CN109593729A - 一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)在EB66悬浮传代细胞系中驯化禽减蛋综合征病毒，得到种毒；(2)将EB66细胞接种至生物反应器，使其在pH＝7.20±0.1的条件下进行悬浮培养；(3)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例，将步骤(1)所得种毒接种EB66细胞，培养pH＝7.40±0.1，在病毒效价达到最高时收获病毒液并保存。采用上述方法制得病毒液具有高纯度、高滴度的特点，将其灭活后制备的禽减蛋综合征疫苗具有生产工艺稳定、批间差异小、质量可控、产量和质量显著提高等优点。

Description

一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体地，涉及一种禽减蛋综合征病毒培养方法及其在疫苗中的应用。
背景技术
鸡减蛋综合症(EDS)是一种使产蛋鸡或种母鸡产蛋率下降的病毒性传染病。产蛋鸡感染EDS病毒后，鸡群产蛋量无法达到高峰期或产蛋量大幅下降，可使产蛋量下降20％～30％，严重影响到蛋鸡产业的发展，给广大养殖户及养殖企业带来巨大的经济损失，危害性非常严重。免疫接种是预防本病的主要措施，鸡群在进入产蛋前全部产生抗体，产蛋将不受影响。
目前，我国鸡减蛋综合症疫苗的生产主要采用鸭胚培养制备疫苗，由于目前我国还没有SPF鸭胚，无法保证鸭胚来源，鸭胚中有可能含有其它病毒，对其所繁殖EDS病毒的效价造成很大影响，造成不同批次间的疫苗质量差异巨大。同时鸭胚培养的病毒悬液中含有大量异源蛋白，疫苗副反应大，急需选择新的EDS疫苗生产介质。
近年来，利用悬浮培养工艺培养病毒制备疫苗已成为世界疫苗制备企业的发展趋势，利用无血清、化学成分界定的培养基全悬浮培养生产工艺可以克服传统鸭胚疫苗制备的缺点，大大提高疫苗品质，降低综合成本。随着细胞悬浮工艺的发展，能够适应悬浮培养的细胞种类众多，然而，现有报道中应用于悬浮培养的细胞系表面的EDS病毒受体丰度低，或者其胞内环境无法满足EDS病毒的营养需求，造成病毒液滴度低，给EDS疫苗的大规模制备造成了极大的困难。此外，细胞系、病毒的培养增殖工艺也会影响病毒液的品质和滴度。目前，关于利用细胞悬浮技术培养高滴度的EDS病毒液并将其应用到禽类免疫中的技术仍未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法及其在制备禽减蛋综合征疫苗中的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，包括以下步骤：(1)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后置于培养箱中悬浮培养，取HA效价最高时收获的病毒液进行传代，连续传代培养10代，得到种毒；(2)将EB66细胞接种至生物反应器，使其在pH＝7.20±0.1的条件下进行悬浮培养；(3)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例，将步骤(1)所得种毒接种EB66细胞，培养pH＝7.40±0.1，在病毒效价达到最高时收获病毒液并保存。
优选地，，在步骤(3)中，当EB66细胞的细胞密度达到1.0×106cells/mL-2.0×106cells/mL，将禽减蛋综合征病毒接种所述EB66细胞。
优选地，在步骤(2)中，将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至生物反应器。
优选地，EB66细胞的培养条件是37℃，5％CO2。
优选地，步骤(2)的培养转速为80rpm，步骤(3)的培养转速为120rpm。
优选地，细胞培养基为无血清培养基。
优选地，无血清培养基为CD EB66(DP210)培养基。
优选地，禽减蛋综合征病毒为禽减蛋综合征病毒K-11株。
根据本发明的另一个方面，提供一种禽减蛋综合征疫苗，采用灭活后的上述培养方法制得的病毒液配制而成。
优选地，在种毒接种EB66细胞后96小时收获病毒液。
本发明相对于现有技术，利用EB66传代细胞系进行禽减蛋综合征病毒的全悬浮培养，并优化禽减蛋综合征病毒的培养工艺，避免了使用鸭胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，确保制备病毒具有较高纯度、较高滴度、质量稳定均一。得到建立了禽减蛋综合征病毒的增殖以及大规模细胞培养生产技术，并能够将其应用于禽减蛋综合征疫苗的制备中，疫苗生产方法工艺稳定，各批次之间质量差异小，疫苗质量好，安全高效，具有很好的经济效益和应用前景。
附图说明
图1为实施例3中EDS灭活疫苗的HI抗体效价统计图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例所使用原料来源如下：
1.病毒：EDS病毒K-11株，由肇庆大华农公司保存。
