CN107881132A - 一种能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用 - Google Patents

一种能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物固氮菌，其分类命名为Microbacterium trichothecenolyticum SPJ01，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2016254，保藏日期为2016年5月9日；所述的微生物固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑；所述的微生物固氮菌在沙漠地区作为固氮促生菌剂的应用。不但能缓解农作物在缺氮、缺磷胁迫下的生长受抑，而且对农作物幼苗生长有明显促进作用，使两种牧草的各项生长指标如株高、根长、单叶面积、单株叶片数、根体积、植株体积、地上鲜干重、地下鲜干重、植株鲜干重、根冠比(R/T)和干鲜重比(D/F)均显著提高。

Description

一种能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用
技术领域
本发明涉及一种能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
氮和磷作为植物必需的矿质元素，是植物活细胞内蛋白质、核酸、磷脂、酶、植物激素等多种结构和功能物质的重要组成成分，在植物能量代谢、有机物合成与代谢、物质运转、基因表达与调控及细胞信号转导等过程中起重要作用。氮素和磷素的缺乏、将使植物的生长发育受抑，引起一些缺素症，甚至于不能完成其生活史。长期大量施用化肥不但提高了农业生产成本，而且造成了土壤中某些元素的选择性积累和土壤理化性质的恶化，对环境造成污染。如何以微生物肥料替代或部分替代化肥是众多研究者共同关注的问题。我国微生物肥料的研究自1950年对根瘤菌进行研究开始，现已经鉴定和筛选出了大量具有优良固氮和溶磷性能的根瘤菌、联合固氮菌和溶磷菌]。根瘤菌共生固氮效率虽比联合固氮高，但具有高度的宿主专一性，限制了其在非宿主豆科牧草和非豆科牧草中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用范围广的能用于沙漠植物的固氮解磷促生菌及其菌剂与其应用，可以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案：
微生物固氮菌，其分类命名为Microbacterium trichothecenolyticum SPJ01，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016254，保藏日期为2016年5月9日，保藏地址为中国武汉。
所述的微生物固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。
所述的微生物固氮菌在沙漠地区作为固氮促生菌剂的应用。
该方法将微生物固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给作物提供氮素和磷素：将4℃下保存的微杆菌SPJ01活化2h后接一环于YMA液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成0.5份3水磷酸氢二钾，0.2份7水合硫酸镁、0.1份氯化钠、10份甘露醇 、1份酵母粉 、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成。
与现有技术比较，通过实验，申请人得出微杆菌SPJ01（Microbacteriumtrichothecenolyticum）不但能缓解农作物在缺氮、缺磷胁迫下的生长受抑，而且对农作物幼苗生长有明显促进作用，使两种牧草的各项生长指标如株高、根长、单叶面积、单株叶片数、根体积、植株体积、地上鲜干重、地下鲜干重、植株鲜干重、根冠比(R/T)和干鲜重比(D/F)均显著提高。
为验证本申请的优越性，申请人进行了实验验证，其部分实验验证过程如下：
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
