CN104911153B

CN104911153B - 一种分离禽偏肺病毒的方法

Info

Publication number: CN104911153B
Application number: CN201510405607.2A
Authority: CN
Inventors: 邹敏; 吴发兴; 刘新文; 宫晓; 范根成; 孙健
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2035-07-10
Also published as: CN104911153A

Abstract

本发明提供一种禽偏肺病毒的分离方法，本发明采用取孵化17～19日龄的SPF鸡胚的气管和肺脏组织混合细胞培养禽偏肺病毒。本发明在常用一个临床发病样本、一次一种敏感细胞分离培养的传统方法基础上，通过同一培养体系、两种混合细胞的分离、传代方法，成功改进AMPV体外培养条件，明显提高了AMPV的分离率，减少了传代次数。

Description

一种分离禽偏肺病毒的方法

技术领域

本发明属于病毒的分离接种技术领域，具体涉及一种分离禽偏肺病毒的方法。

技术背景

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus，AMPV)，又名火鸡鼻气管炎病毒(TurkeyRhinotracheitis Virus,TRTV)，是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属成员。AMPV感染禽类可引起急性上呼吸道感染，能致肉鸡产生严重的呼吸道症状、成年鸡头部肿大，是诱发鸡肿头综合征(Swollen Head Syndrome，SHS)的主要病毒性病原。该病于1978年首次发现于南非共和国，随后在世界范围内均有发病报导。我国于1998年在黑龙江某肉鸡场的肿头综合征的鸡群中分离到这一病毒。AMPV的全基因组包括8个基因，分别是N、P、M、F、M2、SH、G、L。根据病毒G蛋白的差异和血清学分析，AMPV分为A、B、C、D四个亚型。其中，A型和B型呈全球性分布，在以色列、巴西、俄罗斯、日本、我国以及多数欧洲国家等地均有报道。该病的典型临床症状是，肿头综合症，以流涕、打喷嚏、眶下窦肿胀、头部肿胀和产蛋率下降等为主要临床特征，发病率高达100％，死亡率为25％～40％。该病传染性强，传播迅速，能引起多种禽类感染发病并造成严重的经济损失。

目前，分离AMPV的常用方法是卵黄囊、鸡胚成纤维细胞、Vero细胞或鸡的气管环接种。实际工作中，因为样品多病原混合感染、样品保存和运输条件、培养方法不适当等原因，导致难以获得预期的病毒分离物，或者分离病毒失败。

发明内容

本发明提供一种禽偏肺病毒的分离方法，本发明采用混合细胞培养方法从而达到提升禽偏肺病毒分离率的目的，因此提高了病毒的分利率。

本发明的方法，包括如下的步骤：

1)样品处理：将采集的临床禽偏肺病毒病发病样品置已灭菌的小烧杯中，用已灭菌的剪刀剪碎，加入灭菌PBS(pH值7.0～7.2)混匀，转移至研磨管中进行震荡研磨；取研磨好的组织混悬液于-70℃、室温交替冻融两次，然后12000r/min、4℃离心10min，在生物安全柜中取经处理的每份样品上清液2ml，-70℃冻存备用；

2)分离SPF鸡胚气管、肺脏组织：取孵化17～19日龄的SPF鸡胚的气管和肺脏组织，用pH值7.2的PBS溶液洗涤3～4遍，备用；

3)洗涤：将洗涤后的气管和肺组织分别均匀剪成1～2mm³大小的组织块，再用pH值7.2的PBS溶液分别洗涤3遍，弃去洗液，备用；

4)消化：取步骤3)预剪碎的气管和肺组织置于灭菌的三角瓶中，再分别加入体积比为6～10倍的浓度为0.25％的胰酶-乙二胺四乙酸二钠溶液混匀，将瓶口用灭菌的塞子盖上，再用灭菌纱布包扎后用线绳包扎紧，在37℃条件下进行消化，其中肺脏组织需消化20～25min，气管组织消化25～30min；消化后室温3000r/min离心15min，弃去消化液，将细胞沉淀用pH值7.2的PBS溶液重悬、均匀震荡洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后以室温、3000r/min离心10min；轻轻洗涤2次，离心后留细胞沉淀备用；

