CN104862270B - 一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用 - Google Patents

一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化vero细胞。本发明采用逐渐减少血清含量的培养方法对vero细胞进行驯化培养，以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后的vero能在VP‑SFM中连续传代培养至少50代。

Description

一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，更具体地说，涉及一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其在猪流行性腹泻病毒增殖培养方法中的应用。
背景技术
目前，国内在动物疫苗的生产过程中，传代细胞及病毒的增殖培养大多含有牛血清。因为牛血清是天然培养基，所以其来源有限，价格连年上涨，增加了疫苗生产的原材料成本；牛血清组分不明确、不稳定，批次间的差异影响了疫苗产品的稳定性；另外，血清供应链存在一定风险，有潜在的外源病原污染风险。而无血清(VP-SFM)培养系统无动物源成分、无蛋白及蛋白水解物、无生长因子并且化学成分明确、原料安全、供应链广。用无血清培养动物细胞进行病毒繁殖、疫苗生产是目前生物医药产业新技术的发展方向。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其在猪流行性腹泻病毒增殖培养方法中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后置于血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的方法驯化vero细胞。
本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，包括以下步骤：
(1)将冻存的vero细胞复苏；
(2)将复苏后的vero细胞置于血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:3进行消化传代培养；
(3)将步骤(2)得到的vero细胞置于混合培养液Ⅰ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养；
(4)将步骤(3)得到的vero细胞置于混合培养液Ⅱ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养；
(5)将步骤(4)得到的vero细胞置于混合培养液Ⅲ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养；
(6)将步骤(5)得到的vero细胞置于无血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养，即得适用于无血清培养系统的vero细胞。
本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述血清培养液为含体积百分数为8％的胎牛血清的DMEM培养液；所述无血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液；所述混合培养液Ⅰ是由体积百分数为80％的血清培养液和体积百分数为20％的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅱ是由体积百分数为50％的血清培养液和体积百分数为50％的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅲ是由体积百分数为20％的血清培养液和体积百分数为80％的无血清培养液组成的混合培养液。在细胞驯化过程中，配制混合培养液时，应先分别将血清营养液及无血清营养液配制好后，再按照不同比例混合。
本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述胎牛血清购自gibco公司，批号为1128144；所述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZH1194；所述VP-SFM培养液购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
本发明所述的适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，其中，所述消化液Ⅰ为由质量百分数为0.25％的胰酶和质量分数为0.02％的EDTA的Hank′s液组成的EDTA-胰酶消化液；所述消化液Ⅱ为TrypLE select,购自gibco公司，批号为1596842。
本发明还提供一种猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，包括如下步骤：
(1)将经权利要求1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM培养液的vero细胞长成单层细胞后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3％的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液；然后置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，每天观察单层细胞的病变情况；当70％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液F1代；
(2)将步骤(1)中的病毒液F1代再以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM培养液的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液F2代；
(3)将步骤(2)中的病毒液F2代以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液F3代。
本发明所述的猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其中，所述维持液由体积百分数为0-80％的DMEM培养液和体积分数为20-100％的含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液组成的混合培养液。
本发明所述的猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其中，所述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZH1194；所述VP-SFM培养液购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
实施本发明的一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其在猪流行性腹泻病毒增殖培养方法中的应用，具有以下有益效果：
(1)采用逐渐减少血清含量的无血清培养方法对vero细胞进行驯化培养，以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后的vero能在VP-SFM中连续传代培养至少50代。
(2)将猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)接种在经上述方法驯化后的适应VP-SFM的vero中进行传代增殖培养，摸索其在不含血清条件下的培养增殖条件。结果显示，在经驯化后的vero中，当病毒维持液为由体积分数为80％的DMEM培养液及体积分数为20％的无血清培养液组成的混合营养液时，PEDV毒能在该无血清条件下连续传代培养3代，均能产生明显细胞病变，病毒含量可达107.33TCID50/ml，与有血清培养的PEDV毒的毒价相当。所述无血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是经驯化后的vero细胞在无血清培养液，即含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM中传代增殖培养50代时的细胞形态图；
图2是正常的未经驯化的vero细胞在含8％胎牛血清的DMEM液中传代增殖培养50代时的细胞形态；
图3是在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含体积百分数为80％的DMEM的无血清培养液)；
图4是在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含体积百分数为50％的DMEM的无血清培养液)；
图5是在未经驯化的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含体积百分数为2％的胎牛血清的DMEM液)；
