CN103756974B - 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用，该株猪流行性腹泻病毒，名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012(Porcine epidemic diarrhea virus)，于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V201309。该毒株的培养需要使用含有胰蛋白酶和氯化镁的无血清DMEM培养液。其可用于制备PEDV诊断试剂和PEDV疫苗，免疫原性好，可弥补现有疫苗种类少的不足。

Description

一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及一株新的猪流行性腹泻病毒，及其培养方法和应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原(殷震，1997; B. E.斯特劳，2000)，不同年龄和不同品种的猪均易感染，但对哺乳仔猪的危害最为严重，死亡率最高可达100%，给养猪业造成巨大的经济损失，是我国当前防治猪传染病中的重点疫病之一。

目前尚无治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此仍以疫苗预防为主，而病毒株及其培养的成功与否是疫苗研制的关键因素。

由于PEDV适应细胞培养难度高，自20世纪70年代初发现以来，许多学者先后以猪肾细胞、BHK细胞（仓鼠肾细胞）、牛睾丸细胞、人肺细胞等进行培养实验，尽管经过多年的努力，但是一直没有获得成功，成为病毒学上的一道难题。直到1984年长春兽医大学以猪体传24代吉毒株和45代的华毒株在胎猪肠组织原代单层细胞培养获得成功，这在国内外尚属首次(宣华，邢德坤，王殿派等1984)。1988年瑞典Hoffman等首次在Vero（非洲绿猴肾细胞）传代细胞培养液中加入胰酶使培养获得成功，连续传5代出现细胞病变(Hofmann, M et al, 1988)，日本和韩国也相继报道PEDV在Vero细胞上的培养特性(DS, Song, 2003；W Zhang et al, 1996)，PEDV在Vero细胞上传90代以上病变特征仍不明显，必须借助于PCR检测方法才能确定病毒是否生存。2010年东北农业大学利用从猪流行性腹泻临床疑似病猪的粪便样品制备的待检含毒材料在Vero细胞上连续盲传，分离到LJB/03毒株，该毒株盲传20代时很难观察到明显的细胞病变，随着传代继续进行，则开始出现细胞的轻微脱落，以后细胞的CPE（细胞病变效应）变化逐渐明显，稳定的CPE变化在第30代之后出现。主要的CPE表现类型是细胞肿胀变圆，折光性增强，颗粒物质增多，培养后期出现拉网状和细胞的大量脱落。

目前，由于国内几个厂家生产的疫苗都是较早分离到的PEDV CV777毒株（本发明中简称CV777毒株），缺乏广泛免疫原性，生产实践中选择范围十分有限。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，提供一株猪流行性腹泻病毒。

本发明的另一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒株的培养方法。

本发明的又一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒株的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一株猪流行性腹泻病毒，名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒GDSJ/2012 (Porcine epidemic diarrhea virus)，于2013年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V201309。保藏地址：中国. 武汉. 武汉大学。本发明中该株病毒简称为GDSJ/2012。

优选地，上述猪流行性腹泻病毒，其病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种用于培养上述猪流行性腹泻病毒的培养液，为含有浓度为3~8μg/mL胰蛋白酶和浓度为1~3μg/mL氯化镁的无血清DMEM。

上述猪流行性腹泻病毒的培养方法，步骤为：

1）用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层；

2）将猪流行性腹泻病毒接种于Vero细胞单层，并在细胞培养液中添加胰酶至终浓度3~8μg/mL形成吸附液，于37℃和5%浓度 CO₂的条件下进行吸附，病毒吸附细胞后弃掉吸附液，加入含有浓度为3~8μg/mL胰蛋白酶和浓度为1~3μg/mL氯化镁的无血清DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第3天或出现70%细胞病变后，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代，重复1）、2）步骤。

上述培养方法中，所述细胞培养液为本领域培养Vero细胞的常用培养液，或者为以下成分：

含3.7g/L碳酸氢钠，0.1mM非必需氨基酸，1.0mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS的DMEM，占培养液体积的90%；

胎牛血清或新生牛血清，占培养液体积的10%。

上述猪流行性腹泻病毒在制备PEDV诊断试剂中的应用。

上述猪流行性腹泻病毒在制备PEDV疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

GDSJ/2012毒株与CV777毒株S基因的同源性只有94.4%，S基因又含有流行性腹泻病毒主要的中和介导抗原决定部位，因此DSJ/2012毒株的成功分离及其稳定传代对新疫苗的开发具有重要作用。本发明不仅对我国流行性腹泻病毒毒种保存是一种补充，对该病引起的疾病诊断，感染监测体系完善和所致疾病流行的控制等都有重要作用。

