CN111961652A - 一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。包括以下步骤：将禽偏肺病毒毒株在悬浮BHK‑21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；将悬浮BHK‑21细胞复苏后使用无血清培养液在三角摇瓶中培养；在生物反应器内加入无血清培养液，将种细胞接种至生物反应器；将悬浮BHK‑21细胞基础种毒株，继续培养；接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；接种病毒72小时后取样计算细胞活率，细胞活率低于60％时收获病毒培养液；将病毒液反复冻融、离心后保存。本发明采用悬浮BHK‑21细胞培养，病毒适应性好，病毒含量高；操作成本低，产品质量稳定；易操作，具备工业化大生产可行性。

Description

一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。

背景技术

禽偏肺病是由禽偏肺病毒引起的急性上呼吸道感染，是禽类具有高度传染性的疾病之一，临床特征表现为打喷嚏、咳嗽、流鼻涕、眶下窦肿胀、角弓反张和产蛋率下降等。禽偏肺病毒早期被称为禽肺病毒，由于可感染火鸡并导致鼻气管炎，也被称作火鸡鼻气管炎病毒，属于副黏病毒科、肺病毒亚科。禽偏肺病毒根据基因差异和血清学分析可分为A、B、C和D 4个亚型，我国在1998年于患有肿头综合症的鸡群中首次报道分离到禽偏肺病毒A亚型，2012年又陆续分离到B亚型和C亚型，近年越来越多的地区有鸡群禽偏肺病毒感染和分离的相关报道，部分鸡群的阳性感染率甚至达到100％。禽偏肺病毒具有高度传染性，传播速度快，可造成免疫抑制反应并伴随细菌继发性感染，对养禽也造成巨大损失。目前禽偏肺病毒主要通过SPF鸡或鸡胚进行分离培养和鉴定，也有使用Vero细胞研究病毒体外细胞培养的报道，但并不能完全满足禽偏肺病毒大规模低成本培养的需求。此外，现有技术中培养禽偏肺病毒获得的病毒液滴度低，给禽偏肺病毒疫苗的制备造成了极大的困难。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法及其在疫苗中的应用。

为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：

一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：

步骤1、毒株适应：将禽偏肺病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；

步骤2、种细胞制备：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在三角摇瓶中培养，保持细胞密度为5.0×10⁵～1.0×10⁷cells/mL；

步骤3、扩大宿主细胞：向无菌生物反应器内加入无血清培养液，将步骤2制备的种细胞接种至生物反应器；

步骤4、病毒接种：待步骤3中悬浮BHK-21细胞密度达到7.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度6.0×10⁵～5.0×10⁶cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，继续培养；

步骤5、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；

步骤6、收获病毒：接种病毒72小时后每隔6小时取样计算细胞活率，细胞活率低于60％时一次性收获全部病毒培养液；

步骤7、病毒保存：将步骤6收获的病毒液进行反复冻融、离心后保存。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤2中培养条件为摇床参数温度为34～37℃，二氧化碳浓度5％，速度90～150r/min。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤3中生物反应器培养条件为35～37℃，pH 6.6～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～70r/min，保持细胞密度为1.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL；

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤4中病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.01～0.5。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤4中接种病毒后培养条件为35～38℃，pH 6.5～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～60r/min。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，所述无血清培养液为倍谙基生物科技有限公司Tac-S101S无血清培养基或苏州沃美生物技术有限公司BS-SFM无血清培养基。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤5中营养包为无血清培养液浓缩液，浓缩倍数为2～10倍。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，葡萄糖监测的方法为使用罗氏卓越精采NC型血糖仪检测。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤6中病毒收获时间为接毒后72～96小时。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤6中细胞活力的检测方法为使用台盼蓝染色法计数。

进一步地，在上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法中，步骤7的具体步骤为在-40～-20℃反复冻融2～5次，冻融后以2000g～6000g离心5分钟收集上清液，于-20℃保存。

一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液在制备禽偏肺病毒灭活疫苗中的应用。

一种采用上述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液配制的禽偏肺病毒灭活疫苗。

本发明的有益效果为：

本发明提供的一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，不使用鸡胚培养病毒工艺，不需要专门饲养种鸡和挑选鸡胚，不需要无害化处理鸡胚组织物，对环境影响小；本发明采用悬浮BHK-21细胞培养，病毒适应性好，病毒含量高；本发明不用细胞贴壁介质，采用无血清全悬浮培养工艺，接种病毒前不需更换维持液，不需血清，培养基成分清晰可控，采用节省操作成本，产品质量稳定；本发明使用生物反应器培养禽偏肺病毒，降低了病毒扩散的风险，具有更好的安全性，工艺简单，易操作，染菌风险小，具备工业化大生产可行性；本发明提供的禽偏肺病毒无血清悬浮培养方法制备的病毒液病毒含量高，可以很好的应用于禽偏肺病毒疫苗的制备中。

附图说明

图1是接种病毒前的悬浮BHK-21细胞状态图

图2是收获病毒液前的悬浮BHK-21细胞状态图

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所采用的原料如下：

禽偏肺病毒：鸭源C亚型禽偏肺病毒，保藏号：CCTCC NO:V201823；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2018年08月02日；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

悬浮BHK-21细胞系：本实验室驯化保存。

无血清培养液：倍谙基生物科技有限公司Tac-S101S无血清培养基或苏州沃美生物技术有限公司BS-SFM无血清培养基。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：

步骤1、毒株适应：将禽偏肺病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传15代，使用贴壁BHK-21细胞测TCID₅₀，毒价为10^7.33TCID₅₀/mL，作为基础种毒株；