5)分装培养：取经过洗涤后的细胞沉淀，在二级生物安全柜中用无菌吸管吸取含10％新生牛血清的DMEM培养基进行充分吹打，以均匀分散细胞，再用无菌纱布过滤细胞悬液去掉为充分消化的较大组织块，室温下3000r/min离心10min，再将细胞沉淀悬浮于含10％新生牛血清的DMEM中，进行细胞计数，根据细胞计数结果，再用含10％新生牛血清的DMEM将两种细胞的密度稀释到2×10⁶个/ml，再将两种细胞悬液等量混合后接入24孔培养板中，每孔1ml，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养、观察，直至铺满单层，培养时间为36～48h；

6)接种：将步骤1)中-70℃冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清进行滤过除菌，接种入步骤5)培养的混合细胞中，接种结束后置于37℃、5％CO₂培养箱中进行吸附；吸附结束后弃去接种液，再往各接种孔中加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，然后将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，培养至96h收获全部细胞培养物，此为第一代病毒培养物；

7)传代及鉴定取保存的第一代病毒培养物，经室温、-70℃反复冻融2次，按步骤6)继续进行连续传代培养；依此方法连续传5代。

本发明在常用一个临床发病样本、一次一种敏感细胞分离培养的传统方法基础上，通过同一培养体系、两种混合细胞的分离、传代方法，成功改进AMPV体外培养条件，明显提高了AMPV的分离率，减少了传代次数。

具体实施方式

实施例1

采用本发明SPF鸡胚气管、肺脏原代混合细胞接种法与传统的SPF鸡胚卵黄囊接种、鸡胚成纤维细胞、Vero细胞以及气管环组织接种方法，进行禽偏肺病毒分离率比较，同一份样品经处理后分别采用本发明的方法与传统方法进行病毒分离。

样品为2013年采自山东威海某鸡场新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品51份(经RT-PCR检测为阳性)。按本发明进行接种，具体操作方法如下：样品处理方法同“发明内容”中的1“样品处理”。细胞准备同“发明内容”中2、3、4、5。以下各实施例和比较例中的样品处理均相同，不再赘述。然后分别取-70℃冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清1ml用0.22μm的针式滤器进行滤过除菌，分别接入24孔细胞培养板各孔中，每份样品接种2孔，每孔接种量100μl，同时设立未接种空白对照，接种结束后改好盖子，做好标记，将24孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中进行吸附，时长1.5h，期间每隔30min温和震荡培养板1次使病毒能与细胞充分接触、吸附；吸附结束后，在二级生物安全柜中弃去接种液，再往各接种孔中加入1ml含2％新生牛血清的DMEM维持液，然后将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，每隔12h观察一次是否有细胞病变(CPE)产生，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，在第4代部分样品已能观察到CPE，取第5代病毒培养物进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。

比较例1

样品为2013年采自山东威海某鸡场新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品51份(同上)，分别进行传统培养方法进行接种、培养及鉴定。具体操作方法如下：

(1)卵黄囊接种取孵化5～8日龄的SPF鸡胚104枚，在暗室中进行照视，划出气室及胚体位置，于卵黄囊一侧进行打孔，孔口向上，然后取预处理的发病样品滤过除菌上清液，按每份样品每胚0.2ml的接种量进行接种，每份样品接种鸡胚两枚，接种后用融化的石蜡封孔，然后气室朝上将鸡胚置于卵架上进行继续孵化，弃去24h内死亡的鸡胚，孵化至第5天时全部取出，于4℃条件下过夜，无菌收取尿囊液，再按上述方法连续传至第5代，进行AMPV RT-PCR检测，鉴定病毒分离结果。结果见表1。