附图说明

图1：病料的RT-PCR检测结果电泳照片，其中M: DL2000Marker; 1和2为阴性粪样, 3-7为阳性粪样, 8为阳性对照, 9为阴性对照。

图2：Vero细胞病变图片（×100），其中A：正常对照细胞，细胞未出现病变；B：病料传第8代时，Vero细胞感染病毒48小时后的病变照片，显示细胞出现大量融合，病变稳定。

图3： RT-PCR检测不同代次的感染GDSJ/2012毒株的Vero细胞培养物, 1-5为第3、5、8、15、20代细胞培养上清，6为阴性对照。

图4：GDSJ/2012病毒颗粒电镜负染色结果，箭头指示为病毒。

图5：间接免疫荧光染色（×200）鉴定照片，其中A为未接毒细胞阴性对照；B为GDSJ/2012毒株感染的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。

实施例 1 GDSJ/2012 病毒株获得

1.病料采集与处理

采集广东省某猪场的疑患病毒性腹泻仔猪的新鲜粪便7份，编号后分别用PBS（磷酸盐缓冲液）以1：10的重量体积比进行稀释，震荡混合均匀，反复冻融3次，于8000r/min（转每分钟）离心10 min（分钟），取上清，用孔径0.22μm（微米）的滤器除菌，所得处理液-70℃冰箱储存备用。

2.病料的RT-PCR（反转录聚合酶链式扩增反应）检测

编号1~7的上述处理液各取200μL（微升），用上海百赛生物技术有限公司生产的AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒进行RNA提取。提取后的RNA用下面的反应体系和条件进行反转录：8μL的RNA与1μL 10mM dNTP mix和1μL Radom 9mer混匀，65℃ 5min，然后迅速置于冰上2min。此混合溶液再加入4.5μL的RNase-Free H₂O，4μL RNase H^- Buffer，1μL的RNase H^-，0.5μL的RNase Inhibitor，混匀后置于PCR仪上，按如下条件反应：30℃ 10min；42℃ 60min；70℃ 15min。

反转录后获得的cDNA用下述引物进行PCR，扩增N基因（上游引物P1：5'-GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3'，SEQ ID NO:2；下游引物P2：5’- GCTCACGAACAGCCACATTA-3’，SEQ ID NO:3)。反应体系为25μL：Premix Taq(DNA 聚合酶，MgCl₂，PCR缓冲液，dNTP混合物)12.5μL，10 pmol/L上、下游引物各0.5μL，模板cDNA 2μL，加去离子水至25μL，混合均匀，同时设立水阴性对照和CV777毒株阳性对照。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，51℃退火40s，72℃延伸50s的程序，30个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后取5μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1，可见编号1~2的病料未出现扩增产物，而编号3~7的病料均有扩增产物。选取能扩增出与阳性对照条带一致的约492 bp片段病料上清液作为待分离样品备用。

3.猪流行性腹泻病毒的传代分离

选取RT-PCR检测阳性的病料上清液（编号3~7）分别进行传代分离。

分别取6孔板上48h生长良好的本实验室保存、广东省农业科学院兽医研究所和东北农业大学赠送的Vero细胞，弃去培养液，用PBS液清洗细胞单层2次，再用含3~8μg/mL胰酶的DMEM洗一遍，每孔加入200μL病料上清液，并添加胰酶至终浓度3~8μg/mL形成吸附液，放置于37℃的5% CO₂条件下吸附1h，其间轻摇2次，待吸附结束后，弃掉吸附液，加入pH值为7.2，分别含有终浓度3~8μg/mL胰蛋白酶和1~3μg/mL氯化镁的无血清DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养，逐日观察，以72h为一个传代周期。传代前将上一代的细胞培养物反复冻融3次，重复以上操作进行传代。整个传代过程期间，设置不接种病毒的含有相同浓度胰酶的细胞培养物作阴性对照。若无细胞病变，可继续传6代，每代在收毒时取上清用上述步骤2的RT-PCR方法进行检测，若为阳性继续传代，若为阴性则弃去。