微杆菌SPJ01(Microbacterium trichothecenolyticum)分离自沙生植物沙蓬的茎，由贵州师范学院喀斯特生境土壤与环境生物修复研究所促生菌剂课题组将从巴丹吉林沙漠腹地采集的新鲜沙蓬植株茎进行表面消毒和研磨，将研磨液涂布于Winogradskyi无氮培养基(母液制备：KH2PO4 50g，Na2MO4·2H2O 1g, MgSO4·7H2O 25g，MnSO4·4H2O 1g，NaCl25g，FeSO4·7H2O 1g，调整pH=7.0±0.2配制成母液常温保存。1L Winogradskyi无氮液体培养基取5ml母液加10g·L-1甘露醇溶液和0.1g·L-1 CaCO3，用2M H2SO4调pH=7.0后过滤（0.45um；Millpore），加无菌蒸馏水定容，121℃，30min灭菌。固体培养基再将溶液加热溶解后添加琼脂15g·L-1，121℃，30min灭菌后制成9cm琼脂平板)上，28待培养基上长出单菌落后，取生长最快，菌落直径最大的单菌落分离、保存并以划线分离法连续4次纯化菌种得到菌株SPJ01；将该菌种进行16S rRNA核酸序列测定，并在BLAST生物信息数据库上进行比对，确定该菌株分类命名为微杆菌属菌株（Microbacterium trichothecenolyticum）。该菌株在显微镜下为细长杆菌，单个或成对，革兰氏阳性，在Winogradskyi无氮培养基上1-2d内形成圆形无色半透明菌落并分泌大量多糖，在PKO溶无机磷培养基上可形成具有明显溶磷透明圈的白色或微黄色菌落，具有固氮和溶无机磷能力，可以葡萄糖、甘露醇和蔗糖为唯一碳源。菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其分类命名为Microbacteriumtrichothecenolyticum SPJ01，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016254，保藏日期为2016年5月9日，保藏地址为中国武汉。
1.1.2植物材料
甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa cv. Gannong No.5)和燕麦Calibre (Avena. Sativa. Calibre)种子由草业生态系统教育部重点实验室提供，种子用70%乙醇溶液浸泡5min，以消除种带根瘤菌和固氮菌对实验结果的影响，经无菌去离子水冲洗5-8遍后播种。
1.1.3菌悬液制备
将4℃下保存的微杆菌SPJ01活化2h后接一环于YMA液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
1.1.4营养液制备
Hoagland's完全营养液，构成元素：Ca(NO3)2·4H2O 1417mg/L；KNO3 607mg/L；MgSO4493mg/L；(NH4)3PO4 115mg/L；微量元素：H3BO3 2.86 mg/L；MnCl2·4H2O 1.81 mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L；CuSO4·5H2O 0.08 mg/L；H2MoO4·H2O 0.02 mg/L; FeSO4 50 mg/L。营养液以去离子水稀释至1/4浓度后用NaOH(1mol/L)或HCl(1mol/L)调节pH值为7.0±0.1。
Hoagland's无氮无磷营养液将Hoagland's完全营养液配方中的KNO3 607mg/L改为KCl 582 mg/L，并去除(NH4)3PO4后配制而成，调节pH值至7.0±0.1。
1.2试验设计
试验于2015年3月于贵州师范学院温室大棚内进行，栽培基质使用清洁河砂，经HCl浸泡48h后，用水冲洗6次，最后以去离子水冲洗3次，150℃烘干并干热灭菌6h备用。在直径7cm、容积400ml的塑料培养杯中装入280g干燥河沙，将沙面整平，用镊子挑选25粒大小一致的甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre的饱满种子均匀摆放于细沙表面，覆沙20g；在栽培用的砂基质中添加20g/kg的磷酸钙，以1/4 Hoagland's无氮无磷营养液浇灌。
本发明为甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre分别浇灌用微杆菌SPJ01制备的菌悬液（简称SPJ01）20ml；对不接菌液处理，仅以1/4 Hoagland's无氮无磷营养液浇灌的处理作为缺素对照CK1，以1/4Hoagland's完全营养液浇灌的处理作为完全营养对照CK2。每处理3次重复，处理过程中以称量法测定各盆栽水分含量，并以无菌水补充水分至沙基质最大持水量的70%。
菌剂制备方法：将Microbacterium trichothecenolyticum SPJ01菌株接种于Winogradskyi无氮固体培养基上活化18～48h，之后接种于Winogradskyi无氮液体培养基中，28℃下160r/min摇床培养至菌液665nm吸光度值≥0.6时，10000 r/min离心10min，以适量无菌水洗下菌体并摇匀打散至菌液665nm吸光度值≥1.0，将1L菌悬液接入400g干燥的无菌青秸秆粉或1000g泥炭粉(颗粒径均小于0.15mm)混合制备成固体菌剂。
