CN110237246A - 一种全悬浮细胞培养禽流感(h9)灭活疫苗的方法 - Google Patents

一种全悬浮细胞培养禽流感(h9)灭活疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，包括以下步骤：MDCK单层细胞驯化培养，禽流感(H9)灭活疫苗鸡胚种毒直接接种于MDCK悬浮细胞培养，生物反应器扩大培养，收获的培养物，培养至禽流感(H9)灭活疫苗增殖速度稳定，病毒含量≥108.5EID50；培养至细胞病变达80％以上时收获病毒液，即得。本发明将鸡胚种毒直接接种于MDCK悬浮细胞驯化培养，有效增加生产得到的悬浮毒的性能稳定性、连续性与安全性，得到的悬浮毒HA≥1:4096，每0.1ml病毒含量≥109.5EID50，每1ml病毒含量≥109.5TCID50。

Description

一种全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法
技术领域
本发明专利涉及生物医药技术领域，具体涉及一种全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法。
背景技术
近年来，全悬浮动物细胞培养技术迅猛发展并且越来越多用于生产禽流感疫苗，以逐步取代传统的鸡胚培养工艺。
但在现有生产技术中，禽流感疫苗生产工艺中所选取的细胞通常为单层贴壁细胞，以单层贴附方式培养生长，因此，需要采用有血清加微载体的培养工艺。但是，由于血清存在价格昂贵、批次间差异较大、可能存在外源病原体污染的风险等缺点。并且，由于血清中含有大量未知蛋白组分，会使得下游产品纯化分离困难。因此，需急切开发无血清培养基用于高效生产禽流感疫苗。但由于目前在大多数无血清工艺生产中，细胞依旧单层贴壁方式生长，细胞在进行传代和种子细胞扩增培养过程中需要进行洗涤、离心等缺点。而在大规模批次培养细胞扩增禽流感病毒时必须加入微载体提供贴附基质，不仅增加了生产成本，而且操作异常复杂，有明显的批间差，费时费力，非常不利于扩大生产规模。
现在，MDCK、AGE.CR、PER.C6、CAP、EB14/EB66等多种全悬浮细胞已经应用于流感疫苗制造生产工艺中，尤其是其中MDCK悬浮细胞应用最为广泛。但是，如果使用通常的批式培养方式病毒扩增效率非常低，只能够通过复杂的灌注和流加培养方式才能得到足够高的病毒滴度。然而由于流感病毒是裂解性病毒且扩增迅猛，会飞快杀死宿主细胞，因此复杂耗时的灌注和流加培养方法虽能获得较高病毒滴度，却浪费了大量培养基。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明专利设计了一种无血清单细胞全悬浮的培养方式，使用全悬浮MDCK细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，该方法包括以下步骤：
(a)驯化MDCK单层细胞，驯化培养使其适应无血清培养基及全悬浮培养环境；
(b)取经驯化培养并且细胞状态良好的MDCK全悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养，待细胞状态稳定后，接种于2L～8L的生物反应器中进行预培养，随后根据细胞状态、生长情况再逐步放大培养直至终极反应器；
(c)待终级反应器细胞密度达到4.0×106.0～1.0×107.0cells/ml，细胞状态稳定，调整反应器细胞密度为2.0×106.0～5.0×106.0cells/ml，按接种量为0.001‰～0.1‰或按照MOI感染复数10-1～10-4直接接入禽流感(H9)鸡胚种毒，接入的禽流感(H9)鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥108.5EID50，同时加入TPCK—胰酶，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1:4096时收获病毒液；
(d)将收获的病毒液进行纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品，将疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。
进一步的，所述步骤(a)中驯化培养MDCK使其适应无血清培养基的方法为:
贴壁MDCK细胞用胎牛血清含量为7～10％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
用胎牛血清含量为4～6％的DMEM/D32培养基连续传代培养4次；
