CN110157659B - 一种bhk-21细胞系bhk-21-bp-2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种BHK‑21细胞系BHK‑21‑BP‑2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用。本发明提供BHK‑21‑BP‑2克隆株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17588。该克隆株在进行全悬浮细胞培养接种伪狂犬病毒后，细胞病变快，产生病毒毒价高，24h～48h即可收毒；收毒时只需离心收获上清，不需反复冻融，生产工艺简单；生产的病毒抗原液的总蛋白含量低，获得的有效病毒抗原完整性高，抗原质量好，具有优异的免疫原性和安全性；制备的伪狂犬病毒疫苗具有稳定性高、批间差异小、免疫效果好、安全性高的优势。

Description

一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株及其在全悬浮细胞培 养中的应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株及其在全悬浮细胞培养中的应用。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜和野生动物的急性传染病。猪是该病毒的最主要宿主，新生仔猪及15日龄以内的仔猪表现明显的神经症状，死亡率达100％；育肥猪常呈隐形感染，成年猪感染后多耐过，但长期排毒，表现为流产、死胎、木乃伊胎等。近年来，由于伪狂犬病毒发生新的变异株的流行，导致许多伪狂犬疫苗免疫猪场发生伪狂犬病。国内生产伪狂犬病疫苗的方法主要采用转瓶培养工艺，但由于该方法存在疫苗批间差异大、生产效率低、占用场地多等缺点，已经越来越不适合当前疫苗大规模生产的要求。近几年，针对伪狂犬病毒变异株的灭活苗的新产品研发成为新的研究热点。此外，随着悬浮培养生产技术的发展，利用悬浮培养生产病毒抗原的方法可进一步降低生产成本，提高产品品质。
目前，在伪狂犬病毒大规模培养方面，有利用微载体生物反应器培养伪狂犬病病毒的报道，也有利用细胞全悬浮培养伪狂犬病毒抗原的报道，其中，不依赖微载体进行细胞的全悬浮培养比微载体悬浮培养的操作更简便。专利申请CN104740627利用细胞悬浮工艺规模化生产伪狂犬弱毒活疫苗；专利申请CN105727277A利用生物反应器制备猪伪狂犬病毒疫苗。采用全悬浮细胞培养病毒时，用于生产病毒的细胞的性能以及细胞与病毒之间的适应性极大地影响病毒的产量、抗原的完整性等抗原质量，进而影响病毒制备疫苗的免疫效果和安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于全悬浮细胞培养、高效制备高质量病毒的BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，以及利用该克隆株进行全悬浮细胞培养制备病毒抗原的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17588。
本发明提供的BHK-21-BP-2克隆株为对BHK-21细胞进行人工驯化筛选获得的能够进行全悬浮培养的细胞株。乳仓鼠肾细胞BHK-21BHK-21-BP-2克隆株(以下简称BHK-21-BP-2克隆株)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.17588，建议的分类命名为乳仓鼠肾细胞BHK-21。
BHK-21-BP-2克隆株能够在培养瓶或生物反应器中不依赖于任何载体进行全悬浮培养，其适宜的最佳培养条件如下：36.5±0.5℃，pH 7.2±0.1，溶氧30％～60％。
本发明进一步提供含有所述BHK-21-BP-2克隆株的产品。
所述产品包括但不限于含有BHK-21-BP-2克隆株的试剂。所述试剂除含有BHK-21-BP-2克隆株外，还可含有其它细胞株或本领域允许的辅料。
本发明经实验证实，BHK-21-BP-2克隆株能够在接种病毒后较短时间内产生较高的毒价，并且制备的病毒抗原液的总蛋白含量较低，含有有效病毒抗原的比例高，病毒抗原的完整性高，具有良好的免疫原性和安全性。
基于BHK-21-BP-2克隆株的上述性能，本发明提供所述BHK-21-BP-2克隆株在全悬浮培养制备病毒中的应用。
作为优选，所述病毒为BHK-21细胞敏感的动物病毒。
进一步优选地，所述病毒为伪狂犬病毒。
具体地，所述应用为将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种病毒，继续培养，获得病毒液。
