良。病变主要在小肠，小肠充血，肠壁变薄发亮，内充满黄色的液体。肠系膜充血，肠淋巴结充血、水肿。实验室诊断可采取猪小肠粘膜作抹片，进行荧光抗体染色，发病猪小肠各段可发现多量的荧光细胞。小肠病变开始与空肠，而后波及整个小肠段。临床出现腹泻后6小时达到高峰，主要是上皮细胞变性、坏死和脱落。感染的上皮细胞、电镜观察可见绒毛减少或缩短，细胞浆破裂，在胞桨的空泡内或滑面内质网中可见到病毒粒子。

免疫接种是防治该病的最有效手段。由哈尔滨兽医研究所研制的猪流行腹泻组织灭活疫苗及猪胃肠炎与猪流行性腹泻二联灭活疫苗和二联活疫苗(已商品化)，具有较好的免疫预防效果，但其预防效果还有待加强。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的猪流行性腹泻病毒(Porcine diarrhea virus，PEDV)弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于猪流行性腹泻病毒具有良好的保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：猪流行性腹泻病毒(Porcine diarrhea virus，PEDV)弱毒疫苗株，其保藏号是：CCTCC-V200608；分类命名：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株CV777；保藏时间是：2006年12月13日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武汉大学。

本发明PEDV弱毒株的培育：用PEDV CV777株(由比利时的Peresent教授馈赠)强毒适应Vero细胞系，传代毒83代转向仔猪肾(PK)原代细胞培养，从90代起进行5次克隆纯化，头2次选群斑，后3次选单斑，其中83-7-斑5株继续传代为147代，以克隆后35代毒(总代次134代)进行6代次返祖试验，对不吃初乳的仔猪均无致病性，证明传代弱毒毒力是稳定的。

本发明弱毒株的形态学观察：病毒细胞培养物上清离心后，将收获的病毒悬液5000rpm离心30min，取上清，然后上清液15000rpm超速离心，4℃离心2h，沉淀用适量pH7.0 PBS溶液悬浮，磷钨酸负染电镜检查。结果可见到典型的冠状病毒粒子的照片，病毒粒子呈球形，大小100～180nm，具有纤突。

通过对本发明毒株的基因序列进行分析，发现了本疫苗毒株的特有基因序列特征，其特有基因序列特征如下：ORF3基因序列总长度为626bp(SEQ ID NO：2)。

与PEDV CV777株ORF3的序列相比，本发明弱毒株与CV777株ORF3的序列同源性为97.9％，本发明弱毒株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

与PEDV Br1/87株ORF3的序列相比，本发明弱毒株与Br1/87株ORF3的序列同源性为97.8％，本发明弱毒株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

本发明弱毒株的适应细胞比较广泛，例如，可以是Vero、E6等细胞。

将本发明弱毒株被动免疫(接种母猪，通过母乳保护仔猪)：保护率为95.92％，主动免疫(直接保护接种猪只)：保护率为96.2％，表明本发明TGEV弱毒株对于猪流行性腹泻病毒具有良好的免疫保护率。

本发明弱毒株的安全性好，安全性试验结果表明，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全、无副反应。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种新的疫苗，该疫苗由本发明弱毒株和佐剂组成：

选用生长良好的PK或PK15细胞，倒掉培养液后，换以含5％病毒种子液的新鲜培养液(乳汉液或)，置37℃继续培养。接本发明弱毒株后，每日观察。发现生长异常、污染的细胞应废弃。培养2-3日后，约有80％的细胞出现病变，并与对照细胞差异显著时，即可收获，经3次冻融后，置-20℃保存。将收获的两种病毒每5瓶毒液为一组分别取样，进行无菌检验，应无细菌生长。效价均应≥10^6.0TCID50/ml。将检验合格的猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻细胞毒液等量混合液与保护剂(蔗糖明胶保护剂，明胶49g；蔗糖280g加无离子水700ml加热溶解后，分装，110～116℃灭菌30～60分钟。)按7∶1混合(病毒液保持在10-20℃，保护剂40-50℃)，充分摇均后分装，边分装边摇动，得本发明疫苗；8ml疫苗瓶分装量为2～3ml，迅速进行冷冻真空干燥。

