CN110272864B - 一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法、应用，属于兽医生物学技术领域，所述Vero33细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17694，保藏日期为2019年5月27日，其驯化方法为：1.贴壁Vero细胞的传代与培养；2.驯化贴壁Vero细胞适应低血清悬浮培养基；3.驯化Vero细胞适应无血清悬浮培养环境。同时本发明提供了无血清悬浮培养Vero33细胞在生产猪流行性腹泻病毒和鸡传染性法氏囊病毒中的应用及方法，可以在无血清的条件下，全悬浮培养病毒，扩大生产规模，满足GMP生产技术要求，有更好的市场前景。

Description

一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株及其驯化方法和 应用

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及无血清全悬浮Vero33细胞的驯化方法及在兽用疫苗抗原生产中的应用。

背景技术

悬浮培养工艺已经广泛应用于生物制药领域，而且已经在生物制药领域展现出了明显的优势。与转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术的最大优势在于：第一、单位面积内有效工作细胞数量增加；第二、全封闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量获得提高；第四、生产疫苗所用的劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。

全悬浮培养工艺是一种不依赖血清和载体的细胞培养工艺。利用悬浮培养驯化的方法将Vero贴壁细胞(非洲绿猴肾细胞)驯化为无血清全悬浮培养的Vero细胞，并通过筛选获得高病毒产量的悬浮细胞株，应用于兽用疫苗抗原猪流行性腹泻变异株和传染性法氏囊流行株的无血清全悬浮生产，实现抗原生产工艺和质量的提升，生产成本的降低。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种无血清全悬浮培养的Vero33细胞株及该细胞在培养兽用疫苗抗原中的应用，所述Vero33细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.17694，保藏日期为2019年5月27日。该VERO33细胞株降低生产成本，提高下游纯化的效率，快速稳定的扩大生产规模，质量实现均衡稳定。

同时本发明设计了上述的适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株的驯化方法，所述驯化方法包括以下步骤：

(1)制备用贴壁细胞的传代与培养

将复苏后的Vero细胞置于含8％胎牛血清的MEM-NEA培养液中进行培养，待Vero细胞长满单层时，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA 37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％胎牛血清的MEM-NEA细胞培养液终止消化，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2-3代；

(2)驯化贴壁细胞适应低血清悬浮培养基

取长满单层Vero贴壁细胞的培养瓶，用0.25％胰蛋白酶-EDTA 37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％胎牛血清的MEM-NEA细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清液；用含2％胎牛血清的Vero601悬浮培养基重悬细胞，混匀并计数，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到摇瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为150r/min，观察并计数，连续传代5～6代，待细胞密度大于2×10⁶cells/ml，活率>95％，细胞生长稳定，认为Vero细胞已适应低血清培养基培养；

(3)驯化细胞适应无血清悬浮培养环境

取处于对数生长期的已适应低血清悬浮培养的Vero细胞，活率＞95％。接种于无血清悬浮培养基Vero601中，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，于37℃、含5％的CO2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min，对培养的细胞进行细胞计数和活率检测，继续传代至第5～7代。活率>95％，细胞生长稳定，认为Vero细胞已适应无血清培养基悬浮培养，将此培养得到的Vero细胞命名为Vero33细胞。

另外，本发明还公开了上述的适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株在培养疫苗病毒中的应用。

进一步的，上述的适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞株可以用在猪流行性腹泻病毒和鸡传染性法氏囊病毒的培养中。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明提供了驯化Vero贴壁细胞成为无血清全悬浮培养的Vero33细胞的方法。并提供了利用驯化后全悬浮无血清培养的Vero33细胞生产猪流行性腹泻地方株病毒和鸡传染性法氏囊病毒的应用。本发明Vero33细胞在无血清悬浮培养生产疫苗中不使用含血清的培养基，减少下游加工程序，并能提高细胞密度及生物制品的产率。因此，本发明提供无血清悬浮培养Vero33细胞生产猪流行性腹泻地方株病毒和传染性法氏囊病毒的方法可以显著降低生产成本，同时提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