2.细胞系：EB66传代细胞系，来源于法国Valneva公司,由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3.无血清、化学界定培养基：CD EB66(DP210)培养基，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
4.仪器设备：赛多利斯(Sartorius B Plus)搅拌式反应器(2L)。
实施例1-3所使用EB66细胞的复苏与培养方法如下：
从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入培养基将细胞吹打重悬均匀，并接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，连续传代2-3代次后，采用逐级放大的方法，进行扩大生产，至所得的EB66细胞系的细胞密度满足生物反应器的接种要求。
实施例1EDS病毒在全悬浮传代细胞系中的适应及驯化
1.病毒的接种：将细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至1.0×106cells/mL-2.0×106cells/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。取鸭胚培养的EDS种毒一支，按病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后置于37℃，5％CO2培养箱中悬浮培养，每隔24小时取样，进行病毒HA效价的检测。在病毒HA效价最高的时段收获病毒作为下一代驯化的种毒。
2.病毒的传代驯化：将收获的EDS病毒反复冻融离心3次，按步骤1相同的方法接毒进行传代驯化，如此连续传代培养，每隔24小时取样，进行病毒HA效价的检测。
3.病毒HA效价测定：将收获的病毒分别测定红细胞凝集价(HA)。经检测(结果如表1所示)，10代毒病毒效价为17log2以上，HA效价稳定，显著高于鸭胚毒HA效价(鸭胚毒HA效价约为13log2)，表明在EB66细胞中经过连续10代次传代驯化，EDS病毒能够很好的适应EB66细胞并能够以较高的速率在EB66中增殖。随着传代次数的增多，所得的EDS病毒效价也稳定在17log2左右，说明有较好的稳定性。
表1：EDS病毒在EB66细胞中的传代驯化结果
代次 HA效价(log2)
1 10
5 13
10 17
12 16
15 17
4.驯化的EDS病毒对EB66的适应能力：
将本实施例驯化所得种毒与未经驯化的EDS病毒K-11株分别按照病毒与细胞培养基体积比2/1000的接毒量在接种至三角摇瓶中悬浮培养的EB66细胞，接种时EB66细胞的细胞密度约为1.5×106cells/mL，每隔24小时观察摇瓶内细胞病变效应(CPE)，并取样进行病毒HA效价的检测，统计结果如表2所示。在病毒接种后24小时：接种了驯化后的种毒的EB66细胞的细胞形态表现正常，细胞增殖速度基本不受接种病毒的影响；接种了未经驯化的K-11株的EB66细胞的细胞形态比较差，死亡细胞数较多。通过对病毒的HA效价检测，在相同增殖时间内，接种驯化后的种毒能够得到滴度更高的病毒液。
表2病毒HA效价的检测
时间(h) 24 48 72
驯化后所得种毒的HA效价(log2) 8 13 16
未经驯化的K-11株的HA效价(log2) 5 10 12
实施例2EDS病毒在生物反应器中的培养
1.细胞的传代及培养：
1)三角摇瓶中传代及培养：将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至三角培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中的轨道摇床进行悬浮培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率，当细胞长至5.0×106cells/mL-15×106cells/mL，活率在90％以上时，用于反应器的接种。
2)反应器中的培养：将EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至生物反应器(Sartorius B Plus)中，培养参数如表3的EB66细胞培养条件所示。取样计数，并计算活率，当细胞长至1.0×106cells/mL-2.0×106cells/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
2.病毒的接种：当细胞生长至合适密度时，将反应器中的细胞打出30mL至三角摇瓶中作为对照，在反应器中，按EDS病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后培养参数如表3的EDS病毒培养条件所示；在三角摇瓶中，按EDS病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后置于37℃，5％CO2培养箱，转速为130rpm的轨道摇床中培养。反应器和三角摇瓶均每隔24小时取样，进行病毒HA效价的检测，在EDS病毒传代至第10代时取用。经过反应器验证，当反应器中细胞培养条件和接毒培养条件如下表3时，所得病毒液的效价稳定。