用胎牛血清含量为1～2％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中DMEM/D32培养基胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养6次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中DMEM/D32培养基胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
进一步的，所述步骤(a)中驯化MDCK细胞适应全悬浮培养的方法为：将无血清培养基传代培养的MDCK细胞使用胰酶消化、低速离心，得到的细胞用无血清培养基以转速为40～60r/min进行摇床培养，培养过程中监测葡萄糖含量，低于1～1.5g/L进行换液或补加葡萄糖，待细胞生长良好、生长速率稳定后进行传代，每次传代前密度调整为0.4×106～0.6×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的MDCK细胞株。
进一步的，所述步骤(b)中MDCK全悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养的培养条件为转速100～170转/分、温度36.5±1℃、溶氧40％～70％、pH7.1±0.2，每一级扩大培养的时间为72～120小时。
相对于现有技术，本发明进一步规范了禽流感(H9)疫苗的生产规范，能够最大程度使疫苗生产更加的规范、安全、高效，低成本的生产禽流感疫苗，最重要的是减少了鸡胚毒需经贴壁细胞增殖所产生的一系列安全性及操作多等缺点与不足，减少不必要操作与成本，通过使用MDCK悬浮细胞培养禽流感病毒不仅解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染等一系列问题，而且培养的病毒免疫原性更为稳定及持久。
附图说明
图1是本发明的MDCK细胞低血清培养下的细胞状态图
图2是本发明的MDCK细胞初上摇瓶培养时细胞状态图
图3是本发明的MDCK细胞完全驯化后细胞状态图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。
MDCK细胞由北京鼎持生物有限公司从ATCC引进，引进时间：2016年5月，ATCC编号：CCL～47，代次：P24，保存号：58760046。
该株细胞被命名为马丁-达比狗肾细胞系悬浮适应株,简称MDCK-S株。该株细胞已于2019年07月04送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC NO.18182。。
发明中提及的无血清培养基及D32均购自北京鼎持生物有限公司及壹生科(深圳)有限公司。
D32培养基，含有多种微量元素及细胞生长必要元素，和购自赛默飞世尔(gibco)的DMEM培养基以1：1结合，称为DMEM/D32培养基，为市售产品。
禽流感(H9)病毒鸡胚种毒采购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
1、驯化培养MDCK细胞适应无血清培养基培养
使用含10％的进口胎牛血清的DMEM/D32培养液复苏MDCK冻存贴壁细胞，待细胞生长致密后进行传代。
传代后，挑选形状良好且生长良好的细胞，逐步进行驯化培养，具体步骤如下：
用进口胎牛血清含量为6％的DMEM/D32培养基连续传代培养4次；
用进口胎牛血清含量为2％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为2％，连续传代培养6次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
2、驯化培养MDCK细胞适应全悬浮培养
待经过上述步骤后即可得到无血清培养的贴壁MDCK细胞，经消化、离心，得到MDCK细胞悬液，调整初始细胞密度为0.6×106cells/ml、转速设定为25r/min、温度设定为37℃、CO2含量5％，进行摇床培养，适时测定葡萄糖含量，低于1g/L进行离心换液操作。
待细胞比生长速率及细胞状态稳定后，每培养72H后进行传代，每次传代前需将密度调整为约0.6×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，第一次提高转速20r/min至45r/min，进行适应培养4代；再提高转速25r/min至70r/min，进行适应培养4代；再提高转速30r/min至100r/min，进行适应培养4代；再提高转速35r/min至135r/min，进行适应培养4代；最终再提高转速35r/min将转速提高到170r/min进行连续传代5次。保证细胞的稳定性及适应性，即可得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的MDCK细胞株，该株细胞被命名为马丁-达比狗肾细胞系悬浮适应株,简称MDCK-S株。