本发明疫苗的使用方法：

(1)接种途径滴鼻、口服、后海穴位注射(尾根与肛门之间的凹陷处)、肌肉注射。

(2)接种剂量：(1头份)。

本发明疫苗的免疫持续期是母猪为1产，其它猪只6个月。

本发明弱毒株应用范围较宽，例如，可应用于制备成诊断猪流行性腹泻病毒的诊断试剂，还可应用于制备成单苗或联苗(活或灭活疫苗)疫苗等。

附图说明

图1本发明弱毒株与PEDV CV777株ORF3的序列相比结果。

图2本发明弱毒株与PEDV Br1/87株ORF3的序列相比结果。

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

具体实施方式

实施例本发明猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株(PEDV)的制备

PED CV777强毒株由比利时的Peresent教授馈赠。PEDV弱毒株的培育用PEDV CV777株强毒适应Vero细胞系，传代毒83代转向仔猪肾(PK)原代细胞培养，从90代起进行5次克隆纯化，头2次选群斑，后3次选单斑，其中83-7-斑5株继续传代为147代，以克隆后35代毒(总代次134代)进行6代次返祖试验，对不吃初乳的仔猪均无致病性，证明传代弱毒毒力是稳定的；将所得到弱毒株提交保藏，其微生物保藏号是：CCTCC-V200608；保藏时间是：2006年11月16日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武汉大学。

试验例1本发明猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株的基因序列特征分析

根据GenBank中发表的PEDV CV777株(AF353511)的序列设计一对引物，用于扩增本发明弱毒株-疫苗株(135代)的ORF3序列，引物如下：

PORF3U2：5`-CCT AGA CTT CAA CCT TAC GA-3`

PORF3L2：5`-CAG GAA AAA GAG TAC GAA AA-3`

PEDV CV777弱毒株-疫苗株(135)ORF3基因的测序结果为SEQ ID N0：1所示；

根据所测得的序列结果显示：与国外的毒株进行Blast比对，然后去掉不属于ORF3的序列，最终得出的PEDV CV777弱毒株-疫苗株(135代)ORF3基因序列总长度为626bp(SEQ ID N0：2)。

根据所测得的PEDV CV777弱毒株-疫苗株(135代)ORF3基因的序列与国外的毒株进行比对和序列分析得出以下结论：

(1)与PEDV CV777株ORF3的序列相比，CV777弱毒株与CV777株ORF3的序列同源性为97.9％，PEDV CV777弱毒株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列[为了区分强弱毒株，将弱毒株标记为CV777(A)]如下：ATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAACTATTAT(SEQ ID NO：3)；

具体的比对结果见图1。

(2)与PEDV Br1/87株ORF3的序列相比，PED CV777弱毒株与Br1/87株ORF3的序列同源性为97.8％，PEDV CV777弱毒株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，具体缺失的核苷酸序列为：

ATTGCCCACTTTTATATTACTGTGGTGCACTTTTAGATGCAACTATTAT(SEQ ID NO：4)；

具体的比对结果见图2。

试验例2本发明弱毒株(PEDV)的保护效力试验

1试验材料

1.1 PED毒株：适应Vero细胞毒为PEDV CV777强毒株(比利时Pensaert教授馈赠，哈尔滨兽医研究自行驯化培育)，效检强毒为沪毒株。

1.2细胞系：Vero细胞，日本千叶大学清水文七教授惠赠。

1.3制备原代肾细胞仔猪及试验猪：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物饲养场及无TGE与PED流行病史，并经血清学鉴定TGE与PED均为阴性的健康猪群。

2试验方法

2.1 PEDV CV777株适应Vero细胞、传代、毒价测定及感染性与免疫效力试验见文献(中国畜禽传染病20卷(6)329-332)。

2.2本发明PEDV细胞传代毒的主动与被动免疫试验

2.2.1传代毒克隆前的主动免疫试验以2ml口服接种3-6日龄哺乳仔猪，克隆后则经后海穴位接种1ml。

2.2.2克隆后的被动免疫试验以2ml后海穴接种产前30-45天的妊娠母猪。

2.3效力试验：主动免疫仔猪于接种后8-11天口服攻击10-5×1ml/头PED泸毒株；被动免疫妊娠母猪所产3日龄仔猪口服攻击10-6×1ml/头泸毒株，均为19及21代强毒。