本发明经实验验证，BHK-21-BP-2克隆株尤其适用于伪狂犬病毒的生产，BHK-21-BP-2全悬浮细胞在接种伪狂犬病毒后，细胞病变快，产生病毒毒价高，24h～48h即可收毒；收毒时只需离心收获上清，不需反复冻融，生产工艺简单；生产的伪狂犬病毒抗原液的总蛋白含量低，获得的有效病毒抗原完整性高，抗原质量好，具有优异的免疫原性和安全性。
本发明还提供一种全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法，具体为：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中培养，接种伪狂犬病毒，继续培养，获得伪狂犬病毒。
具体地，所述全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法包括如下步骤：
(1)BHK-21-BP-2克隆株培养：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养；
(2)接种伪狂犬病毒：当所述BHK-21-BP-2克隆株的细胞密度达到4×106～6×106cells/ml时，接种伪狂犬病毒；
(3)伪狂犬病毒培养：继续培养接种伪狂犬病毒的BHK-21-BP-2克隆株，获得伪狂犬病毒液。
作为优选，上述步骤(2)中，所述伪狂犬病毒的接种量为0.01～1MOI；更优选为0.1～1MOI。
作为优选，上述步骤(1)中，所述BHK-21-BP-2克隆株培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH 7.2±0.1，溶氧30％～60％，搅拌速度60rpm～150rpm。
作为优选，上述步骤(3)中，所述伪狂犬病毒培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH 7.2±0.1，溶氧50％～60％，搅拌速度80rpm～120rpm。
上述搅拌速度可随细胞密度不同进行调整。
作为优选，上述步骤(1)中，BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮细胞培养基后的初始细胞浓度为0.4～0.8×106cells/ml。
作为优选，上述步骤(3)中，监测培养过程中的细胞的病变情况，当细胞病变达到60％～80％时，停止培养，收获病毒液。
上述制备得到的病毒液可经灭活后制备为灭活抗原，用于伪狂犬病毒灭活疫苗的制备。
作为优选，上述步骤(2)中，用于接种BHK-21-BP-2克隆株的伪狂犬病毒的种毒液的制备方法包括如下步骤：
(1)将含1％(v/v)伪狂犬病毒种毒的病毒液接种于铺满单层的BHK-21贴壁细胞，孵育1h，弃去病毒液；
(2)补充适当体积的含2％(v/v)血清的DMEM维持液，37℃培养，当细胞病变达到60％～80％时收获病毒液，-80℃反复冻融三次，取样检测病毒滴度，当0.1mL病毒含量≥107.0TCID50时保存病毒液，用于接种。
本发明中，伪狂犬病毒可以为任意现有技术中的伪狂犬病毒毒株。
作为本发明的一种实施方式，所述伪狂犬病毒为ZY-2014株(潘文，马良，张贺楠，邵葳，李晓冉，黄书林，猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定，中国兽医杂志，2016(05):1-6.)。
本发明所述的无血清全悬浮培养基可为适于BHK-21全悬浮细胞生长的不含血清的天然或合成培养基。
作为优选，所述无血清全悬浮培养基包括BHK201培养基、BS-SFM V培养基、CDBHK-21培养基、
Figure BDA0002075283920000041
VM12-SFM培养基、BHK-LSM培养基中的任意一种或多种。
上述培养基均为市售可得的商品化培养基：BHK201(壹生科深圳有限公司，产品代码：L10501)、BS-SFM V培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号BSS20314-2)；CD BHK-21培养基(gibco公司，商品编号为：A16277-03)、
Figure BDA0002075283920000051
VM12(SFM)(健顺生物，商品编号为：77017-198)、BHK-LSM(北京瑞麟和科技有限公司，商品编号为：LS-1)。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过驯化筛选获得的BHK-21-BP-2克隆株在进行全悬浮细胞培养接种伪狂犬病毒后，细胞病变快，产生病毒毒价高，24h～48h即可收毒；