3.病毒的检测：对收获的病毒进行HA效价检测。从表4中可以看出，EDS病毒在EB66细胞中的反应器培养，当培养条件稳定时，收获的病毒的效价(HA效价最高为17log2)与摇瓶培养(HA效价最高为17log2)相当。
表3生物反应器中的最佳培养参数
表4病毒的HA效价检测
对照实施例
1.EB66细胞接种浓度对悬浮培养细胞的影响
将EB66细胞按不同的细胞密度接种至生物反应器中，每隔24小时检测生物反应器内的细胞密度和培养基的pH值，结果如表5、6所示：接种浓度过低，接种浓度小于0.35×106cells/mL时，细胞生长增殖缓慢，细胞数倍增时间由一般24小时延长至48小时或更多；接种浓度过高，接种浓度大于0.7×106cells/mL时，培养过程中培养液的pH值下降较快，抑制了细胞的生长，使细胞的倍增速率下降。
表5接种细胞密度对体系pH值的影响
表6接种细胞密度对细胞增殖速率的影响
2.培养体系pH值对病毒液滴度的影响
设置不同的EDS病毒培养pH值，每组设置三个重复，其余实验参数与实施例2中的设置保持一致，将EDS病毒接种在生物反应器中的EB66细胞，培养增殖96小时后，取样进行病毒HA效价的检测。结果如表7所示，EDS病毒的培养pH值对获的病毒液效价产生显著影响，在培养pH7.40±0.1时，所收获的病毒液的效价比较稳定。
表7EDS病毒培养条件pH值对收获病毒液效价的影响
实施例3在生物反应器中的培养EDS病毒制备疫苗的效果评价
分别将实施例2的第10代EDS病毒液(细胞源)和鸭胚毒EDS病毒液(鸭胚源)灭活，通过相同的生产工艺制备生物反应器中的培养EDS病毒灭活疫苗，用42日龄SPF鸡25只，其中10只各肌肉注射鸭胚源EDS灭活疫苗0.5ml，10只各肌肉注射细胞源EDS灭活疫苗0.5ml，另5只不接种作为对照。接种后14、21、28、35和42天，每只鸡分别采血，分离血清，用减蛋综合征抗原测定HI抗体效价。
细胞源和鸭胚源的EDS灭活疫苗免疫效果见图1，免疫后14天，细胞源EDS灭活疫苗抗体HI效价就达到10log2以上，一直到42天，被注射了细胞源或鸭胚源EDS灭活疫苗产生抗体效价仍在持续增长，但细胞源EDS灭活疫苗促进产生的抗体效价略高于鸭胚源EDS灭活疫苗。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例接种EB66细胞，接毒后置于培养箱中悬浮培养，取HA效价最高时收获的病毒液进行传代，连续传代培养10代，得到种毒；
(2)将EB66细胞接种至生物反应器，使其在pH＝7.20±0.1的条件下进行悬浮培养；
(3)按禽减蛋综合征病毒与细胞培养基体积比2/1000的比例，将步骤(1)所得所述种毒接种步骤(2)所述EB66细胞，培养pH＝7.40±0.1，在病毒效价达到最高时收获病毒液并保存。
2.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，当所述EB66细胞的细胞密度达到1.0×106cells/mL-2.0×106cells/mL，将所述种毒接种所述EB66细胞。
3.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，将所述EB66细胞按0.35×106cells/mL-0.75×106cells/mL的细胞密度接种至所述生物反应器。
4.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于：所述EB66细胞的培养条件是37℃，5％CO2。
5.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于：所述步骤(2)的培养转速为80rpm，所述步骤(3)的培养转速为120rpm。
6.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于：所述细胞培养基为无血清培养基。
7.如权利要求6所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于：所述无血清培养基为CD EB66(DP210)培养基。
8.如权利要求1所述禽减蛋综合征病毒全悬浮培养方法，其特征在于：所述禽减蛋综合征病毒为禽减蛋综合征病毒K-11株。
9.一种禽减蛋综合征疫苗，其特征在于，采用灭活后的如权利要求1～8所述培养方法制得的病毒液配制而成。
10.如权利要求9所述禽减蛋综合征疫苗，其特征在于，在所述种毒接种所述EB66细胞后96小时收获所述病毒液。
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