经过反复传代筛选，最终在接种本实验室保存的Vero细胞、编号4的病料上清中分离到一株可稳定传代的病毒株，命名为GDSJ/2012，该毒株在第3代即可看见明显细胞病变，在第8代就可使病变稳定存在，主要表现为细胞出现大量融合，具体病变见图2B。将出现70%以上病变的细胞冻融一次，于8000r/min离心10min，取上清放入-70℃冰箱进行保存，上清中即含有GDSJ/2012毒株。

将GDSJ/2012第8代、第15代、第20代和第25代分别接种广东省农业科学院兽医研究所和东北农业大学赠送的Vero细胞，第20代能出现轻微的病变，第25代能出现明显的细胞病变，说明从第20代开始，GDSJ/2012已能广泛适应其他Vero细胞。以下的检测均使用含有GDSJ/2012毒株的病料作为研究对象进行。

4.细胞培养物的RT-PCR检测

操作方法同步骤2中各病料的RT-PCR检测，检测样品采用第3、5、8、15、20代接种含GDSJ/2012毒株的病料后的细胞上清，检测结果见图3，显示不同代接种的病料都能检测到较亮的目的条带。

5.电镜鉴定

将接种第5代GDSJ/2012毒株培养48h的Vero细胞培养物收获后，反复冻融3次，12000r/min 4℃离心30min，去除细胞碎片，吸取少量滴加到用碳膜覆盖的铜网上，待网上液滴将干时，再滴上pH值6.1的磷钨酸溶液进行染色，一定时间后用滤纸吸去多余染液，在透射电镜下观察，结果见图4，显示病毒直径在80~120nm，呈球形或椭圆形，有的病毒粒子包膜上有棘突，符合PEDV的已知形态。

6.间接免疫荧光检测

取Vero细胞长成单层的96孔细胞板，接种第5代病毒，同时设立不接毒的Vero细胞为阴性对照，24h后在显微镜下观察，接毒细胞发生病变，轻轻吸弃上清，用PBS轻轻洗涤3次。再用-20℃冷丙酮(丙酮：超纯水体积比为4：1)每孔加200μL置于4℃固定15min。PBS洗涤3次，每次3min，然后将细胞单层用200μL 5%脱脂乳封闭30min，之后倒去脱脂乳，加入稀释的韩国JBT公司生产的兔抗PEDV二抗（1:10000)200μL，于37℃温箱内作用1小时，PBS洗涤3次，每次3min；滴加200μL FITC(异硫氰酸荧光素)标记的上海生工生产的兔抗猪IgG二抗（1：10000稀释)，37℃作用30min，PBS洗涤3次，每次3min；最后用1：9的磷酸甘油封底，用倒置荧光显微镜观察结果。需设置只加一抗不加二抗、只加二抗不加一抗的阴性对照孔各两个以及接有鉴定好的病毒（CV777毒株）阳性对照孔。结果显示，阴性对照均为阴性，CV777毒株和本发明分离到的GDSJ/2012毒株均在细胞浆中被染色，证实分离到的是猪流行性腹泻病毒，染色结果见图5，表明GDSJ/2012毒株具备非常好的免疫原性。另外，只加一抗不加二抗、只加二抗不加一抗的阴性对照均未显示有荧光染色。

7. S基因序列测定

取200μL GDSJ/2012的第5代Vero细胞培养物，RNA提取和反转录体系及条件同上述步骤2。反转录后的cDNA用下述引物进行PCR，扩增S基因（上游引物P1：5'- ATGAGGTCTTTAATTTACTTC -3'，SEQ ID NO:4；下游引物P2：5’- TCAATCGTGTATTGAAAAAG -3’，SEQ ID NO:5)。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸4.5min的程序，28个循环；最后72℃延伸10 min。将S基因的PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳回收，切下约43000bp的目的条带，用凝胶回收纯化试剂盒回收目的片断，克隆到TaKaRa公司生产的pMD18-T载体，构建pMD-S重组质粒，连接产物转化TaKaRa公司生产的JM109感受态细胞，菌液涂布在含100μg/L Amp的LB平板上，37℃培养16~18h，挑取白色菌落培养后抽提质粒，进行PCR、酶切鉴定后送上海博亚公司进行测序。测序结果为SEQ ID NO:1所示的序列。

利用DNAStar软件对测序结果进行分析，结果显示：GDSJ/2012毒株同GD-A毒株的同源性最高，为98.7%；同CV777毒株只有94.4%的同源性，证明分离到的毒株为新毒株。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东温氏食品集团股份有限公司