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮MDCK细胞培养72小时可达到峰值1.0×107cells/ml左右，曲线特征为近“S”型曲线，72小时后细胞进入衰退期，细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间40～45小时。可见，本发明培养得到的无血清全悬浮培养MDCK细胞性能优异。
3、接种禽流感(H9)病毒鸡胚种毒
禽流感(H9)病毒鸡胚种毒直接接种于MDCK悬浮细胞培养步骤如下：
取经过上述步骤驯化得到悬浮MDCK细胞，置于摇瓶培养，培养72H后，待细胞密度达到1.0×107cells/ml左右时，进行离心后，弃去上清，使用无血清培养基进行重悬，进行扩增培养，逐级放大，放大体系为由20ml摇瓶至50ml至100ml至150ml摇瓶逐级放大，放达前调整细胞密度为0.6×106cells/ml，放大培养时的条件参数为170转/分、温度36.5±1℃、溶氧70％、pH7.1±0.2，每一级扩大培养的时间为120小时待到细胞体系及状态，达到生物反应器的接种要求时，接种于生物反应器进行悬浮培养，一般系为1L至10L进行预培养。
随后进行逐级放大培养直至最终7000L生物反应器；待最终生物反应器细胞密度达到1.0×107.0cells/ml时，调整细胞密度使细胞密度调整为5.0×106.0cells/ml，按照按接种量为0.001‰～0.1‰直接接入禽流感(H9)灭活疫苗鸡胚种毒，所述禽流感(H9)灭活疫苗鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥108.5EID50，并同时加入一定量的TPCK～胰酶，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1∶4096时收获培养物,培养至细胞病变达80％以上时收获病毒液，即得。
4、疫苗制备
对上述步骤收获的病毒液进行
灭活。
5、按照上述实例重复进行5次操作，禽流感病毒(H9)均可达到预期结果，结果情况如表1所示。
表1实施例1禽流感(H9)病毒测毒结果
实例 HA TCID<sub>50</sub> EID<sub>50</sub>
1 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.6</sup>
2 1∶4096 10<sup>9.6</sup> 10<sup>9.7</sup>
3 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.5</sup>
4 1∶4096 10<sup>9.7</sup> 10<sup>9.5</sup>
5 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.5</sup>
6、效力检验(下列方法任选其一)
(1)血清学方法：用21～28日SPF鸡10只.每只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另设5只鸡不接种作为对照。接种后21日，连同对照鸡5只，分别采血，分离血清，用国家禽流感参考实验室提供的禽流感病毒H9抗原(未经细胞传代的病毒接种鸡胚制备)测定HI抗体效价。
(2)免疫攻毒法：用21～28日龄SPF鸡10只.每只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另设5只鸡不接种作为对照。接种后21日，进行下列检验：
共进行同步5组进行实验，每组用10只免疫鸡，连同对照鸡5只，各静脉注射禽流感病毒0.2ml(含EID50＝2×107)/只,观察10日，免疫鸡应全部健活，对照鸡应全部死亡，攻毒后第5日，采集每只免疫鸡泄殖腔及喉头棉拭子，分别尿囊腔接种9～11日齡SPF鸡胚5个,每胚0.2ml,孵育96小时,测定所有鸡胚液HA效价。每个拭子样品接种的鸡胚中只要有1个鸡胚的尿囊液HA效价不低于1:4,即可判本实验结果为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品,应盲传1代后再进行判定。免疫鸡中应至少有10只鸡病毒分离阴性,对照鸡应全部为阳性。检验结果如表2所示。
表2
结果表明，细胞源禽流感疫苗与鸡胚源禽流感疫苗具有相同的免疫原性，但细胞源禽流感疫苗，明显高于细胞源禽流感疫苗。
实施例2
1、驯化培养MDCK细胞适应无血清培养基培养
使用含7％的进口胎牛血清的DMEM/D32培养液复苏MDCK冻存贴壁细胞，待细胞生长致密后进行传代。
传代后，挑选形状良好且生长良好的细胞，逐步进行驯化培养，具体步骤如下：
用进口胎牛血清含量为4％的DMEM/D32培养基连续传代培养4次；