2.4电子显微镜、免疫荧光检验及中和试验方法见文献(中国畜禽传染病20卷(6)329-332)。

2.5病毒克隆纯化：以仔猪肾原代细胞(PK)做空斑培养，方法见文献(中国畜禽传染病20卷(6)329-332)。

3、试验结果

3.1 PEDV接种毒克隆前的主动免疫试验继传代毒11、21、22代感染性试验及25、28、31代感染性与免疫效力试验(4)后，对59、68及90代进行口服途径的主动免疫试验，攻毒后分别为4/4、4/4、3/4及3/3保护，对照组3/3发病。

3.2 PEDV传代毒适应PK细胞及克隆纯化试验传代毒83代转向PK细胞培养，上PK细胞出现典型CPE，经中和试验、免疫荧光(检查细胞培养片)、免疫电镜(包括胶体金标记)检验，均为PED抗血清呈阳性反应，与TGE抗血清不交叉，毒价10^7.0-10^7.5TCID₅₀/0.3ml，复归仔猪攻PED强毒均保护，证明PED传代毒83代之后已适应了PK细胞。

从90代起进行克隆纯化试验，克隆是在2次群斑(由5-7个1mm以内单斑组成)的基础上，再进行3次单斑挑选。选出2个克隆株，其中83-7-斑5株继续传代并进行系列试验，克隆后已继48代，总代次为147代。

3.3克隆后的主动免疫试验克隆后的5、10、14、20及25代主动免疫试验的总保护率为95.92％(47/49)、发病率4.08％，对照组发病率为88.8％(16/18)，见表1。

表1 PED传代毒克隆后主动免疫试验

克隆后		仔猪	仔猪	安全性试验		间隔时间	效力试验				对照组
克隆后		仔猪	仔猪	安全性试验		间隔时间	效力试验				对照组	代次	头数	日龄	途径	剂量	反应	强毒代次	剂量	途径	发病率	保护率	8/10
510142025(总计124代)	14116711	65435	后海穴后海穴后海穴后海穴后海穴	1ml1ml1ml1ml1ml	无 11无 11无 10无 8无 8	PED泸株19代PED泸株19代PED泸株19代PED泸株19代PED泸株19代	1ml1ml1ml1ml1ml	口服口服口服口服口服	0/140/111/60/71/11	14/1411/115/67/710/11		代次	头数	日龄	途径	剂量	反应	强毒代次	剂量	途径	发病率	保护率

3.4克隆后的被动免疫试验总做8批，克隆后17、20代各2批，25、30、35及40代各一批，总保护率96.2％(76/79)，发病率3.8％(3/79)，对照组100％(10/10)发病，见表2。试验母猪的中和抗体效价接种前7头为4倍或以下，1头为8倍。对所产仔猪攻毒前6头母猪为128倍，2头为64倍。检测4头攻毒后10-17天母猪的中和抗体价均为256倍。

表2 PED传代毒克隆后被动免疫试验

克隆后代次	母猪编号	产仔头数	仔猪攻毒日龄	强毒代次	剂量	途径	发病数	保护数	对照组
克隆后代次	母猪编号	产仔头数	仔猪攻毒日龄	强毒代次	剂量	途径	发病数	保护数	对照组	1717202025303540	12345678	1212713910412	34343333	PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代PED泸株21代	10^-6ml10^-6ml10^-6ml10^-6ml10^-6ml10^-6ml10^-6ml10^-6ml	口服口服口服口服口服口服口服口服	0/120/120/70/131/91/100/41/12	12/1212/127/713/138/99/104/411/12	5/55/5

试验结果表明，本发明弱毒株对于猪流行性腹泻病毒具有良好的免疫保护率。

试验例3 本发明弱毒株的安全性试验

1、猪流行性腹泻弱毒的稳定性试验：

1.1试验方法：以克隆后25代本发明弱毒株(总代次124代)5ml口服接种2～4日龄人工哺乳仔猪，临床观察在6代次19头仔猪中除第一代有2头一过性腹泻(营养性的)外，其余均无反应，观察72小时迫杀，进行空肠绒毛及免疫荧光检验，同时制备10倍空肠组织悬液，过滤后作为次代接种材料及上PK细胞传1～2代。