<120> 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4158

<212> DNA

<213> GDSJ/2012

<400> 1

atgaggtctt taatttactt ctggttgttc ttaccagtac ttttaacact tagcctacca 60

caagatgtca ctaggtgctc ggctactact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcac ctgccgtcgt cgtcctgtgc ggttatctac ctattggtat gaaccagggt 180

gtcaattcta cttggtactg tggcagccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240

tttcttagcc atatcgattg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360

gcgcgactgc gcatttgcca gtttcccgat aataaaccat tgggccccac tgctaataat 420

gatgttacaa caggtcgtaa ctgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gaccgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt ttatacaccc acttactaca ttcttaatgt tactagtgct 660

ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720

gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780

cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840

gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900

caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960

tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020

ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcag aacctcactt agccaccttt 1080

gccatacctc cgggtgctat ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140

aactccactg tttataaatt cttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200

accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctact tgcatctcgg tttgttggat 1260

gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttctgg tttttggacc 1320

atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt aacgaagttc aaggaactgc cattcagcgt 1380

attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440

gacgatggtt tttaccgtat ttcctctaca aaccttctga gtcatgaaca gccaacttct 1500

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tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680

tatggttacg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt ttaccttgca atctgctaat 1740

gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tctaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800

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caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgttacggac 1920

gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980

ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattatac atctgattct 2040

ggacagttgt tagcttttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100

tctttttcag agcaggctgc atatgttaat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160

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ttagccacca tcagttcgtt taatggtgat ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640

tccgtgtatg accctgcaag tggcagggtg gtacacaaaa ggtctttcat tgaagacctg 2700

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atggtgctag gaggttttac tgcagcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagcg 2940

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gagtctttta attctgctat tggtaatata actccagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060

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caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactcccgac ttgacattct ttcagccgat 3240

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acccttacta agtatactga ggttcaggct agcaggaaac tagcacagca aaaggttaat 3360

gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420

ttctctctgg tacaggccgc acctctaggc ctgctgtttt tacacacagt acttgtaccg 3480

ggtgactttg taaatgttat tgccatcgct ggcttatgtg ttaacgatga aattgccttg 3540

actctacgtg agcctggttt agtcttgttt acgcatggac tccaagatac tgcgacggaa 3600

tattttgttt catcgcgacg tatgtatgaa cctagaaaac ctaccgttgg tgattttgtt 3660

caaattgaga gttgtgtggt cacctatgtc aatttgacta gagaccaact accagaagta 3720

atcccagatt acatcgatgt taacaaaaca cttgatgaga ttttagcctc tctgcccaat 3780

agaactggtc caagtctttc tctagatgtt tttaatgcca cttatcttaa tcttactggt 3840

gaaattgcag atttagagca gcgttcagag tctctccgta atactacaga agagcctcga 3900

agtctcatat taaatatcaa caacacacta gttgaccttg agtggctcaa ccgagttgag 3960

acatatatca agtggccgtg gtgggtttgg ttgattattt ttattgttct catctttgtt 4020

gtgtcattac tagtgttctg ctgcatttcc acgggttgtt gtggatgctg cggttgctgc 4080

ggtgcttgtt tttcaggttg ttgtaggggt cctagacttc aaccttccga agcttttgaa 4140

aaggtccacg tgcagtga 4158

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

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<400> 3

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcaatcgtgt attgaaaaag 20

Claims (3)

1.一株猪流行性腹泻病毒，名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒

GDSJ/2012 (Porcine epidemic diarrhea virus GDSJ/2012)，于2013 年5 月15 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:V201309。

2.根据权利要求1 所述的猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述病毒的纤突蛋白S 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。

3.权利要求1 或2 所述猪流行性腹泻病毒的培养方法，其特征在于，步骤为：

1）用细胞培养液培养Vero 细胞使之形成细胞单层；

2）将猪流行性腹泻病毒接种于Vero 细胞单层，并在细胞培养液中添加胰酶至终浓度3~8μg/mL 形成吸附液，于37℃和5% 浓度CO₂ 的条件下进行吸附，病毒吸附细胞后弃掉吸附液，加入含有浓度为3~8μg/mL 胰蛋白酶和浓度为1~3μg/mL 氯化镁的无血清DMEM 作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第3 天或出现70% 细胞病变后，将细胞培养物冻融3 次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代，重复1）、2）步骤。