用进口胎牛血清含量为1％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为1％，连续传代培养6次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中进口胎牛血清含量为1％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
2、驯化培养MDCK细胞适应全悬浮培养
待经过上述步骤后即可得到无血清培养的贴壁MDCK细胞，经消化、离心，得到MDCK细胞悬液，调整初始细胞密度为0.4×106cells/ml、转速设定为25r/min、温度设定为37℃、CO2含量5％，进行摇床培养，适时测定葡萄糖含量，低于1g/L进行离心换液操作。
待细胞比生长速率及细胞状态稳定后，每培养72H后进行传代，每次传代前需将密度调整为约0.4×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，第一次提高转速20r/min至45r/min，进行适应培养4代；再提高转速25r/min至70r/min，进行适应培养4代；再提高转速30r/min至100r/min，进行适应培养4代；再提高转速35r/min至135r/min，进行适应培养4代；最终再提高转速35r/min将转速提高到170r/min进行连续传代5次。保证细胞的稳定性及适应性，即可得到性能稳定的且完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的MDCK细胞株。
细胞按照上述步骤完成驯化后，得到全悬浮MDCK细胞培养72小时可达到峰值1.0×107cells/ml左右，曲线特征为近“S”型曲线，72小时后细胞进入衰退期，细胞密度开始降低。细胞倍增约为时间40～45小时。可见，本发明培养得到的无血清全悬浮培养MDCK细胞性能优异。
3、接种禽流感(H9)病毒鸡胚种毒
禽流感(H9)病毒鸡胚种毒直接接种于MDCK悬浮细胞培养步骤如下：
取经过上述步骤驯化得到悬浮MDCK细胞，置于摇瓶培养，培养72H后，待细胞密度达到1.0×107cells/ml左右时，进行离心后，弃去上清，使用无血清培养基进行重悬，进行扩增培养，逐级放大，待到细胞体系及状态，达到生物反应器的接种要求时，接种于生物反应器进行悬浮培养，一般系为1L至10L进行预培养。
随后进行逐级放大培养直至最终7000L生物反应器；待最终生物反应器细胞密度达到1.0×107.0cells/ml时，调整细胞密度使细胞密度调整为2.0×106.0cells/ml，按照MOI感染复数10-1～10-4直接接入禽流感(H9)灭活疫苗鸡胚种毒，所述禽流感(H9)灭活疫苗鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥108.5EID50，并同时加入一定量的TPCK～胰酶，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1∶4096时收获培养物,培养至细胞病变达80％以上时收获病毒液，即得。
4、疫苗制备
对上述步骤收获的病毒液进行灭活。
5、按照上述实例重复进行5次操作，禽流感病毒(H9)均可达到预期结果，结果情况如表3所示。
表3实施例1禽流感(H9)病毒测毒结果
实例 HA TCID<sub>50</sub> EID<sub>50</sub>
1 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.6</sup>
2 1∶4096 10<sup>9.6</sup> 10<sup>9.7</sup>
3 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.5</sup>
4 1∶4096 10<sup>9.7</sup> 10<sup>9.5</sup>
5 1∶4096 10<sup>9.5</sup> 10<sup>9.5</sup>
6、免疫原性检测
(1)血清学方法：用21～28日SPF鸡10只.每只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另设5只鸡不接种作为对照。接种后21日，连同对照鸡5只，分别采血，分离血清，用国家禽流感参考实验室提供的禽流感病毒H9抗原(未经细胞传代的病毒接种鸡胚制备)测定HI抗体效价。
(2)免疫攻毒法：用21～28日龄SPF鸡10只.每只颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另设5只鸡不接种作为对照。接种后21日，进行下列检验：