(2)BHK-21-BP-2克隆株生产的病毒抗原液的总蛋白含量低，获得的有效病毒抗原具有较高的完整性，抗原质量好，具有优异的免疫原性和安全性；
(3)BHK-21-BP-2悬浮细胞接种伪狂犬病毒毒株后，在收毒时只需离心收获上清，不需反复冻融，病毒含量灭活前可达到108.5TCID50/ml以上，极大地简化了生产工艺，降低了生产成本，生产工艺稳定；
(4)利用BHK-21-BP-2悬浮细胞进行伪狂犬病毒灭活疫苗的大规模生产，制备的伪狂犬病毒疫苗具有稳定性高、批间差异小；与商品苗相比免疫效果好、疫苗安全性高、无副反应，具有优异的伪狂犬病防控效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中3株BHK-21悬浮克隆株接毒后的细胞数比较结果，其中BP-1株代表BHK-21-BP-1克隆株，BP-2株代表BHK-21-BP-2克隆株，BP-3株代表BHK-21-BP-3克隆株。
图2为本发明实施例1中3株BHK-21悬浮克隆株接毒后的毒价(上清)比较结果，其中BP-1株代表BHK-21-BP-1克隆株，BP-2株代表BHK-21-BP-2克隆株，BP-3株代表BHK-21-BP-3克隆株。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 BHK-21贴壁细胞的悬浮驯化
将冻存的不同来源的3株BHK-21贴壁细胞克隆株进行复苏，使用含有8％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液(Hyclone公司产品，产品代码：SH30022.01)在75cm2细胞培养瓶中培养。在细胞长成致密单层且生长状态良好时弃去原培养液，加入0.25％胰蛋白酶进行消化，用移液枪吹打分散细胞成单细胞悬液，以1×106cells/ml的密度分别接入到250ml三角摇瓶中，使用原培养基(含有8％(v/v)胎牛血清的DMEM)与悬浮培养基BHK201以不同比例混合的培养基进行培养，细胞培养过程中逐步减少原培养基与悬浮培养基的比例，每次传代使用的原培养基与悬浮培养基的配比分别为75:25、50:50、25:75、最终为100％悬浮培养基，上述每个配比的培养基使细胞稳定传代后再进入下一个配比的培养基，培养条件为5％CO2，37℃，120rpm。最终获得3株BHK-21悬浮克隆株，分别命名为BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3，结果如表1所示。
表1 3株BHK-21悬浮克隆株的悬浮驯化过程结果
Figure BDA0002075283920000061
Figure BDA0002075283920000071
注：+号表示细胞大小程度。
实施例2 3株BHK-21悬浮克隆株的筛选和性能分析
1、产毒效果分析
将实施例1中获得的BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3共3株BHK-21悬浮克隆株分别在250ml细胞摇瓶中培养，悬浮培养的培养基为BHK201，培养体积为30～50ml，培养条件为5％CO2，37℃，120rpm。培养48h后按照MOI＝0.5分别接种伪狂犬病病毒ZY-2014株，分别于接毒前0h、接毒后24h、40h、48h、72h、96h对不同生长阶段的细胞进行取样计数和测定毒价(上清)。取样时，不需冻融，将样品离心后直接测定样品的上清毒价。
结果如图1和图2所示，悬浮细胞BHK-21-BP-2克隆株与其他两株克隆株相比，在培养细胞数较低(细胞数为4.5×106cells/ml)时在细胞上清中即可产生较高的毒价；同时细胞病变快，在接毒后40h病变就达到70％，即可收毒，收毒时间早，毒价为108.7TCID50/ml；而BHK-21-BP-1株在接毒后48h毒价达到最高，毒价为108.42TCID50/ml；BHK-21-BP-3株在接毒后72h毒价达到最高，毒价为108.43TCID50/ml。与BHK-21-BP-1株和BHK-21-BP-2株相比，BHK-21-BP-3株的细胞病变较慢。三株克隆株产毒毒价上差异不大，但在产毒时间上存在明显差异。
2、3株BHK-21悬浮克隆株生产的抗原液的质量分析
将BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3共3株BHK-21悬浮克隆株分别在500ml细胞摇瓶中培养，悬浮培养的培养基为BHK201，培养体积为150ml，培养条件为5％CO2，37℃，120rpm。培养48h后按照MOI＝0.5分别接种伪狂犬病病毒ZY-2014株，当细胞病变达到60％～80％时收获病毒液，不需反复冻融，5000r/min、4℃离心30min去沉淀，收获上清，即得伪狂犬病毒抗原液。对培养后得到的抗原液(上清)，测定毒价；同时用LORRY法测定总蛋白，比较三种抗原的总蛋白量；并用蔗糖密度梯度离心比较有效抗原含量。
使用改良型Lowry法蛋白浓度测定试剂盒(Modified lowry protein assay kit，Thermo公司)对BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3三株细胞生产的三份抗原液进行测定，具体操作如下：
(1)根据说明书提供的比例将BSA标准品配制为0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、25μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml各浓度的标准样品；
(2)根据需要量，配制1×福林-酚试剂；
(3)将40μl的各浓度的标准样品和三份抗原液分别加入96孔板中，每种抗原液重复三次；
(4)使用排枪在每个加样孔中加入200μl的Modified lowry试剂，在振荡器上混合30秒，在室温下避光孵育10min；
(5)加入20μl的1×福林-酚试剂，在振荡器上混合30秒，在室温下避光孵育30min；
(6)用酶标仪测定A750nm的吸光度并计算蛋白浓度。
使用蔗糖密度梯度离心对BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3三株细胞生产的三份抗原液进行有效抗原(抗原完整性)测定，具体方法如下：
(1)将收获的三种抗原液上清各100ml于4℃、27000r/min离心1h，将沉淀用1ml的0.01mol/L PBS(pH 7.2)重悬。
(2)以PBS制备20％(W/V，以下同)、35％、45％和60％的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4℃、27000r/min离心2h。
(3)收集45％浓度处的蛋白带至离心管中，用30ml PBS稀释重悬，27000r/min离心2h脱糖。
(4)最后用1ml PBS悬浮沉淀，进行毒价测定。
以上总蛋白浓度测定和抗原完整性测定结果如表2所示。
表2 3株BHK-21悬浮克隆株生产的抗原液的质量分析
Figure BDA0002075283920000091
结果表明，BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3这3株克隆株生产的抗原液的毒价差异不大，但是总蛋白含量存在明显差异，其中，BHK-21-BP-2克隆株生产的抗原液的蛋白含量为1215.4μg/ml，总蛋白含量最低，同时BHK-21-BP-2克隆株生产的抗原液通过蔗糖密度梯度离心后在45％浓度处收获的蛋白带所测毒价也最高(107.9TCID50/ml)，证明BHK-21-BP-2克隆株与BHK-21-BP-1和BHK-21-BP-3克隆株相比，生产的抗原液中具有感染性的伪狂犬完整抗原更多(比例更高)。
3、抗原的安全性与免疫原性分析
取上述2中BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3三株克隆株悬浮细胞接种狂犬病病毒ZY-2014株后在最佳收毒时机得到的三种抗原液，分别按照病毒液总量的0.2％(v/v)向病毒液中加入甲醛溶液，充分振荡后，于37℃、100rpm摇床上灭活48h。灭活后分别与油佐剂Montanide ISA 201VG(购自赛彼科上海特色化学品有限公司)按1:1(质量比)混合，制备三批伪狂犬病病毒灭活疫苗。
选取36头30～40日龄的伪狂犬抗体阴性仔猪，分为A、B、C、D、E、F共6组，每组6头。A、B、C三组进行安全性试验，分别免疫上述制备的三批次疫苗，4.0ml/头肌肉注射，共观察14天，观察仔猪的局部反应和临床症状。D、E、F三组分别免疫制备的三批次疫苗，2.0ml/头肌肉注射，28天测定各组的平均中和抗体效价，用伪狂病病毒ZY-2014株攻毒，滴鼻接种，每头猪2.0ml，攻毒剂量为105.0TCID50/ml头，攻毒后观察14天。
结果如表3和表4所示，结果表明，BHK-21-BP-2株悬浮细胞制备的伪狂犬疫苗相比BHK-21-BP-1株和BHK-21-BP-2株的安全性更好，攻毒后保护率能达到100％。
表3 3株BHK-21悬浮克隆株生产抗原的安全性试验结果
Figure BDA0002075283920000101
