CN105950540A - 一种pk15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的pk15细胞及其应用 - Google Patents

一种pk15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的pk15细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种PK15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的PK15细胞及其应用；所述PK15细胞的低血清培养方法，包括：1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后消化传代；2)将细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中进行传代；3)将细胞以体积比1:2.5的比例进行传代至细胞铺满单层；4)将细胞以体积比1:3的比例进行传代至细胞铺满单层，得到适应低血清培养的PK15细胞；所述应用为通过PK15细胞进行TGEV华毒株的增殖培养，包括：准备PK15细胞；接入毒株；收集病毒液；本发明使TGEV华毒株能在低血清条件下连续至少传代培养5代，均能使PK15细胞产生明显病变。

Description

一种PK15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的PK15细胞及 其应用
技术领域
本发明涉及生物细胞技术领域，更具体地，涉及一种PK15细胞的低血清培养方法、通过该方法获得的PK15细胞及其应用。
背景技术
目前，在国内动物疫苗的大生产中，传代细胞的培养大多含有高浓度牛血清。因为牛血清是天然培养基，所以其来源有限，价格连年上涨，增加了疫苗生产的原材料成本；牛血清组分不明确、不稳定，批次间的差异影响了疫苗产品的稳定性；另外，血清供应链存在一定风险，有潜在的外源病原污染风险。因此，在疫苗生产中，牛血清的成本是最高的，血清的质量也是最为关键的。采用低血清系统培养动物细胞并进行病毒生产繁殖，既大幅度降低了疫苗生产成本，又减少了因血清短缺或质量问题带来的生产风险。用低血清培养传代细胞并进行疫苗生产是目前生物医药产业新技术的发展方向。
国内有关于PK15细胞的低血清培养驯化的研究报道，如专利申请号201510098627.X“低血清培养PK-15细胞生产猪圆环Ⅱ型DBN-SX07株病毒的方法”，该专利公开了一种利用逐步减血清的方法驯化PK15细胞，使其适应低血清培养，但是没有其在猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)培养繁殖中应用的说明。
而关于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)低血清培养的报道，如专利申请号201510098147.3“低血清培养ST细胞生产猪传染性胃肠炎华毒株病毒的方法”，但是没有用适应低血清系统的PK15细胞培养猪传染性胃肠炎病毒的报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种PK15细胞的低血清培养方法，该方法将PK15细胞驯化至适应低血清培养，大大降低了牛血清的使用量。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种PK15细胞的低血清培养方法，包括以下步骤：
1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后置于含8％牛血清的DMEM细胞培养液中使用消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用消化液对细胞进行消化传代，传代培养2～3代；
2)将经步骤1)处理的PK15细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用消化液进行消化传代至细胞铺满单层；
3)将经步骤2)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
4)将经步骤3)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:3的比例使用消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；得到适应低血清培养的PK15细胞。
作为优选，其中对PK15细胞的每一次消化传代过程中，所使用的消化液均为EDTA-胰酶消化液；所述EDTA-胰酶消化液为含有质量体积分数为0.25％的规格1：250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank's液；所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
作为优选，所述步骤4)中，重复消化传代并培养至细胞铺满单层的过程2～3次，得到适应低血清培养的PK15细胞。
本发明的第二个目的在于提供一种适应低血清培养的PK15细胞，该PK15细胞能适应低血清培养。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种适应低血清培养的PK15细胞，经过上述的方法得到。
作为优选，所述适应低血清培养的PK15细胞在低血清MD611细胞培养液中可以传代培养至少50代。
本发明的第三个目的在于提供一种适应低血清培养的PK15细胞的应用，将PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养，使TGEV华毒株能在低血清条件下连续至少传代培养5代，均能使PK15细胞产生明显病变，第3代、第4代和第5代毒的病毒含量均≧108.0TCID50/mL。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种适应低血清培养的PK15细胞的应用，将如上所述的PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养。