步骤2、种细胞制备：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在三角摇瓶中培养，保持细胞密度为5.0×10⁵～1.0×10⁷cells/mL；培养条件为摇床参数温度为37℃，二氧化碳浓度5％，速度100r/min；

步骤3、扩大宿主细胞：向无菌生物反应器内加入无血清培养液，设定培养条件为温度37℃，pH 7.2，DO 60％,搅拌速度70r/min，然后将步骤2制备的种细胞接种至生物反应器，保持细胞密度为1.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL；

步骤4、病毒接种：待步骤3中悬浮BHK-21细胞密度达到1.0×10⁷cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度5.0×10⁶cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.2；接毒后控制培养条件为36℃，pH 7.3，DO 60％，搅拌速度60r/min继续培养；

步骤5、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为5mmol/L时，补充营养包；

步骤6、收获病毒：接种病毒84小时取样计算细胞活率，细胞活率为52％，一次性收获全部病毒培养液；

步骤7、病毒保存：将步骤6收获的病毒液于-40～-20℃反复冻融3次，冻融后3000g离心5分钟收集上清，-20℃保存。

将上述方法制备的病毒液使用贴壁BHK-21细胞按照《中华人民共和国兽药典》2015年版第三部附录27的方法检测，测定病毒毒价为10^8.5TCID₅₀/mL。

本实施例接种病毒前的悬浮BHK-21细胞形态如图1所示，收获病毒前悬浮BHK-21细胞形态如图2所示。图中标尺为100μm。

实施例2

一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，包括以下步骤：

步骤1、毒株适应：将禽偏肺病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传16代，使用贴壁BHK-21细胞测TCID₅₀，毒价为10^7.33TCID₅₀/mL，作为基础种毒株；

步骤2、种细胞制备：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在三角摇瓶中培养，保持细胞密度为5.0×10⁵～1.0×10⁷cells/mL；培养条件为摇床参数温度为37℃，二氧化碳浓度5％，速度110r/min；

步骤3、扩大宿主细胞：向无菌生物反应器内加入无血清培养液，设定培养条件为温度37℃，pH 7.0，DO 40％,搅拌速度60r/min，将步骤2制备的种细胞接种至生物反应器，保持细胞密度为1.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL；

步骤4、病毒接种：待步骤3中悬浮BHK-21细胞密度达到9×10⁶cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度2.0×10⁶cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.05,；接毒后控制培养条件为37℃，pH 7.0，DO 40％，搅拌速度60r/min继续培养；

步骤5、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为5mmol/L时，补充营养包；

步骤6、收获病毒：接种病毒84小时取样计算细胞活率，细胞活率为58％，一次性收获全部病毒培养液；

步骤7、病毒保存：将步骤6收获的病毒液于-40～-20℃反复冻融3次，冻融后3000g离心5分钟收集上清，-20℃保存。

将上述方法制备的病毒液使用贴壁BHK-21细胞按照《中华人民共和国兽药典》2015年版第三部附录27的方法检测，测定病毒毒价为10^8.33TCID₅₀/mL。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、毒株适应：将禽偏肺病毒毒株在悬浮BHK-21细胞系中连续传代至病毒适应细胞，取病毒含量最高的适应毒株作为基础种毒株；

步骤2、种细胞制备：悬浮BHK-21细胞复苏后使用无血清培养液在三角摇瓶中培养，保持细胞密度为5.0×10⁵～1.0×10⁷cells/mL；

步骤3、扩大宿主细胞：向无菌生物反应器内加入无血清培养液，将步骤2制备的种细胞接种至生物反应器；

步骤4、病毒接种：待步骤3中悬浮BHK-21细胞密度达到7.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL后，使用无血清培养液稀释细胞至细胞密度6.0×10⁵～5.0×10⁶cells/mL，接种步骤1所得基础种毒株，继续培养；

步骤5、补充营养包：接毒后每天进行葡萄糖监测，当培养液中葡萄糖为1～5mmol/L时，补充营养包；

步骤6、收获病毒：接种病毒72小时后每隔6小时取样计算细胞活率，细胞活率低于60％时一次性收获全部病毒培养液；

步骤7、病毒保存：将步骤6收获的病毒液进行反复冻融、离心后保存。

2.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤2中培养条件为摇床参数温度为34～37℃，二氧化碳浓度5％，速度90～150r/min。

3.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤3中生物反应器培养条件为35～37℃，pH 6.6～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～70r/min；保持细胞密度为1.0×10⁶～1.0×10⁷cells/mL。

4.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤4中病毒接种BHK-21细胞的MOI为0.01～0.5。

5.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤4中接种病毒后培养条件为35～38℃，pH 6.5～7.3，DO 20％～60％，搅拌速度30～60r/min。

6.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤5中营养包为无血清培养液浓缩液，浓缩倍数为2～10倍。

7.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤6中病毒收获时间为接毒后72～96小时。

8.根据权利要求1所述的禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法，其特征在于，步骤7的具体步骤为在-40～-20℃反复冻融2～5次，冻融后以2000g～6000g离心5分钟收集上清液，于-20℃保存。

9.根据权利要求1～8任意一项所述禽偏肺病毒的无血清全悬浮培养方法制得的病毒液在制备禽偏肺病毒灭活疫苗中的应用。

10.一种禽偏肺病毒灭活疫苗，其特征在于，采用权利要求1～8任意一项所述培养方法制备的禽偏肺病毒液配制而成。

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