1.2试验结果：荧光检查均呈阳性，再将空肠组织滤液上PK细胞1～2代，均出现典型CPE，证明克隆纯化后传代毒是稳定的(表3)。

表3 PED 83-7-7斑传代毒稳定性试验

复归仔猪代次	仔猪头数	途径与剂量(日龄、小时)	临床反应	迫杀时间(小时)	空肠绒毛	免疫荧光检查	10^×小肠组织滤液上细胞
复归仔猪代次	仔猪头数	途径与剂量(日龄、小时)	临床反应	迫杀时间(小时)	空肠绒毛	免疫荧光检查	10^×小肠组织滤液上细胞	123456	4(48)4(96)2(80)3(85)4(72)2(48)	口服25代毒5ml口服1代10^×小肠组织滤液5ml口服2代10^×小肠小肠组织滤液5ml口服3代10^×小肠组织滤液5ml口服4代10^×小肠组织滤液5ml口服5代10^×小肠组织滤液5ml	2头一过性腹泻(营养性)正常正常正常正常正常	727272727272	正常正常正常正常正常正常	阳性(+～++)阳性(+～+++)阳性(+～#)阳性(+～++)阳性(+～++)阳性(+～++)	1代CPE+++2代CPE+++1代CPE+++1代CPE++～#1代CPE+++1代CPE+++～#1代CPE+2代CPE+++～#

2猪流行性腹泻弱毒的安全试验

2.1试验猪：来自中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物饲养场及无TGE与PED流行病史，并经血清学鉴定TGE与PED均为阴性的健康猪群。3～7日龄仔猪。

2.2试验方法：病毒以克隆后的25～35代毒(总代次为124～134代)其期间的三个代次进行病毒的大剂量安全性试验，接种剂量为10头份(10^5.0TCID₅₀/头份)，每组10头，同时设对照组2头(接种等量的生理盐水)，同时观察体温、采食、局部反应以及是否呕吐、腹泻等。观察28天。

2.3试验结果

其他试验猪均无反应，通过上述的试验，证明大剂量的免疫接种，除了124代有一头体温升高外和126代有一头母猪键食外，对其他仔猪和母猪均无任何影响。试验结果证明，本发明疫苗在妊娠母猪上应用，不会造成母猪流产、死胎等繁殖障碍，实验组与对照组无明显差异，母猪产仔数均在9～13只，属于正常范围，无流产、死胎等繁殖障碍等表现，证明疫苗是安全的(表4、5)。

安全性试验结果表明，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪均安全无副反应。

表4本发明猪流行性腹泻弱毒大剂量安全性试验

病毒代次	实验组观察内容(观察28日)								对照组观察内容(观察28日)
	实验组观察内容(观察28日)								对照组观察内容(观察28日)								仔猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应		病理变化	仔猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应		病理变化
	腹泻	呕吐	腹泻	呕吐																		临床反应								临床反应
	腹泻	呕吐	腹泻	呕吐	124126128130134	1010101010	10头份10头份10头份10头份10头份	1/10^a0/100/100/100/10	无无无无无	无影响无影响无影响无影响无影响	无无无无无	无无无无无	无无无无无	22222	0头份0头份0头份0头份0头份	0/20/20/20/20/2						无无无无无	无影响无影响无影响无影响无影响							无无无无无	无无无无无		无无无无无

a一过性体温升高40～41℃，2天康复。

表5本发明猪流行性腹泻弱毒母猪大剂量安全性试验

病毒代次	实验组观察内容(除产仔数和流产外，其他项目观察15日)								对照组观察内容(除产仔数和流产外，其他项目观察15日)
	实验组观察内容(除产仔数和流产外，其他项目观察15日)								对照组观察内容(除产仔数和流产外，其他项目观察15日)								母猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应	流产	窝均产仔数	母猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应	流产	窝均产仔数
	124126128130134	1010101010	10头份10头份10头份10头份10头份	0/100/100/101/100/10	无无无无无	无影响1/10^a无影响无影响无影响	无无无无无	无无无无无	11.212.210.49.910.4	22222	0头份0头份0头份0头份0头份	0/20/20/20/20/2	无无无无无	无影响无影响无影响无影响无影响	无无无无无	无无无无无	母猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应	流产	窝均产仔数	母猪头数	接种剂量	体温反应数	局部炎症	采食	临床反应	流产	窝均产仔数	10.811.411.810.212.0