作为优选，所述的TGEV华毒株的增殖培养包括以下步骤：
Ⅰ)准备PK15细胞：将PK15细胞培养至铺满单层后，倾去培养液上清；
Ⅱ)接入毒株：以体积比为1％的接毒量将TGEV华毒株接入PK15细胞中，加入维持液；然后置于温度为37℃，5％CO2的培养箱中培养；
Ⅲ)收集病毒液：培养48～72h至PK15单层细胞中80％以上出现病变，反复冻融收获病毒液，获得经增殖培养的TGEV华毒株。
作为优选，步骤Ⅱ)中，所述维持液为含0.1～0.5％牛血清的MD611细胞培养液。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明将PK15细胞驯化至适应低血清培养，细胞培养液中只需含1～2％牛血清，大大降低了牛血清的使用量；
2、本发明提供的适应低血清培养的PK15细胞能在低血清培养系统中连续传代培养至少50代；
2、本发明将PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养，使TGEV华毒株能在含0.1～0.5％牛血清的细胞培养液中连续至少传代培养5代，均能使PK15细胞产生明显病变，第3代、第4代和第5代毒的病毒含量均≧108.0TCID50/mL；
3、本发明中病毒的接毒方式均为细胞单层接毒，不吸附直接加入维持液；既节省了病毒培养操作时间，也简化了病毒培养工序，同时降低了病毒培养过程中污染的风险。
附图说明
图1为实施例1PK15细胞在低血清培养液中培养至第5代的细胞形态图；
图2为实施例1PK15细胞在低血清培养液中培养至第20代的细胞形态图；
图3为实施例1PK15细胞在低血清培养液中培养至第50代的细胞形态图；
图4为实施例2PK15细胞产生细胞病变的形态图；
图5为实施例3PK15细胞产生细胞病变的形态图；
图6为实施例4PK15细胞产生细胞病变的形态图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
1、一种PK15细胞的低血清培养方法，包括以下步骤：
1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后置于含8％牛血清的DMEM细胞培养液中使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，传代培养2～3代；
2)将经步骤1)处理的PK15细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代至细胞铺满单层；
3)将经步骤2)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
4)将经步骤3)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
5)重复进行步骤4)2次；得到适应低血清培养的PK15细胞。
该PK15细胞在低血清MD611细胞培养液中可以传代培养至少50代。
所述进行消化传代的体积比为母代细胞与子代细胞的比例，即将1体积的母代细胞扩增为对应比例的子代细胞。
所述EDTA-胰酶消化液为含有质量体积分数为0.25％的规格1：250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank's液，所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
MD611细胞培养液是使用Merck MD系列干粉低血清培养基(货号：FC00041，原产品代码：MD611-050)制得，在使用前需要配成溶液。具体步骤如下：
a、按照质量体积比为12.48g/L称取适量MD611干粉培养基，配制1L细胞培养液；
b、在容器中加入900mL注射用水，水温20～30℃，搅拌溶解；
c、加入质量体积比为2.29g/L量的碳酸氢钠，完全溶解后，加注射用水至总溶液体积1L；
d、用0.22μm滤膜过滤除菌，溶液在2～8℃下密闭避光保存；
e、使用时，若有需要，用饱和氢氧化钠调溶液将pH调至7.2～7.4。
2、将通过上述方法得到的PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养，包括以下步骤：
Ⅰ)准备PK15细胞：将PK15细胞培养至铺满单层后，倾去培养液上清；
Ⅱ)接入毒株：以体积比为1％的接毒量将TGEV华毒株接入PK15细胞中，加入含0.1～0.5％牛血清的MD611细胞培养液；然后置于温度为37℃，5％CO2的培养箱中培养；
Ⅲ)收集病毒液：培养48～72h至PK15单层细胞中80％以上出现病变，反复冻融收获病毒液，获得经增殖培养的TGEV华毒株。
实施例1
一种PK15细胞的低血清培养方法，包括以下步骤：
1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后置于含8％牛血清的DMEM细胞培养液中使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，传代培养3代；
2)将经步骤1)处理的PK15细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代至细胞铺满单层；
3)将经步骤2)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
4)将经步骤3)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:3的比例使用EDTA-胰酶消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
5)重复进行步骤4)2次；得到适应低血清培养的PK15细胞。