(2)鸡胚成纤维细胞制备及接种取9～11日龄发育良好的SPF鸡胚3枚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，敲碎气室部位的蛋壳，去掉蛋壳，露出壳膜，无菌挑开壳膜，用眼科镊子挑出鸡胚放入灭菌的平皿中，去除头、四肢和内脏，放入50ml烧杯中，用乳汉液洗涤胚体3次，用剪刀剪成小米粒大小的组织块，再用乳汉液洗3次，倒入50ml三角瓶中，然后加入0.25％胰酶溶液，每个胚加入4ml，置37℃水浴锅中消化10～15分钟，至组织块蓬松为止。消化结束后倒掉胰酶，加入乳汉液洗2次，加入10％新生牛血清的乳汉液洗1次去掉胰酶，再加入10％新生牛血清的乳汉液20ml吹打，用含8层纱布的漏斗过滤，重复3次，收集细胞悬液，进行细胞计数，根据技术结果用10％血清的乳汉液把细胞稀释至100万/ml，然后把配制好的细胞悬液分装，接入24孔培养板中，每孔1ml，标记细胞名称、制备日期，放入37℃、5％CO2的培养箱内培养。一般24h即可长满单层。

待细胞长成单层后，按照实施例1的方法将已处理的51份样品接种、吸附、培养观察，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。

其中禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的具体操作步骤如下：

1.引物序列

AMPVTF：5，-CCGGGACAAGTATCTCTATGG-3，

AMPVTR：5，-CAGTCGCCTGTAATCTTCTAGGG-3，

引物合成回来后，用DEPC水稀释成20pmol的工作浓度，分装后-20℃保存备用。

2.病毒总RNA提取

取-70℃保存备用的各临床发病样品处理上清液250μL，加750μLTRIzol，振荡混匀，室温(25℃左右，下同)孵育5min；加入250μL氯仿(4℃预冷)，涡旋振摇混匀15秒，室温孵育5～15min；12000r/min、4℃离心15min；取上清(500μL)于一灭菌EP管(无RNA酶)中，加入等体积异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，室温孵育10min(或-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀4小时或过夜)；12000r/min、4℃离心10min；弃上清，用1mL 75％的乙醇(DEPC水配制，-20℃预冷)洗涤2次，12000r/min、4℃离心5min；弃洗涤液，将离心管倒置于洁净吸水纸上，在通风橱中进行干燥，然后用30μL DEPC水溶解RNA，-70℃保存备用。

3.AMPV RT-PCR扩增、电泳检测及结果判定

按如下体系及条件进行PRRSV阳性样品的ORF5基因扩增。

AMPV RT-PCR检测体系

反应程序：50℃/30min、94℃/5min、32×(94℃/40s、58℃/40s、72℃/50s)、72℃/10min，最后4℃冷却10min，扩增结束。反应结束取5μL PCR产物，用1％琼脂糖凝胶、100V、45min电泳检查扩增结果，预期扩增产物的大小约为320bp，在阳性对照成立的条件下，如果待检样品的泳道内出现320bp大小的条带则判为阳性，否则判为阴性。

(3)Vero细胞接种取复苏液氮中保存的Vero细胞，待铺满单层后，用胰酶-乙二胺四乙酸二钠溶液进行充分消化、或细胞计数，然后均匀接种到24孔细胞培养板上，待长满单层后分别接种上述已处理发病样品上清液，每份样品接种2个细胞孔，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，在第5代已能看到明显的CPE，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。

(4)SPF鸡胚气管环接种取17～19日龄的SPF鸡胚，在暗室中进行观察，挑选健康的鸡胚进行气管环制备，具体制备过程是：无菌取气管，仔细除去气管周围的结蹄组织和脂肪，将气管放入含双抗PBS的平皿中轻轻洗涤，然后左手持眼科镊子固定住气管喉头部位，右手持手术刀片，切下气管单环，放入另一个含双抗PBS的平皿中轻轻洗涤，之后，将气管单环放入24孔细胞培养板中，每孔放6个环，然后加入含10％新生牛血清的DMEM培养基1ml，盖上培养板盖。放入37℃、5％CO₂培养箱中，24h后观察纤毛摆动情况。如摆动正常，进行分离物接种。接种过程与实施例4的SPF鸡胚气管、肺脏混合细胞接种方法相同，接种完成后进行培养观察至纤毛停止摆动，收获全部培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，按此法继续进行连续传代培养，连续传5代，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表1。