表4 3株BHK-21悬浮克隆株生产抗原的免疫原性试验结果
组别/克隆株 平均中和抗体效价 保护率
D/BHK-21-BP-1 1:7.8 83.3％
E/BHK-21-BP-2 1:18.2 100％
F/BHK-21-BP-3 1:6.5 66.6％
综上所述，BHK-21-BP-1、BHK-21-BP-2、BHK-21-BP-3三株细胞中，悬浮细胞BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株接种伪狂犬病毒后24h～48h即可收毒，细胞病变快，毒价高；只需离心收获上清即可获得抗原液，不需反复冻融，制备方法简便；生产抗原的总蛋白含量低，获得的有效抗原更完整，疫苗安全性好无副反应，免疫28天中和抗体效价达到1:18.2，免疫效果好；综合性能较其他两株细胞具有明显优势，因此，BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株更适合用于病毒抗原的生产，尤其是伪狂犬病病毒的生产。
BHK-21-BP-2克隆株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.17588，建议的分类命名为乳仓鼠肾细胞BHK-21。
实施例3 BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株悬浮细胞在生物反应器中培养
将BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株在摇瓶中悬浮培养1～3代，扩增至10L生物反应器培养接种所需的细胞数，转移至10L生物反应器中，并补加悬浮培养基BHK201，使细胞终浓度为0.4～0.8×106cells/ml。在36.5±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值30％～60％，搅拌速度60rpm～150rpm(搅拌速度随着细胞密度不同而不同)条件下，培养48h～72h，当反应器内的细胞密度达到3～6×106cells/ml时，用于进一步放大培养或接毒。
实施例4利用生物反应器生产猪伪狂犬病病毒ZY-2014株抗原
1、伪狂犬病病毒ZY-2014株种毒的制备
将含1％(v/v)伪狂犬病病毒ZY-2014株种毒的病毒液接种于铺满单层的BHK-21贴壁细胞，孵育1h，弃去病毒液，补充适当体积的含2％(v/v)血清DMEM(购自HyClone公司，商品编号SH30022.01)维持液，37℃培养；当细胞病变达到60％～80％时收获病毒液，-80℃反复冻融三次，取样检测病毒滴度，当0.1mL病毒含量应≥107.0TCID50时保存病毒液待用。
2、利用生物反应器生产猪伪狂犬病病毒ZY-2014株抗原
取摇瓶或生物反应器培养48h～72h的BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株悬浮细胞，对细胞进行计数，计数后接入新的生物反应器中，加入适量新鲜悬浮培养基BHK201稀释细胞浓度为0.5×106cells/ml，在36.5±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值30％-60％，搅拌速度60rpm～150rpm进行培养。每日取样监测生物反应器中细胞浓度，培养48h后，接毒前细胞密度达到5.0×106cells/ml。根据生物反应器中的细胞总数按照MOI＝0.5的接毒剂量接入上述步骤1制备的伪狂犬病病毒ZY-2014株种毒。接种病毒后的培养参数为：温度为36.5±0.5℃，pH值为7.2±0.1，DO值50％～60％，搅拌速度80rpm～120rpm。接毒后监测细胞活率，接毒后培养38h，细胞死亡率达到60％～80％以上，不需反复冻融，离心收获病毒液(上清)，-80℃保存。对收获的伪狂犬病病毒液进行病毒含量测定，病毒含量为108.7TCID50/ml。
实施例5伪狂犬病病毒ZY-2014株灭活抗原的应用
1、按照实施例4的方法，制备3批次伪狂犬病病毒ZY-2014株抗原，病毒含量分别为108.75TCID50/ml、109.0TCID50/ml、108.67TCID50/ml。使用这三批次抗原进行纯净性检验，经灭活后分别稀释三批次抗原，将这三批次抗原的病毒含量均调整为107.5TCID50/ml，再分别与油佐剂Montanide ISA 201VG按1:1(质量比)混合，制备三批次伪狂犬病病毒ZY-2014株灭活疫苗。