附图说明

图1是为实施例3中悬浮Vero33细胞培养猪流行性腹泻病毒(CV777)的免疫荧光图；A和C表示接毒组的细胞和对应荧光图，B和D表示未接毒组的细胞和对应荧光图

图2为实施例4中悬浮Vero33细胞培养PEDV抗原制备猪流行性腹泻灭活疫苗(CV777)免疫后抗体趋势图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

在Vero细胞无血清悬浮驯化过程中，Vero贴壁细胞购自ATCC，所采用的MEM-NEA培养液和Vero601悬浮培养基均购自壹生科(深圳)有限公司；胰蛋白酶购自Gibco公司。

本实施例公开了一种适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞，该细胞保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17694，保藏日期为2019年5月27日。该Vero33细胞通过将冻存的Vero细胞复苏后，置于有血清培养液中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化成适应无血清全悬浮培养的Vero33细胞。具体包括如下步骤：

步骤1细胞复苏

从液氮罐中取出冻存的Vero贴壁细胞，在37℃水浴中快速摇动使其迅速融化，以800r/min离心5min，弃上清液，用适量含8％胎牛血清的MEM-NEA细胞培养液重悬，移入细胞瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养至长满单层。

步骤2细胞传代

待Vero细胞长满单层时，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％FBS MEM-NEA细胞培养液终止，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的传代比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2-3代；

步骤3Vero细胞低血清悬浮驯化

取长满单层的Vero贴壁细胞的培养瓶，用适量0.25％胰蛋白酶-EDTA 37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％胎牛血清MEM-NEA细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清液。用含2％胎牛血清的Vero601悬浮培养基重悬细胞，混匀，计数，制成细胞悬液，将细胞悬液转移到摇瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为150r/min，观察并计数，连续传代5～6代，没代培养72h，待细胞密度大于2×10⁶cells/ml，活率>95％，细胞生长稳定，认为Vero细胞已适应低血清培养基培养。

步骤4Vero细胞无血清悬浮驯化

取处于对数生长期的已适应低血清悬浮培养的Vero细胞，活率＞95％，接种于无血清的Vero601悬浮培养基中，接种密度为0.5×10⁶cells/ml，于37℃、含5％的CO2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min，对培养的细胞进行细胞计数和活率检测，继续传代至第5～7代，每代培养72h。活率>95％，细胞生长稳定，认为Vero细胞已适应无血清培养基培养。将已适应无血清悬浮培养的Vero悬浮细胞，命名为Vero33细胞。

步骤5将Vero33细胞在无血清的悬浮培养基中连续传代5代后，冻存部分细胞，并取部分细胞按照现行版《中国兽药典》对Vero33细胞进行生物学特性检验。

实施例2

本实施例设计了猪流行性腹泻病毒(CV777)在无血清培养系统中的增殖培养方法，该培养过程中所采用，

1.病毒：猪流行性腹泻病毒(CV777)，购自中国兽医药品监察所。

2.细胞：全悬浮Vero33细胞，为按照实施例1的方法驯化的细胞。

3.培养基：Vero601悬浮培养基和MEM-NEA培养基，由壹生科(深圳)有限公司供应。

具体的增值方法包括如下步骤：

步骤1猪流行性腹泻贴壁细胞毒种的繁殖

用病毒培养液将猪流行性腹泻病毒PEDV(CV777)毒种按5％(v/v)的比例接种到生产用种子贴壁细胞单层中进行培养，至细胞80％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，在Vero贴壁细胞上进行细胞适应性连续传代培养，直至TCID₅₀稳定到10^8.5/ml。收获的毒液作为PEDV(CV777)种毒液F1代。

步骤2猪流行性腹泻病毒(CV777)的悬浮培养

将实施例1所述的驯化方法培养得到的Vero33细胞置于Vero601培养液中，于37℃、含5％的CO2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min。待Vero33细胞活率>95％，细胞生长稳定，活细胞数达到5×10⁶后，分别以病毒接种量MOI为0.01、0.05和0.3的剂量接入PEDV(CV777)病毒液F1代，吸附1小时后，加入Vero601培养基作为维持液；然后置于37℃体积百分数为5％的CO₂培养箱中摇床培养，培养转速为140r/min，分别在培养后24h、48h、72h和96h取样进行细胞计数，并留样冻融2-3次后进行TCID₅₀检测，以不同病毒接种量接种的三批样品的数据如下表所示。