a出现采食减少现象，但是在2天后恢复。

序列表

<110>中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所

<120>猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其应用

<130>098

<160>2

<170>Patent In version3.3

<210>1

<211>725

<212>DNA

<213>猪流行性腹泻病毒(Porcine diarrhea virus)

<400>1

cctagacttc aaccttacga agcttttgaa aaggtccacg tgcagtgatg tttcttggac 60

tttttcaata cacgattgac acagttgtca aagatgtctc gaagtctgcc aacttgtctt 120

tggatgctgt ccaagagttg gagctcaatg tagttccaat tagacaagct tcaaatgtga 180

cgggttttct tttcaccagt gtttttattt acttctttgc actgtttaaa gcgtcttctt 240

tgaggcgcaa ttatattatg ttggcagcgc gttttgctgt catttttctt tctgttgcac 300

acttattggc aggctttgtt tagtctgctt ttactcatgg cgctataaaa atgcgctctt 360

tattatcttt aatactacga cactttcttt tctcaatggt aaagcagctt attatgacgg 420

caaatccatt gtgattctag aaggtggtga ccattacatc acttttggca actcttttgt 480

tgctttcgtt agtagcattg acttgtatct agctatacgt gggcggcaag aagctgacct 540

acatctgttg cgaactgttg agcttcttga cggcaagaag ctttatgtct tttcacaaca 600

tcaaattgtt ggcattacta atgctgcatt tgactcaatt caactagacg agtatgctac 660

aattagtgaa tgataatggt ctagcagtta atgtcatact ttggcttttc gtactctttt 720

tcctg 725

<210>2

<211>626

<212>DNA

<213>猪流行性腹泻病毒(Porcine diarrhea virus)

<400>2

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcgaagtct 60

gccaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tttacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattttt 240

ctttctgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactca tggcgctata 300

aaaatgcgct ctttattatc tttaatacta cgacactttc ttttctcaat ggtaaagcag 360

cttattatga cggcaaatcc attgtgattc tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg 420

gcaactcttt tgttgctttc gttagtagca ttgacttgta tctagctata cgtgggcggc 480

aagaagctga cctacatctg ttgcgaactg ttgagcttct tgacggcaag aagctttatg 540

tcttttcaca acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag 600

acgagtatgc tacaattagt gaatga 626

<210>3

<211>49

<212>DNA

<213>

<400>3

attgccccact tttatattac tgtggtgcac ttttagatgc aactattat 49

<210>4

<211>49

<212>DNA

<213>

<400>4

attgcccact tttatattac tgtggtgcac ttttagatgc aactattat 49

Claims

1.猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株(Porcine diarrhea virus)，其微生物保藏号是：CCTCC-V200608。

2.一种核苷酸序列，是SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

3.按照权利要求1的弱毒疫苗株，其特征在于：与PEDV CV777株ORF3的序列相比，所述的弱毒疫苗株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，该缺失的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

4.按照权利要求1的弱毒疫苗株，其特征在于：与PEDV Br1/87株ORF3的序列相比，所述的弱毒疫苗株从ORF3序列的ATG开始的第245位到293位一共缺失了49个核苷酸，该缺失的核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示。

5.一种防治猪流行性腹泻的疫苗组合物，由权利要求1-4任何一项的弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。

6.权利要求1-4任何一项的弱毒疫苗株在制备防治猪流行性腹泻药物中的用途。

7.权利要求1-4任何一项的弱毒疫苗株在制备诊断或检测猪流行性腹泻病毒试剂中的用途。

8.权利要求2的核苷酸序列在制备诊断或检测猪流行性腹泻病毒试剂中的用途。