2、选取30头30～40日龄的伪狂犬抗体阴性仔猪，分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5组，每组6头，I、Ⅱ、Ⅲ三组分别免疫步骤1制备的三批次疫苗，2.0ml/头肌肉注射，Ⅳ组免疫猪伪狂犬病灭活疫苗鄂A株(批号1711012)，2.0ml/头肌肉注射，Ⅴ组为未免疫阳性对照组，28天进行加强免疫，加强免疫后21天用伪狂犬病病毒ZY-2014株攻毒，滴鼻接种，每头猪2.0ml，攻毒剂量为105.0TCID50/ml头，攻毒后观察14天。
结果表明，攻毒后，Ⅴ组未免疫阳性对照组100％死亡，表明毒株符合攻毒要求，I、Ⅱ、Ⅲ三组所有仔猪无临床症状，表现正常，二免后中和抗体效价均大于1:16；Ⅳ组有2只仔猪有临床症状，保护率为66.7％，二免后中和抗体效价小于1:8。
将上述三批次伪狂犬病病毒ZY-2014株灭活疫苗在2～8℃保存3、6、9、12个月后进行安全性检验，仔猪接种后无过敏反应，14日内仔猪全部健活，无不良反应。
综上所述，采用生物反应器生产的三批伪狂犬病病毒ZY-2014株抗原，具有稳定性好，批间差小的特点，利用这三批伪狂犬病病毒ZY-2014株抗原制备的三批疫苗较商品苗的保护效果更好，对于防治伪狂犬变异株的感染具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种BHK-21细胞系BHK-21-BP-2克隆株，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17588。
2.含有权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株的产品。
3.权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株或权利要求2所述产品在全悬浮培养制备病毒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述病毒为BHK-21细胞敏感的动物病毒。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物病毒为伪狂犬病毒。
6.根据权利要求3~5任一项所述的应用，其特征在于，将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种病毒，继续培养，获得病毒液。
7.一种全悬浮细胞培养制备伪狂犬病毒的方法，其特征在于，将权利要求1所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养，接种伪狂犬病毒，继续培养，获得伪狂犬病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）BHK-21-BP-2克隆株培养：将所述BHK-21-BP-2克隆株接种于无血清全悬浮培养基中进行培养；
（2）接种伪狂犬病毒：当所述BHK-21-BP-2克隆株的细胞密度达到4×106~6×106 cells/ml时，接种伪狂犬病毒；
（3）伪狂犬病毒培养：继续培养接种伪狂犬病毒的BHK-21-BP-2克隆株，获得伪狂犬病毒液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述伪狂犬病毒的接种量为0.01~1 MOI。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述伪狂犬病毒的接种量为0.1 ~1MOI。
11.根据权利要求7~10任一项所述的方法，其特征在于，所述BHK-21-BP-2克隆株培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH 7.2±0.1，溶氧30%~60%，搅拌速度60 rpm ~150rpm；
和/或，
所述伪狂犬病毒培养的条件如下：温度36.5±0.5℃，pH 7.2±0.1，溶氧50% ~ 60%，搅拌速度80 rpm ~120 rpm。
12.根据权利要求7~10任一项所述的方法，其特征在于，所述无血清全悬浮培养基包括BHK201培养基、BS-SFM V培养基、CD BHK-21培养基、Celkey® VM12-SFM培养基、BHK-LSM培养基中的任意一种或多种。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述无血清全悬浮培养基包括BHK201培养基、BS-SFM V培养基、CD BHK-21培养基、Celkey® VM12-SFM培养基、BHK-LSM培养基中的任意一种或多种。
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