表1全悬浮培养PEDV(CV777)不同培养时间的TCID₅₀检测结果

从表中可以看出，通过用不同的病毒接种量MOI接中PEDV(CV777)，分别在培养后24h、48h、72h和96h取样进行TCID₅₀检测，结果表明按照病毒接种量为0.01MOI～0.3MOI进行病毒接种，在培养后48h的病毒滴度最高，均能够符合《中国兽药典》的要求，随着病毒接种量的增加，抗原的效价也有所提高。因此用适应全悬浮无血清的Vero33传代细胞系作为猪流行性腹泻病毒培养的靶细胞，培养的抗原滴度能够符合《中国兽药典》的要求，节约了生产成本，简化了生产步骤，经济效益显著，应用前景广阔。

实施例3

猪流行性腹泻病毒侵染Vero33悬浮细胞的免疫荧光检测所用的试剂：

PEDV单克隆抗体，购买自北京金诺百特科技有限公司，货号9191。

荧光二抗Goat anti-Mouse IgG(H+L)Superclonal^TMSecondary Antibody,AlexaFluor 488(Invitrogen^TM)，购买自ThermoFisher Scientific。

将猪流行性腹泻病毒(CV777)接种到悬浮培养的Vero33细胞，培养48h后取接毒后样品用PBS洗两遍，留少量的上清将细胞悬起来，将悬起来的细胞铺于96孔细胞培养板中，待干燥后；用80％的丙酮于4℃固定30min；按照200μl/孔将PBS加入96孔细胞培养板中，清洗两遍；每孔加入经100倍稀释的PEDV单克隆抗体100μl/孔，37℃培养箱中孵育1h；按照200μl/孔将PBS加入96孔细胞培养板中，清洗三遍；每孔加入经400倍稀释的荧光二抗100μl/孔，避光37℃培养箱中孵育1h；按照200μl/孔将PBS加入96孔细胞培养板中，清洗三遍；用荧光显微镜观察。

结果表明接种猪流行性腹泻病毒(CV777)的Vero33细胞有明显的荧光，而未接种病毒的细胞则无荧光(如图1所示)。

实施例4

猪流行性腹泻灭活疫苗(CV777)在疫苗制备过程中所采用的试剂：

1.病毒：猪流行性腹泻病毒为PEDV(CV777)，购自中国兽医药品监察所。

2.Vero33细胞：全悬浮Vero33细胞，为按照实施例1的方法驯化的细胞。

3.培养基：无血清Vero601悬浮培养基和MEM-NEA培养基，由壹生科(深圳有限公司供应。

4.Seppic MONTANIDETM ISA 201VG佐剂购自Seppic公司

步骤1猪流行性腹泻抗原的制备

将实施例1所述的驯化方法培养得到的Vero33细胞置于无血清Vero601悬浮培养基中，于37℃、含5％的CO2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min。待Vero33细胞活率>95％，细胞生长稳定，活细胞数达到6×10⁶后，以病毒接种量MOI为0.05的剂量接入PEDV(CV777)种毒液，吸附1小时后，加入无血清Vero601培悬浮养液作为维持液；然后置于37℃体积百分数为5％的CO₂培养箱中培养，培养转速为140r/min，在培养48h后取样进行细胞计数，收获抗原液并进行TCID₅₀检测，抗原液的TCID₅₀检测结果为10^7.8/ml，符合配苗要求。

步骤2猪流行性腹泻灭活疫苗(CV777)的制备

按照猪流行性腹泻灭活疫苗的生产工艺对抗原进行灭活，经灭活检验合格。根据Seppic MONTANIDETM ISA201VG佐剂的使用说明书进行乳化，制备一批实验室试制疫苗，疫苗批号为DC-P011。