表1：威海鸡场临床AMPVD样品AMPV分离方法比较试验结果

注：(1)用5代分离结果进行比较，以RT-PCR检测结果作为病毒分离是否成功作为判定依据。

(2)表中“/”表示不进行此项观察；“+”表示鸡胚致死或由CPE或纤毛停摆RT-PCR检测阳性。

实施例2

采用本发明方法与上述4种传统方法，进行禽偏肺病毒分离率比较，同一份样品经处理后分别采用两类方法进行病毒分离。

样品为2014年从山东、河北、辽宁、江苏四省采集的新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品79份(经RT-PCR检测为阳性)，按本发明进行接种，具体操作方法如下：样品处理方法同“发明内容”中的1“样品处理”。细胞准备同“发明内容”中2、3、4、5。以下各实施例和比较例中的样品处理均相同，不再赘述。然后分别取-70℃冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清1ml用0.22μm的针式滤器进行滤过除菌，分别接入24孔细胞培养板各孔中，每份样品接种2孔，每孔接种量100μl，同时设立未接种空白对照，接种结束后改好盖子，做好标记，将24孔细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中进行吸附，时长1.5h，期间每隔30min温和震荡培养板1次使病毒能与细胞充分接触、吸附；吸附结束后，在二级生物安全柜中弃去接种液，再往各接种孔中加入1ml含2％新生牛血清的DMEM维持液，然后将培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养，每隔12h观察一次是否有细胞病变(CPE)产生，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，在第4代部分样品已能观察到CPE，取第5代病毒培养物进行AMPV RT-PCR检测。结果见表2。

比较例2

样品为2014年从山东、河北、辽宁、江苏四省采集的新鲜禽偏肺病毒感染鸡样品79份(经RT-PCR检测为阳性)，分别进行传统培养方法进行接种、培养及鉴定。具体操作方法如下：

(1)卵黄囊接种取孵化5～8日龄的SPF鸡胚160枚，在暗室中进行照视，划出气室及胚体位置，于卵黄囊一侧进行打孔，孔口向上，然后取预处理的发病样品滤过除菌上清液，按每份样品每胚0.2ml的接种量进行接种，每份样品接种鸡胚两枚，接种后用融化的石蜡封孔，然后气室朝上将鸡胚置于卵架上进行继续孵化，弃去24h内死亡的鸡胚，孵化至第5天时全部取出，于4℃条件下过夜，无菌收取尿囊液，再按上述方法连续传至第5代，进行AMPV RT-PCR检测，鉴定病毒分离结果。结果见表2。

(2)鸡胚成纤维细胞制备及接种取9～11日龄发育良好的SPF鸡胚5枚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘，敲碎气室部位的蛋壳，去掉蛋壳，露出壳膜，无菌挑开壳膜，用眼科镊子挑出鸡胚放入灭菌的平皿中，去除头、四肢和内脏，放入50ml烧杯中，用乳汉液洗涤胚体3次，用剪刀剪成小米粒大小的组织块，再用乳汉液洗3次，倒入50ml三角瓶中，然后加入0.25％胰酶溶液，每个胚加入4ml，置37℃水浴锅中消化10～15分钟，至组织块蓬松为止。消化结束后倒掉胰酶，加入乳汉液洗2次，加入10％新生牛血清的乳汉液洗1次去掉胰酶，再加入10％新生牛血清的乳汉液20ml吹打，用含8层纱布的漏斗过滤，重复3次，收集细胞悬液，进行细胞计数，根据技术结果用10％血清的乳汉液把细胞稀释至100万/ml，然后把配制好的细胞悬液分装，接入24孔培养板中，每孔1ml，标记细胞名称、制备日期，放入37℃、5％CO₂的培养箱内培养。一般24h即可长满单层。

待细胞长成单层后，按照实施例1的方法将已处理的79份样品接种、吸附、培养观察，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表2。

(3)Vero细胞接种取复苏液氮中保存的Vero细胞，待铺满单层后，用胰酶-乙二胺四乙酸二钠溶液进行充分消化、或细胞计数，然后均匀接种到24孔细胞培养板上，待长满单层后分别接种上述已处理发病样品上清液，每份样品接种2个细胞孔，培养至96h收获全部细胞培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，继续进行连续传代培养，连续传5代，在第5代已能看到明显的CPE，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表2。