1.3测定指标和方法
1.3.1活苗率
将各处理盆栽洗出苗后统计活苗数，计算活苗率。
1.3.2株高和主根长
各处理盆栽中随即选取4株幼苗测定株高和主根长度。将洗净植株平铺于在玻璃平板上，用直尺测出苗的自然高度，后再用镊子将植株根系拉直，测定主根长度。
1.3.3单株叶片数和单叶面积
各处理随机选取4株植株，记录其叶片数；单叶面积采用描形称重法。从待测植株上随机选取4枚叶片，在均质作图纸上用铅笔描绘出叶片轮廓，依该轮廓剪下，后置于电子天平上称重。然后再取1cm×1cm的均质纸称重，参照下列公式计算出单叶面积：
叶面积S1 = [W1(叶形均质纸重量) / W2(1cm2图纸重量) ]×1cm2
1.3.4植株单株体积与单株根体积
将所选苗清洗后在滤纸上吸干表面明水，以排水法测定植株体积。在量筒内装入10ml蒸馏水，在室温下将植株完全浸入量筒内，量筒内液面上升的值即为植株体积，单位cm3。测完体积的植株从量筒中取出，将根剪下，用滤纸将根系上的水吸干，用同样的方法测量根体积。
1.3.5植株单株、地上、地下鲜重和干重
将洗出的所选苗用滤纸将水吸干，在精度为1×10-5g的电子天平上分别称出植株单株鲜重、地上鲜重、地下鲜重。测完鲜重后的植株用纸袋包装，置于烘箱中，在80℃下48h烘至恒重，用电子天平称出植株单株干重、地上干重、地下干重。
1.4数据分析
以EXCL2003和DPS3.0专业统计分析软件进行数据的整理及分析。
2结果与分析
2.1 SPJ01对紫花苜蓿和燕麦幼苗存活率的影响
处理50d后，对植株幼苗存活率测定结果显示(表1)，甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗存活率由高到低均为： CK2＞SPJ01＞CK1。SPJ01使两种牧草活苗率比CK1高1.38 -1.67。
2.2 SPJ01对紫花苜蓿和燕麦幼苗株高的影响
如图1所示，甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗株高由高到低均为：SPJ01＞CK2＞CK1。甘农5号紫花苜蓿接种菌液与不接种菌液的3个处理之间，株高无显著差异。SPJ01使燕麦Calibre株高与CK1、CK2相比显著提高(P＜0.05)，分别增加49.08%、40.54%，得出固氮菌对燕麦株高生长有明显促进作用。
2.3 SPJ01对紫花苜蓿和燕麦幼苗根长的影响
如图2所示，根长是衡量植物根系生长发育状况的主要指标，根系增长可以使植物获得更多的水分和矿质营养，提高光合作用效率，最终提高产量。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗根长由高到低均为：SPJ01＞CK2＞CK1。SPJ01使甘农5号紫花苜蓿根长比CK1提高200.25%(P＜0.01)，比CK2提高49.44%(P＜0.05)；使燕麦Calibre根长比CK1提高76.51%(P＜0.05)，比CK2提高53.09%(P＜0.05)。
2.4 SPJ01对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株体积的影响
甘农5号紫花苜蓿和Calibre燕麦各处理幼苗植株体积和根体积由高到低均为：SPJ01＞CK2＞CK1。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre的SPJ01处理与CK1和CK2比较，植株体积和根体积均极显著提高(P＜0.01)，分别增加76.02%-241.93%和211.27%-757.19%。
2.5 SPJ01对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株鲜干重的影响
牧草各部分的生物量是衡量其生产性能高低的重要指标。本试验通过测定植株鲜重和植株干重，来比较SPJ01、CK2和CK1之间紫花苜蓿、燕麦生物量的差异。甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre各处理幼苗的这2个指标测定结果由高到低均为：SPJ01＞CK2＞CK1。
对于甘农5号紫花苜蓿， SPJ01使其植株鲜重和干重分别增加53.96%和50.95%；地上干重显著提高(P＜0.05)，增加42.75%。