图6是未接PEDV毒的经驯化的vero细胞形态对照图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1
一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养液中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化vero细胞。
具体包括如下步骤：
(1)将冻存的vero细胞复苏；
(2)将复苏后的vero细胞置于含8％胎牛血清的DMEM培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:3进行消化传代培养，培养2-3代；
(3)将步骤(2)得到的vero细胞置于由体积百分数为80％的有血清培养液和体积百分数为20％的无血清培养液组成的混合培养液Ⅰ中进行培养，待vero细胞长满单层时(约48小时)，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养，培养2-3代；
(4)将步骤(3)得到的vero细胞置于由体积百分数为50％的有血清培养液和体积百分数为50％的无血清培养液组成的混合培养液Ⅱ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养，培养2-3代；
(5)将步骤(4)得到的vero细胞置于由体积百分数为20％的有血清培养液和体积百分数为80％的无血清培养液组成的混合培养液Ⅲ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养，培养2-3代；
(6)将步骤(5)得到的vero细胞置于无血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:(2-3)进行消化传代培养，培养2-3代。驯化后的vero细胞能在无血清培养液(含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM)中稳定传3代，并能保持良好的状态，说明细胞已适应无血清培养液，这时可以扩大传代比例至1:(3-4)，并冻存细胞。
vero细胞在驯化过程中所用的消化液Ⅰ为由质量体积分数为0.25％的胰酶(胰酶规格为1:250)和质量体积分数为0.02％的EDTA的Hankˊs液组成的EDTA-胰酶消化液。vero细胞在驯化后(即在完全无血清培养条件下)所用的消化液Ⅱ为TrypLE select，购自gibco公司，批号为1596842。
在细胞驯化过程中，配制混合培养液时，应先分别将血清营养液及无血清营养液配制好后，再按照不同比例混合。步骤(3)-(5)中的血清培养液为含体积百分数为8％的胎牛血清的DMEM培养液；所述无血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液。所述的胎牛血清购自gibco，批号为1128144；DMEM购自Hyclone,批号为NZH1194；VP-SFM购自gibco公司，批号为1637720；L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。L-谷氨酰胺用蒸馏水配制成200mM/L溶液后，0.22μm滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。
实施例2
猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)在无血清培养系统中的增殖培养方法，所采用的DMEM购自Hyclone,批号为NZH1194；VP-SFM购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
具体包括如下步骤：
(1)将实施例1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM的vero细胞长成单层后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3％的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ；然后置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，每天观察单层细胞的病变情况，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,记录为病毒液ⅠF1代；
(2)将病毒液ⅠF1代再以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅠF2代；
(3)将病毒液ⅠF2代以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅠF3代。
实施例3
猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)在无血清培养系统中的增殖培养方法，所采用的DMEM购自Hyclone,批号为NZH1194；VP-SFM购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
(1)将实施例1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM的vero细胞长成单层后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3％的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液Ⅱ；然后置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,记录为病毒液ⅡF1代；
(2)将病毒液ⅡF1代再以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅱ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅡF2代；
(3)将病毒液ⅡF2代以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅱ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅡF3代。
实施例4
猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)在无血清培养系统中的增殖培养方法，所采用的DMEM购自Hyclone,批号为NZH1194；VP-SFM购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
(1)将实施例1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM的vero细胞长成单层后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3％的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液Ⅲ；然后置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,记录为病毒液ⅢF1代；
(2)将病毒液ⅢF1代再以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅲ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅢF2代；
(3)将病毒液ⅢF2代以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅲ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅢF3代。
实施例5
猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)在无血清培养系统中的增殖培养方法，所采用的DMEM购自Hyclone,批号为NZH1194；VP-SFM购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v。
(1)将实施例1所述的驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM的vero细胞长成单层后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3％的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液Ⅳ；然后置于37℃体积百分数为5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,记录为病毒液ⅣF1代；
(2)将病毒液ⅣF1代再以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅳ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅣF2代；