分5组进行实验，每组用10只免疫鸡，连同对照鸡5只，各静脉注射禽流感病毒0.2ml(含EID50＝2×107)/只,观察10日，免疫鸡应全部健活，对照鸡应全部死亡，攻毒后第5日，采集每只免疫鸡泄殖腔棉拭子，进行病毒分离，免疫鸡全部为阴性。检验结果如表4所示。
表4
结果表明，细胞源禽流感疫苗与鸡胚源禽流感疫苗具有相同的免疫原性，但细胞源禽流感疫苗，明显高于细胞源禽流感疫苗。
在所述油乳剂疫苗包括水相和油相，所述油相和水相按重量比为1.5:1混合乳化，其中，所述油相包括以下重量份主要原料：进口白油94～96份、进口亲油性表面活性剂4～8份和进口硬脂酸铝0～0.5份；
所述水相包括疫苗抗原水溶液和进口亲水性表面活性剂，所述疫苗抗原水溶液与所述进口亲水性表面活性剂的重量比为94～97：3～6；
在步骤d中，在进行所述成品质量检验时，按照《中国兽药典》的标准进行,需要将一部分待检油乳剂疫苗破乳以检测疫苗质量；
所述破乳的方法包括：
1).取权利要求1～10任一项所述的疫苗，置于-20～-30℃下，冷冻50～60h；
2)在.冷冻结束后，取出所述疫苗，置于室温下使其融化；
3).将融化后的疫苗在置于-20～-30℃下，继续冷冻50～60h；
4).在冷冻结束后，取出所述疫苗，置于室温下使其融化，之后离心就可得到破乳成功后的水相。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)驯化MDCK单层细胞，驯化培养使其适应无血清培养基及全悬浮培养环境；
(b)取经驯化培养并且细胞状态良好的MDCK全悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养，待细胞状态稳定后，接种于2L～8L的生物反应器中进行预培养，随后根据细胞状态、生长情况再逐步放大培养直至终极反应器；
(c)待终级反应器细胞密度达到4.0×106.0～1.0×107.0cells/ml，细胞状态稳定，调整反应器细胞密度为2.0×106.0～5.0×106.0cells/ml，按接种量为0.001‰～0.1‰或按照MOI感染复数10-5～10-6直接接入禽流感(H9)鸡胚种毒，接入的禽流感(H9)鸡胚种毒效价不低于1:512，每0.1ml病毒含量≥108.5EID50，同时加入TPCK～胰酶，当细胞病变率达到80％以上，病毒效价不低于1:4096时收获病毒液；
(d)将收获的病毒液进行纯化浓缩后进行病毒灭活，得到疫苗半成品，将疫苗半成品乳化处理后得到油乳剂疫苗，经成品质量检验后包装既得疫苗商品。
2.根据权利要求1所述的全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中驯化培养MDCK使其适应无血清培养基的方法为:
贴壁MDCK细胞用胎牛血清含量为7～10％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
用胎牛血清含量为4～6％的DMEM/D32培养基连续传代培养4次；
用胎牛血清含量为1～2％的DMEM/D32培养基连续传代培养2次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为2:1混合培养液培养，其中DMEM/D32培养基胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养6次；
使用DMEM/D32培养基与无血清培养基按照体积比为1:4混合培养液培养，其中DMEM/D32培养基胎牛血清含量为1～2％，连续传代培养5次；
使用无血清培养基连续传代培养4次。
3.根据权利要求2所述的全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(a)中驯化MDCK细胞适应全悬浮培养的方法为：将无血清培养基传代培养的MDCK细胞使用胰酶消化、低速离心，得到的细胞用无血清培养基以转速为25r/min进行摇床培养，培养过程中监测葡萄糖含量，低于1～1.5g/L进行换液或补加葡萄糖，待细胞生长良好、生长速率稳定后进行传代，每次传代前密度调整为0.4×106～0.6×106cells/ml，并逐步提高摇床转速，至得到完全失去黏附瓶壁能力的细胞，即为无血清悬浮培养的MDCK细胞株。
4.根据权利要求3所述的全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(b)中MDCK全悬浮细胞经摇瓶进行扩大培养的培养条件为转速100～170转/分、温度36.5±1℃、溶氧40％～70％、pH7.1±0.2，每一级扩大培养的时间为72～120小时。
5.根据权利要求1～4仍一所述的全悬浮细胞培养禽流感(H9)灭活疫苗的方法，其特征在于，所述禽流感(H9)灭活疫苗为H9亚型SS株，但包括且不限于此毒株。
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