步骤3疫苗的免疫原性试验

将养殖场的妊娠母猪随机分为2组，免疫组母猪分别在产前40天与产前15天，分别进行一次后海穴PEDV灭活疫苗接种，每头4ml，对照组不接种作为对照。一次免疫前、二次免疫前、二次免疫后7天分别采集母猪血清进行抗体检测。记录母猪免疫前和免疫后抗体的变化情况，并对各组间中和抗体进行显著性差异分析。

表2试验组猪流行性腹泻抗体变化情况

*表示和对照组相比有显著性差异

从表中可以看出，通过用Vero33细胞悬浮培养生产的猪流行性腹泻抗原制备的疫苗免疫妊娠母猪，免疫后抗体效价和对照组相比有显著的提高(如表2，图2所示)。表明，用Vero33悬浮细胞培养的猪流行性腹泻流行病毒具有很好的免疫原性。

实施例5

本发明实施例5所用材料来源如下：

1.病毒：鸡传染性法氏囊病病毒(B87)，购自中国兽医药品监察所。

2.Vero33细胞：实施例1制备的全悬浮Vero33细胞。

3.培养基：无血清Vero601悬浮培养液和MEM-NEA培养基，由壹生科(深圳)有限公司供应。

步骤1细胞的复苏传代

从液氮罐中取出冻存的Vero33细胞，置于37℃水浴融化后加入到约20ml的培养基中，经离心机300g离心10min，去掉上清液，使用125ml三角摇瓶将细胞重悬于20ml的培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中，轨道摇床转速设置为150r/min，进行悬浮培养传代，并扩大培养至200ml，待Vero33细胞活率>95％，细胞生长稳定，活细胞数达到6×10⁶进行细胞接毒培养；

步骤2不同接毒量及培养时间对鸡传染性法氏囊病病毒在Vero33无血清全悬浮细胞中增殖的影响

取步骤1中所得Vero33悬浮细胞悬液80ml，平均分装至4个摇瓶，每瓶20ml，分别标记为实验组1、实验组2、实验组3、对照组；使用IBDV(B78)按1MOI，0.1MOI，0.01MOI，0.001MOI分别接种上述四个实验，IBDV(B78)原始毒价10^7.3TCID₅₀/ml；病毒接种后，将摇瓶放置在37℃、5％的CO2培养箱中，吸附培养1小时；吸附完成后，向各组补加20ml的病毒培养基，并放回到37℃、5％CO2培养箱中继续培养，轨道摇床转速为150r/min；在培养的第24、48、72、96小时分别收取样品，置于-80℃保存备用。所有样品收获完成后，进行TCID₅₀检测。

表3全悬浮培养IBDV(B78)不同接毒量、不同培养时间的TCID₅₀检测结果

从TCID₅₀数据可以看出，IBDV(B78)能在全悬浮培养的Vero33无血清全悬浮细胞中增殖，增殖受到接毒量和培养时间的影响，在接毒量过低或者过高都不能达到最佳的培养效果，当接毒量为0.01MOI，接毒后培养72h后，所得到IBDV的TCID50滴度最高(10^8.5/mL)，表明全悬浮培养的Vero33细胞能够培养IBDV(B78)，并能达到较高的病毒滴度。

综上所述，本发明实施例通过以无血清悬浮驯化的Vero33悬浮细胞作为猪流行性腹泻病毒和鸡传染性法氏囊病毒的靶细胞，采用无血清、全悬浮的培养基对猪流行性腹泻和鸡传染性法氏囊病病毒进行全悬浮培养，具有以下优势：1)成本低：无血清、无载体、低人工、低净化面积；2)操作简便，稳定性高；3)副反应低：低血清、低杂蛋白；4)适合大规模生产：自动化生物反应器。利用悬浮驯化的Vero33悬浮细胞对病毒进行悬浮培养能够有效的促进疫苗产业的升级，具有很好的应用前景。

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

Claims (3)

1.一种适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株，所述Vero33细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17694，保藏日期为2019年5月27日。

2.根据权利要求1所述的适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株在培养疫苗病毒中的应用。

3.根据权利要求2所述的适应无血清悬浮培养的Vero33细胞株在培养疫苗病毒中的应用，其特征在于，所述疫苗病毒包括猪流行性腹泻病毒和鸡传染性法氏囊病毒。

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