(3)将病毒液ⅣF2代以体积分数为1-3％的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液Ⅳ，置于37℃5％的CO2培养箱中培养，当70％以上单层细胞出现病变时，冻融2-3次收获病毒液,标记为病毒液ⅣF3代。
下面，通过观察并记录猪流行性腹泻病毒(PEDV毒)按照上述实施例2-5的PEDV毒在无血清培养系统中的增殖培养方法培养时，细胞产生的病变情况以及这些收获的病毒液的TCID50值，确定更适合猪流行性腹泻病毒在无血清系统中的培养方法。
其中，上述实施例2-5中所述维持液Ⅰ为无血清培养液，即含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液；所述维持液Ⅱ是由体积分数为20％的DMEM和体积分数为80％的无血清培养液组成的混合营养液；所述维持液Ⅲ是由含体积分数为50％的DMEM和体积分数为50％的无血清培养液组成的混合营养液；所述维持液Ⅳ是由体积分数为80％的DMEM和体积分数为20％的无血清培养液组成的混合营养液。配制维持液时，应该先将无血清培养液(即含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM)配制好后，再与DMEM液按照不同比例混合。
对比实施例
在实施例2-5无血清培养PEDV毒的增殖培养过程中，同时用未驯化的vero细胞传代培养PEDV毒。其中，细胞培养液为含体积百分数为8％的胎牛血清的DMEM液，病毒维持液为含体积百分数为2％的胎牛血清的DMEM液。接毒剂量：体积百分数为1-3％，待70％以上细胞出现病变时，冻融收获毒液。
下面，对实施例2-5和对比实施例中不同vero细胞及不同维持液培养PEDV毒的病变产生情况及毒价的影响比较，比较结果如表1。
其中，将实施例2-5和对比实施例中各个阶段中所收获毒液进行细胞感染滴度的测定。每个病毒液测毒价的方法如下：取9支高压灭菌的1.5ml规格EP管，每管加入0.9ml病毒稀释液，再在第1管中加入0.1ml的病毒液，用移液器将第1管中的液体吹打混匀后，取0.1ml加入第2管中，如此依次往后稀释，最终每管中病毒的稀释度为10-1—10-9；将各稀释度的病毒液加入长满vero细胞的96孔细胞板中，每个稀释度病毒液接种8孔，每孔接0.1ml，置37℃5％CO2环境下培养，逐日观察。根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50/ml。病毒稀释液为含有2％胎牛血清、100μg/ml卡那霉素的DMEM。
表1不同vero细胞及不同维持液培养PEDV毒的病变产生情况及毒价
其中，图3是实施例5中在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含80％DMEM的无血清培养液)；
图4是实施例4在经驯化后的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含50％DMEM的无血清培养液)；
图5是对比实施例在未经驯化的vero细胞中培养的PEDV毒产生的细胞病变图(维持液为含2％胎牛血清的DMEM液)；
图6是未接PEDV毒的经驯化的vero细胞形态对照图，该图中的细胞未发生病变。
结果显示，实施例1中驯化后的vero细胞在含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM系统中培养生长时，细胞密度可以达到3-5×105个/ml。经驯化后的vero细胞在无血清培养液中传代增殖培养50代时仍能保持良好的细胞形态。
实施例2-5中，在无血清系统中培养PEDV毒时，当维持液为100％的无血清培养液或含20％DMEM的无血清培养液时，vero细胞产生的细胞病变不易观察；而当维持液为含50％DMEM的无血清培养液或者含80％DMEM的无血清培养液时，vero细胞能产生明显的病变，表现为细胞肿胀、变圆及培养后期细胞的大量脱落(参见图3-4)。当病毒维持液为含80％DMEM的无血清培养液时，病毒含量达到107.0TCID50/ml以上，可达到107.33TCID50/ml，并且与正常含血清培养的PEDV毒的毒价相当，差别不明显。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将经适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法培养得到的vero细胞置于VP-SFM培养液中培养，待适应VP-SFM培养液的vero细胞长成单层细胞后，倾去VP-SFM培养液上清，以体积分数为1-3%的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液；然后置于37℃ 体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，每天观察单层细胞的病变情况；当70%以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，记录为病毒液F1代；
所述适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法为将冻存的vero细胞复苏后置于血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的方法驯化vero细胞;
具体驯化方法包括以下步骤：
1）将冻存的vero细胞复苏；
2）将复苏后的vero细胞置于血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后的vero细胞的体积比为1:3进行消化传代培养；
3）将步骤2）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅰ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后vero细胞的体积比为1:（2-3）进行消化传代培养；
4）将步骤3）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅱ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后的vero细胞的体积比为1:（2-3）进行消化传代培养；
5）将步骤4）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅲ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:（2-3）进行消化传代培养；
6）将步骤5）得到的vero细胞置于无血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:（2-3）进行消化传代培养，即得适用于无血清培养系统的vero细胞；
所述血清培养液为含体积百分数为8%的胎牛血清的DMEM培养液；所述无血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液；所述混合培养液Ⅰ是由体积百分数为80%的血清培养液和体积百分数为20% 的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅱ是由体积百分数为50%的血清培养液和体积百分数为50% 的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅲ是由体积百分数为20%的血清培养液和体积百分数为80% 的无血清培养液组成的混合培养液；
所述胎牛血清购自gibco公司，批号为1128144；所述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZH1194；所述VP-SFM培养液购自gibco公司，批号为1637720；所述L-谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v;
所述消化液Ⅰ为由质量百分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的EDTA的Hank′s液组成的 EDTA-胰酶消化液；所述消化液Ⅱ为TrypLE select,购自gibco公司，批号为1596842；
（2）将步骤（1）中的病毒液F1代再以体积分数为1-3%的剂量接入适应VP-SFM培养液的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，收获的病毒液标记为病毒液F2代；
（3）将步骤（2）中的病毒液F2代以体积分数为1-3%的剂量接入适应VP-SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，收获的病毒液标记为病毒液F3代；
所述维持液是由体积分数为80%的DMEM和体积分数为20%的无血清培养液组成的混合营养液；所述无血清培养液为含4mM的L-谷氨酰胺的VP-SFM培养液。
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