对于燕麦Calibre， SPJ01与CK1、CK2比较，植株鲜和干重分别增加255.52%和259.90%、180.89%和200.93%。草业学报,2007,16 (3):38-42，《固氮菌对燕麦不同生育期促生作用的研究》中描述到“接种固氮菌可以使燕麦地上植物量增加21. 45 %-43. 55 %，地下植物量增加51. 85 %-130. 86 %，总植物量增加2. 00 %-45. 36 %”本申请试验数据的结果更为明显。分析其原因这是因为沙培模拟的沙漠环境中，栽培基质吸附和缓冲氮磷素营养的能力较低，氮、磷缺乏的试验条件较土壤栽培更为明显所致。
通过上述试验结果，可以得出，除活苗率外，其余生长指标SPJ01菌液处理均高于或显著高于(P＜0.05)或极显著高于(P＜0.01)对照CK1和CK2。菌液处理的幼苗生长优于CK1，表明SPJ01能够为紫花苜蓿和燕麦的生长提供一定量的氮素和磷素，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。SPJ01除了可以为植物生长提供氮和磷外，还通过其它机制来促进紫花苜蓿和燕麦幼苗生长。对植物根际促生菌(PGPR)的研究认为，根瘤菌、联合固氮菌和溶磷菌除固氮和溶磷作用外，还能产生植物激素(如IAA、GA、CTK、ABA和乙烯等)、维生素、核酸和水杨酸(SA)等多种生理活性物质来调节植物生长，同时通过抑病作用和提高植物抗逆性来间接促进植物生长。
SPJ01使紫花苜蓿和燕麦的根系增长，根体积增加，根冠比提高，促进了植物苗期良好根系的建成，增强了植物对营养物质和水的吸收能力，提高了植物生长潜势，使作物在成熟期获得高产成为可能。此外，SPJ01还使紫花苜蓿和燕麦的干鲜重比增加，即植物体内水分占牧草总重的百分比下降，积累了更多干物质，使牧草生产性能提高。且 SPJ01对甘农5号紫花苜蓿和燕麦Calibre地下部分的促生作用优于地上部分。
附图说明
图1 SPJ0对紫花苜蓿和燕麦幼苗株高的影响。
图2 SPJ0对紫花苜蓿和燕麦幼苗根长的影响。
图3 SPJ0对紫花苜蓿和燕麦幼苗植株体积的影响。
图4 SPJ0对紫花苜蓿和燕麦幼苗单株干重的影响。
图5 SPJ0对紫花苜蓿和燕麦幼苗单株湿重的影响。
本申请保藏的微生物其分类命名为Microbacterium trichothecenolyticumSPJ01，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016254，保藏日期为2016年5月9日，保藏地址为中国武汉
具体实施方式
实施例1，微生物固氮菌，其分类命名为Microbacterium trichothecenolyticumSPJ01，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016254，保藏日期为2016年5月9日，保藏地址为中国武汉。所述的微生物固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。
微生物固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给作物提供氮素和磷素：将4℃下保存的微杆菌SPJ01活化2h后接一环于YMA液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成0.5份3水磷酸氢二钾，0.2份7水合硫酸镁、0.1份氯化钠、10份甘露醇 、1份酵母粉 、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成。

Claims (5)

1.一种微生物固氮菌，其分类命名为微杆菌SPJ01（Microbacterium trichothecenolyticum），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M2016254，保藏日期为2016年5月9日。
2.根据权利要求1所述的微生物固氮菌在土壤中对作物提供氮素和磷素的应用，缓解由于氮磷缺乏导致的生长受抑。
3.根据权利要求1所述的微生物固氮菌在沙漠地区作为固氮促生菌剂的应用。
4. 利用权利要求2或3所述的应用：其特征在于：该方法将微生物固氮菌按如下方法制备成菌剂用于给作物提供氮素和速效磷素：将4℃下保存的微杆菌SPJ01活化2h后接一环于YMA液体培养基中，28℃下120r/min摇床培养，至菌液665nm吸光度值≥0.8时，10000 r/min离心10min，以无菌水洗下菌体并摇匀打散，制成OD665nm值为0.5的菌悬液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所用的YEM液体培养基由下述质量份的原料混合而成0.5份3水磷酸氢二钾，0.2份7水合硫酸镁 、0.1份氯化钠 、10份甘露醇 、1份酵母粉 、1000份蒸馏水，调节pH 值为7±0.2，121℃湿热灭菌26min制成。
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