将步骤5)得到的PK15细胞以体积比1:3～5在1～2％牛血清的Merck MD611细胞培养液中传代至50代，观察每一代的细胞形态；其中PK15细胞在低血清培养液中培养至第5代的细胞形态如图1所示；第20代的细胞形态如图2所示；第50代的细胞形态如图3所示；驯化后的PK15细胞在含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中生长时，细胞密度达到4.9～6.71×105个/mL；驯化后的PK15细胞在低血清MD611细胞培养液中至少可以传代培养50代。
实施例2
将通过实施例1得到的PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养，包括以下步骤：
Ⅰ)准备PK15细胞：将PK15细胞培养至铺满单层后，倾去培养液上清；
Ⅱ)接入毒株：以体积比为1％的接毒量将TGEV华毒株接入PK15细胞中，加入含0.5％牛血清的MD611细胞培养液；然后置于温度为37℃，5％CO2的培养箱中培养；
Ⅲ)收集病毒液：培养48～72h至PK15单层细胞中80％以上出现病变，反复冻融收获病毒液，将此病毒液作为第1代种毒aF1；
Ⅳ)重复步骤Ⅰ)～Ⅲ)将aF1接入新的PK15细胞并收集病毒液，得到第2代种毒aF2；
Ⅴ)不断重复步骤Ⅰ)～Ⅲ)将上一代的种毒驯化得到下一代的种毒；获得aF3～aF5：
测定种毒aF3、aF4、aF5的病毒含量值，使用含0.5％牛血清的MD611细胞培养液作为病毒稀释液，测毒价所用的细胞为病毒培养用PK15细胞，测量3次取平均值，病毒含量值如表1所示：
表1实施例2病毒含量值
代次 病毒含量值(TCID50/mL)
aF3 108.12
aF4 108.29
aF5 108.2
PK15细胞的病变细胞情况如图4所示，PK15细胞均能发生病变。
实施例3
本实施例的特点在于：步骤Ⅱ)中加入含0.3％牛血清的MD611细胞培养液；其余步骤和参数与实施例2相同。获得种毒bF1、bF2、bF3、bF4、bF5，测定bF3、bF4、bF5的病毒含量值，使用含0.3％牛血清的MD611细胞培养液作为病毒稀释液，测毒价所用的细胞为病毒培养用PK15细胞，测量3次取平均值，病毒含量值如表2所示：
表2实施例3病毒含量值
PK15细胞的病变细胞情况如图5所示，PK15细胞均能发生病变。
实施例4
本实施例的特点在于：步骤Ⅱ)中加入含0.1％牛血清的MD611细胞培养液；其余步骤和参数与实施例2相同。获得种毒cF1、cF2、cF3、cF4、cF5，测定cF3、cF4、cF5的病毒含量值，使用含0.1％牛血清的MD611细胞培养液作为病毒稀释液，测毒价所用的细胞为病毒培养用PK15细胞，测量3次取平均值，病毒含量值如表3所示：
表3实施例4病毒含量值
代次 病毒含量值(TCID50/mL)
cF3 108.2
cF4 108.12
cF5 108.23
PK15细胞的病变细胞情况如图6所示，PK15细胞均能发生病变。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种PK15细胞的低血清培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取贴壁培养的PK15细胞进行复苏，然后置于含8％牛血清的DMEM细胞培养液中使用消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用消化液对细胞进行消化传代，传代培养2～3代；
2)将经步骤1)处理的PK15细胞置于含3％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用消化液对细胞进行消化传代，培养至细胞铺满单层；然后以体积比1:3的比例使用消化液进行消化传代至细胞铺满单层；
3)将经步骤2)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:2.5的比例使用消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；
4)将经步骤3)处理的PK15细胞置于含1～2％牛血清的MD611细胞培养液中以体积比1:3的比例使用消化液进行消化传代，培养至细胞铺满单层；得到适应低血清培养的PK15细胞。
2.如权利要求1所述的PK15细胞的低血清培养方法，其特征在于：其中对PK15细胞的每一次消化传代过程中，所使用的消化液均为EDTA-胰酶消化液；所述EDTA-胰酶消化液为含有质量体积分数为0.25％的规格1：250的胰酶和0.02％的EDTA的Hank's液；所述的规格1：250的胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。
3.如权利要求1所述的PK15细胞的低血清培养方法，其特征在于：所述步骤4)中，重复消化传代并培养至细胞铺满单层的过程2～3次，得到适应低血清培养的PK15细胞。
4.一种适应低血清培养的PK15细胞，其特征在于：经过权利要求1-3任一的方法得到。
5.如权利要求4所述的适应低血清培养的PK15细胞，其特征在于：所述适应低血清培养的PK15细胞在低血清MD611细胞培养液中可以传代培养至少50代。
6.一种适应低血清培养的PK15细胞的应用，其特征在于：将如权利要求4所述的PK15细胞应用于TGEV华毒株的增殖培养。
7.如权利要求6所述的适应低血清培养的PK15细胞的应用，其特征在于：所述的TGEV华毒株的增殖培养包括以下步骤：
Ⅰ)准备PK15细胞：将PK15细胞培养至铺满单层后，倾去培养液上清；
Ⅱ)接入毒株：以体积比为1％的接毒量将TGEV华毒株接入PK15细胞中，加入维持液；然后置于温度为37℃，5％CO2的培养箱中培养；
Ⅲ)收集病毒液：培养48～72h至PK15单层细胞中80％以上出现病变，反复冻融收获病毒液，获得经增殖培养的TGEV华毒株。
8.如权利要求7所述的适应低血清培养的PK15细胞的应用，其特征在于：步骤Ⅱ)中，所述维持液为含0.1～0.5％牛血清的MD611细胞培养液。
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