(4)SPF鸡胚气管环接种取17～19日龄的SPF鸡胚，在暗室中进行观察，挑选健康的鸡胚进行气管环制备，具体制备过程是：无菌取气管，仔细除去气管周围的结蹄组织和脂肪，将气管放入含双抗PBS的平皿中轻轻洗涤，然后左手持眼科镊子固定住气管喉头部位，右手持手术刀片，切下气管单环，放入另一个含双抗PBS的平皿中轻轻洗涤，之后，将气管单环放入24孔细胞培养板中，每孔放6个环，然后加入含10％新生牛血清的DMEM培养基1ml，盖上培养板盖。放入37℃、5％CO₂培养箱中，24h后观察纤毛摆动情况。如纤毛摆动正常，进行分离物接种。接种过程与实施例1的SPF鸡胚气管、肺脏混合细胞接种方法相同，接种完成后进行培养观察至纤毛停止摆动，收获全部培养物，经-70℃、室温反复冻融2次，按此法继续进行连续传代培养，连续传5代，取第5代病毒培养无进行AMPV RT-PCR检测。结果见表2。

表2：山东等4省79份AMPVD样品AMPV分离方法比较试验结果

表3：几种分离方法的分离率比较(以RT-PCR阳性结果进行比较)

分离方法	实例1中分离率(％)	实例2中分离率(％)	平均分离率(％)
				卵黄囊接种法	8/51+(15.69)	11/79+(13.92)	14.81
鸡胚成纤维细胞接种法	5/51+(9.80)	6/79+(7.59)	8.70
				Vero细胞接种法	14/51+(27.45)	17/79+(21.52)	24.49
鸡的气管环接种法	16/51+(31.37)	22/79+(27.85)	29.61
				肺和气管混合细胞接种法	20/51+(39.22)	34/79+(43.04)	41.13

从以上两个实施例可以看出，采用传统的分离方法，病毒分离率为8.70％～29.61％；而采用本发明的方法分离病毒率可达41.13％，比传统分离方法提高了1.39～4.73倍，说明病毒对该混合细胞更敏感，分离率更高。

Claims

1.一种禽偏肺病毒的分离方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)样品处理：将采集的临床禽偏肺病毒病发病样品置已灭菌的小烧杯中，用已灭菌的剪刀剪碎，加入灭菌PBS混匀，转移至研磨管中进行振荡研磨；取研磨好的组织混悬液于-70℃、室温交替冻融两次，然后12000r/min、4℃离心10min，在生物安全柜中取经处理的每份样品上清液2ml，-70℃冻存备用；

3)洗涤：将洗涤后的气管和肺组织分别均匀剪成1～2mm³大小的组织块，再用pH值7.2的PBS溶液分别洗涤，弃去洗液，备用；

4)消化：取步骤3)预剪碎的气管和肺组织置于灭菌的三角瓶中，再分别加入体积比为6～10倍的浓度为0.25％的胰酶-乙二胺四乙酸二钠溶液混匀，将瓶口用灭菌的塞子盖上，再用灭菌纱布包扎后用线绳包扎紧，在37℃条件下进行消化，消化后室温3000r/min离心15min，弃去消化液，将细胞沉淀用pH值7.2的PBS溶液重悬、均匀振荡洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后以室温、3000r/min离心10min；轻轻洗涤2次，离心后留细胞沉淀备用；

5)分装培养：取经过洗涤后的细胞沉淀，在二级生物安全柜中用无菌吸管吸取含10％新生牛血清的DMEM培养基进行充分吹打，以均匀分散细胞，再用无菌纱布过滤细胞悬液去掉未充分消化的较大组织块，室温下3000r/min离心10min，再将细胞沉淀悬浮于含10％新生牛血清的DMEM中，进行细胞计数，根据细胞计数结果，再用含10％新生牛血清的DMEM将两种细胞的密度稀释到2×10⁶个/ml，再将两种细胞悬液等量混合后接入24孔培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养、观察，直至铺满单层，培养时间为36～48h；

7)传代及鉴定取保存的第一代病毒培养物，经室温、-70℃反复冻融2次，按步骤6)继续进行连续传代培养；连续传5代。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中，肺脏组织消化20～25min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中，气管组织消化25～30min。